论文部分内容阅读
摘要：从辽东湾沿岸受石油污染的沉积物中筛选得到一株石油降解菌株BHB—16，对该菌进行了形态以及16SrDNA系统发育分析，初步确定该菌株为Lutibacterium菌属。应用沸石和珊瑚石作为载体进行该菌株的固定化研究，确定当沸石作为载体时，固定化的最佳条件为：菌株接种量为0.6 mL，培养时间28 h，载体投加量为10 mL；选用珊瑚石为载体时，固定化的最佳条件为：菌株接种量为0.6 mL，培养时间29 h，载体投加量为12 mL；此外，用沸石和珊瑚石固定后的菌株，其对于柴油的降解率相对于游离菌分别提高了14.4%和29.6%，初步选用珊瑚石作为载体进行菌株的固定化使其具有更好的石油降解能力。
关键词：石油降解菌；固定化；沸石；珊瑚石
海洋石油的开采，石油加工产品的生产、使用以及排放，海上溢油污染事故等，使得石油已然成为海洋环境的主要污染物质之一。每年通过各种渠道泄入海洋的石油和石油产品，约占全世界石油总产量的0.5 %，倾注到海洋的石油量达200万～1000万t。2010—2012年先后发生的墨西哥湾钻井平台漏油事故、大连新港储油码头输油管道爆炸事故以及蓬莱19—3油田溢油污染事故给海洋生态环境造成了灾难性的损害，同时也对沿海地区的经济造成巨大的损失，因此，近年来，海洋石油污染的有效修复成为了时下的热点研究问题。
生物修复技术具有成本低、无二次污染、处理效果好等优点，因而现今被广泛应用于海洋污染修复过程中。该技术主要依赖于自然界中微生物对污染物的生物代谢作用，而由于自然环境的复杂性以及不同石油污染对象的特异性，使得直接投加外源高效降解菌在自然环境下的石油污染修复中往往难以达到预期效果。固定化技术是对完整的微生物细胞进行固定，可以避免人为破坏生物酶的活性和生化反应的稳定性，提高单位体积载体中微生物细胞密度，固定化后的微生物能够长期保持活性，使其在具备抵抗外界复杂环境中能力，稳定地发挥高效能，将微生物固定化技术应用于石油污染的生物治理有着极大的应用潜力和发展前景。
本研究以辽东湾地区受污染的环境中分离得到一株对石油烃具有降解能力的菌株BHB—16，对其进行16s rDNA菌种鉴定，并选取沸石和珊瑚石作为吸附载体进行菌株的固定化研究，考察固定化菌对石油烃的降解能力，为辽东湾区域海洋石油污染的生物修复提供基础数据和参考。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌种来源 从辽东湾附近的受污染沉积物中分离并筛选获得。
1.1.2试剂和培养基 菌株筛选分离培养基：添加0.2%0#柴油的2216E琼脂培养基，其中2216E琼脂培养基购置于青岛高科园海博生物技术有限公司。
石油降解菌富集培养基：2216E液体培养基，购置于青岛高科园海博生物技术有限公司。
沸石和珊瑚石载体购置于大连汇新钛设备开发有限公司。
1.2实验方法
1.2.1石油降解菌的筛选 取10 g沉积物样品，加入装有100 mL灭菌后的海水和0.2%（v：v）的0#柴油的三角瓶中，28℃、150 r/rain摇床震荡培养20 d，期间补充0#柴油二次，0#柴油加入量同样为0.2%。将驯化后的沉积物样品经充分分散后作梯度稀释，在筛选分离培养基上进行均匀涂布，28℃培养5 d，挑取单菌落，在2216E琼脂培养基中划线，分离纯化，得到单一菌株。
1.2.2石油降解菌16S rDNA扩增及系统发育分析应用TAKARA MiniBEST Bacterial GenomicDNA Extraction Kit Ver.3.0对筛选到的石油降解菌BHB—16进行基因组DNA提取。PCR扩增采用细菌16S rDNA通用引物，引物序列为27F：5’一AGAGTTTGATCCTGCK；TCAG—3’和1492R：5’一GTTACCTTGTTACGACTT—3。PCR反应体系为50μL体系，包括25μL Premix ExTaq Ver-sion2.0（TAKARA），DNA模板2μL，正反向引物各1μL（10μM），加双蒸水补至50μL。PCR扩增条件为：95℃预变性5 min；95℃、30 s，57℃、40 s，72℃、1.5 min，35个循环；72℃延伸8 min，4℃保持。PCR扩增产物应用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。
将16S rRNA扩增产物送至上海生物工程有限公司进行测序，测序结果应用BLAST与NCBI—nr数据库进行比对，得到相似度最高的菌属。通过ClstualX进行多序列比对，应用MEGA 5.0采用N—J法构建系统发育树，置信度检测自举数为1000。
1.2.3菌株生长曲线和湿重的测定 将菌株BHB—16接种于富集培养基中，该菌液与28℃、150 r/min摇床中振荡培养30 h，每2 h取培养基中菌液2 mL，应用751分光光度计测定其OD600 nm处吸光度，根据吸光度值和取样时间绘制菌株生长曲线。
菌株接种和培养条件与测定生长曲线的条件相同，分别在培养4、8、12、16 h时，从培养基中取菌液2 mL，应用（分光光度计型号）测定其OD600 nm处吸光度，另取20 mL菌液，10 000 r/min离心5 min，PBS缓冲溶液清洗两次，倒掉上清液，测定剩余菌体重量，应用菌体重量和吸光度绘制菌株的OD600-湿重曲线，从而利用菌液600 nm处的吸光度来计算菌液中菌体的湿量。
1.2.4固定化载体预处理 将载体用清水冲洗数次，直至将载体上附着的悬浮颗粒物清洗干净，清洗后的载体自然风干。利用排水法测定单位质量载体的体积。
1.2.5石油降解菌固定化条件优化 将预处理后的固定化载体加入装有60 mL富集培养基的锥形瓶中，于120℃下灭菌30 min，再接种柴油降解菌株BHB—16，分别考察菌体接种量、培养时间和载体投加量对于菌体固定化的影响。菌体固定化效果用载体固定的柴油降解菌湿重来表示。为了便于表述，后续将固定化后的和游离的石油降解菌简称为固定化菌和游离菌。 1.2.6石油降解率的测定 含有300 mg/L 0#柴油的灭菌海水为培养基，接种最优条件下固定化菌，与28℃、80 r/min摇床中振荡降解7 d。以同样条件的游离菌作为阳性对照，以不接种任何降解菌作为阴性对照，每个样品设置3个平行。柴油降解率的测定采用紫外分光光度法，λ=225 nm。
2结果与讨论
2.1菌株的形态学分析
从辽东湾区域受污染的沉积物中驯化筛选分离得到一株能利用柴油为唯一碳源生长的菌株BHB—16，该菌株菌落呈白色，扁平，表面光滑不透明，边缘整齐，杆状，菌株形态照片如图1所示。
2.2菌株16S rDNA的系统发育分析
对降解菌株BHB—16的16s rDNA基因片段进行PCR扩增，最终获得长度约为1.5 kb的基因序列，将测序结果与GenBank数据库中的已知序列进行Blastn比对分析发现，该菌株与Lutibacterium sp.BG—4a（KM404163.1）的序列相似性高达99%。根据结果进行菌株BHB—16的系统发育分析如图2所示。
2.3菌株BHB—16生长曲线和湿重的测定
测定菌株生长不同时间下的浓度值，结果如图3所示。由图3可见，菌株BHB—16在富集培养基中的生长延滞期为8 h左右，培养8 h后，菌体进入对数生长期，在16 h时已达到对数生长期的后期，20 h达到生长高峰，此后进入生长稳定期。因此，将菌株的培养时间选为16 h。
菌株BHB—16于不同生长阶段的OD600nm吸光度值及菌体湿重的测定结果如图4所示，由图可知，该菌株于600 nm处的吸光度值与菌体的湿重具有显著的正相关关系，因此，可以通过菌液的吸光度值来计算其中菌体的湿重。从而能够采用相同条件下，加入固定化载体培养基和未加入载体培养基中菌液吸光度的变化计算载体固定菌体的重量。
2.4菌株接种量、培养时间和载体投加量对菌株固定化效果的影响
分别向含有10 mL两种不同载体的60 mL富集培养基中，分别接种0.4、0.6、0.8 mL对数生长后期的石油降解菌BHB—16，在28℃、80 r/min摇床中振荡培养32 h，测定菌株固定化效果，结果见图5。
由图5可见，菌株的接种量并不是越多越好，当接种量少于0.6 mL时，载体对于菌株有较好的固定化效果，而接种量高于0.6 mL时，载体对于菌株的固定化效果出现明显的下降。原因可能是由于游离态的菌体过多，从而消耗了大量的营养物质，导致载体孔隙中菌株生长所需的营养物质不足，从而导致固定化比例的下降。由此确定菌株固定化中菌株的最适接种量为0.6 mL。
分别向对载体量为10 mL、菌株接种量为0.6 mL的60 mL富集培养基在28℃、80 r/min的摇床中进行连续培养，分别在培养时间为22、24、26、27、28、29、30和31 h时测定其菌株固定化效果，结果如图6所示。
由图6可见，该两种固定化载体对于菌株的固定化效率随时间的变化规律均为先增高后降低。当培养时间低于28 h时，随着培养时间的延长，载体对菌株的固定化效率也随之增加；而当培养时间超过30 h后，载体对菌株的固定化效果出现明显的下降。出现这种现象可能与菌株本身的生长曲线具有一定的相关性。当培养时间超过30 h后，菌株的生长进人衰亡期，大量的菌体死亡，导致载体表面固定化的菌株大面积脱落，从而降低了载体的固定化效果。由此确定28 h为珊瑚石载体柴油降解菌固定化的最佳培养时间，29h为沸石载体柴油降解菌固定化的最佳培养时间。
分别加入4、6、8、10、12、14、16 mL的不同载体于富集培养基，之后接人菌种O.6 mL，于28℃、80 r/min摇床中培养28 h后，测定菌株固定化的效果，结果如图7所示。
由图7可见，对于珊瑚石和沸石两种载体，其载体投加量对于菌株的固定化效率的影响，均是随载体量增加均呈现先增高后降低的变化规律。在沸石投加量为10 mL、珊瑚石投加量为12 mL时，载体中含菌量最多。因此，对于石油降解菌株B HB—16的固定化考察，沸石的最适投加量为10 mL，而珊瑚石的最适投加量为12 mL。
2.5 BHB—16固定化对其石油降解性能的影响
应用实验获得的沸石和珊瑚石作为载体对于菌株的最佳固定化条件，对菌株BHB—16进行固定化，在含100 mg/L柴油的60 mL无菌海水中分别加入10 mL固定化菌和等量的游离菌，以不加菌的海水作为对照，将菌株于28℃、80 r/min摇床振荡培养7 d，分析它们对0#柴油的降解效果，结果如表1所示。
从表中可以看出，使用珊瑚石作为载体的实验组中，游离菌对柴油的降解率为52.5%，而固定化菌对柴油的降解率为82.2%，降解效率提高了29.7%。使用沸石作为载体的实验组中，游离菌对柴油的降解率为33.9%，而固定化菌对柴油的降解率为48.3%，降解效率提高了14.4%。
两种不同载体固定化实验组中游离菌对柴油的降解效率相差18.6%，原因可能是由于相比于沸石，珊瑚石对于菌株的固定率更高。同样体积的沸石和珊瑚石，珊瑚石固定菌株的重量是沸石的2～3倍。而相比于沸石而言，将珊瑚石作为载体固定菌株后，可有效提高菌体对柴油的降解效率，此外，珊瑚石在沿海区域中较为常见，环境友好性更强，因此选用珊瑚石作为载体对石油降解菌BHB—16进行固定化，并应用于沿海区域石油污染的修复，会产生更好的效果，同时对环境产生的影响更小。
3结论
从辽东湾受污染沉积物中分离筛选出一株石油降解菌，结合形态分析以及16S rDNA鉴定结果进行系统发育分析，确定该菌株属于Lutibac-terium菌属。
使用沸石作为载体对柴油降解菌BHB—16进行固定化效果考察，确定最适的固定化条件为菌体接种量0.6 mL，培养时间29 h，载体投加量10 mL。
使用珊瑚石作为载体对柴油降解菌BHB—16进行固定化，最适的固定化条件为菌体接种量0.6 mL，培养时间28 h，载体投加量12 mL。
相比于沸石，珊瑚石最为固定化的载体，具有更好的环境适应性，同时珊瑚石对于柴油降解菌BHB—16的固定化效果更好，对于菌株柴油降解能力的提升更为明显。
关键词：石油降解菌；固定化；沸石；珊瑚石
海洋石油的开采，石油加工产品的生产、使用以及排放，海上溢油污染事故等，使得石油已然成为海洋环境的主要污染物质之一。每年通过各种渠道泄入海洋的石油和石油产品，约占全世界石油总产量的0.5 %，倾注到海洋的石油量达200万～1000万t。2010—2012年先后发生的墨西哥湾钻井平台漏油事故、大连新港储油码头输油管道爆炸事故以及蓬莱19—3油田溢油污染事故给海洋生态环境造成了灾难性的损害，同时也对沿海地区的经济造成巨大的损失，因此，近年来，海洋石油污染的有效修复成为了时下的热点研究问题。
生物修复技术具有成本低、无二次污染、处理效果好等优点，因而现今被广泛应用于海洋污染修复过程中。该技术主要依赖于自然界中微生物对污染物的生物代谢作用，而由于自然环境的复杂性以及不同石油污染对象的特异性，使得直接投加外源高效降解菌在自然环境下的石油污染修复中往往难以达到预期效果。固定化技术是对完整的微生物细胞进行固定，可以避免人为破坏生物酶的活性和生化反应的稳定性，提高单位体积载体中微生物细胞密度，固定化后的微生物能够长期保持活性，使其在具备抵抗外界复杂环境中能力，稳定地发挥高效能，将微生物固定化技术应用于石油污染的生物治理有着极大的应用潜力和发展前景。
本研究以辽东湾地区受污染的环境中分离得到一株对石油烃具有降解能力的菌株BHB—16，对其进行16s rDNA菌种鉴定，并选取沸石和珊瑚石作为吸附载体进行菌株的固定化研究，考察固定化菌对石油烃的降解能力，为辽东湾区域海洋石油污染的生物修复提供基础数据和参考。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌种来源 从辽东湾附近的受污染沉积物中分离并筛选获得。
1.1.2试剂和培养基 菌株筛选分离培养基：添加0.2%0#柴油的2216E琼脂培养基，其中2216E琼脂培养基购置于青岛高科园海博生物技术有限公司。
石油降解菌富集培养基：2216E液体培养基，购置于青岛高科园海博生物技术有限公司。
沸石和珊瑚石载体购置于大连汇新钛设备开发有限公司。
1.2实验方法
1.2.1石油降解菌的筛选 取10 g沉积物样品，加入装有100 mL灭菌后的海水和0.2%（v：v）的0#柴油的三角瓶中，28℃、150 r/rain摇床震荡培养20 d，期间补充0#柴油二次，0#柴油加入量同样为0.2%。将驯化后的沉积物样品经充分分散后作梯度稀释，在筛选分离培养基上进行均匀涂布，28℃培养5 d，挑取单菌落，在2216E琼脂培养基中划线，分离纯化，得到单一菌株。
1.2.2石油降解菌16S rDNA扩增及系统发育分析应用TAKARA MiniBEST Bacterial GenomicDNA Extraction Kit Ver.3.0对筛选到的石油降解菌BHB—16进行基因组DNA提取。PCR扩增采用细菌16S rDNA通用引物，引物序列为27F：5’一AGAGTTTGATCCTGCK；TCAG—3’和1492R：5’一GTTACCTTGTTACGACTT—3。PCR反应体系为50μL体系，包括25μL Premix ExTaq Ver-sion2.0（TAKARA），DNA模板2μL，正反向引物各1μL（10μM），加双蒸水补至50μL。PCR扩增条件为：95℃预变性5 min；95℃、30 s，57℃、40 s，72℃、1.5 min，35个循环；72℃延伸8 min，4℃保持。PCR扩增产物应用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。
将16S rRNA扩增产物送至上海生物工程有限公司进行测序，测序结果应用BLAST与NCBI—nr数据库进行比对，得到相似度最高的菌属。通过ClstualX进行多序列比对，应用MEGA 5.0采用N—J法构建系统发育树，置信度检测自举数为1000。
1.2.3菌株生长曲线和湿重的测定 将菌株BHB—16接种于富集培养基中，该菌液与28℃、150 r/min摇床中振荡培养30 h，每2 h取培养基中菌液2 mL，应用751分光光度计测定其OD600 nm处吸光度，根据吸光度值和取样时间绘制菌株生长曲线。
菌株接种和培养条件与测定生长曲线的条件相同，分别在培养4、8、12、16 h时，从培养基中取菌液2 mL，应用（分光光度计型号）测定其OD600 nm处吸光度，另取20 mL菌液，10 000 r/min离心5 min，PBS缓冲溶液清洗两次，倒掉上清液，测定剩余菌体重量，应用菌体重量和吸光度绘制菌株的OD600-湿重曲线，从而利用菌液600 nm处的吸光度来计算菌液中菌体的湿量。
1.2.4固定化载体预处理 将载体用清水冲洗数次，直至将载体上附着的悬浮颗粒物清洗干净，清洗后的载体自然风干。利用排水法测定单位质量载体的体积。
1.2.5石油降解菌固定化条件优化 将预处理后的固定化载体加入装有60 mL富集培养基的锥形瓶中，于120℃下灭菌30 min，再接种柴油降解菌株BHB—16，分别考察菌体接种量、培养时间和载体投加量对于菌体固定化的影响。菌体固定化效果用载体固定的柴油降解菌湿重来表示。为了便于表述，后续将固定化后的和游离的石油降解菌简称为固定化菌和游离菌。 1.2.6石油降解率的测定 含有300 mg/L 0#柴油的灭菌海水为培养基，接种最优条件下固定化菌，与28℃、80 r/min摇床中振荡降解7 d。以同样条件的游离菌作为阳性对照，以不接种任何降解菌作为阴性对照，每个样品设置3个平行。柴油降解率的测定采用紫外分光光度法，λ=225 nm。
2结果与讨论
2.1菌株的形态学分析
从辽东湾区域受污染的沉积物中驯化筛选分离得到一株能利用柴油为唯一碳源生长的菌株BHB—16，该菌株菌落呈白色，扁平，表面光滑不透明，边缘整齐，杆状，菌株形态照片如图1所示。
2.2菌株16S rDNA的系统发育分析
对降解菌株BHB—16的16s rDNA基因片段进行PCR扩增，最终获得长度约为1.5 kb的基因序列，将测序结果与GenBank数据库中的已知序列进行Blastn比对分析发现，该菌株与Lutibacterium sp.BG—4a（KM404163.1）的序列相似性高达99%。根据结果进行菌株BHB—16的系统发育分析如图2所示。
2.3菌株BHB—16生长曲线和湿重的测定
测定菌株生长不同时间下的浓度值，结果如图3所示。由图3可见，菌株BHB—16在富集培养基中的生长延滞期为8 h左右，培养8 h后，菌体进入对数生长期，在16 h时已达到对数生长期的后期，20 h达到生长高峰，此后进入生长稳定期。因此，将菌株的培养时间选为16 h。
菌株BHB—16于不同生长阶段的OD600nm吸光度值及菌体湿重的测定结果如图4所示，由图可知，该菌株于600 nm处的吸光度值与菌体的湿重具有显著的正相关关系，因此，可以通过菌液的吸光度值来计算其中菌体的湿重。从而能够采用相同条件下，加入固定化载体培养基和未加入载体培养基中菌液吸光度的变化计算载体固定菌体的重量。
2.4菌株接种量、培养时间和载体投加量对菌株固定化效果的影响
分别向含有10 mL两种不同载体的60 mL富集培养基中，分别接种0.4、0.6、0.8 mL对数生长后期的石油降解菌BHB—16，在28℃、80 r/min摇床中振荡培养32 h，测定菌株固定化效果，结果见图5。
由图5可见，菌株的接种量并不是越多越好，当接种量少于0.6 mL时，载体对于菌株有较好的固定化效果，而接种量高于0.6 mL时，载体对于菌株的固定化效果出现明显的下降。原因可能是由于游离态的菌体过多，从而消耗了大量的营养物质，导致载体孔隙中菌株生长所需的营养物质不足，从而导致固定化比例的下降。由此确定菌株固定化中菌株的最适接种量为0.6 mL。
分别向对载体量为10 mL、菌株接种量为0.6 mL的60 mL富集培养基在28℃、80 r/min的摇床中进行连续培养，分别在培养时间为22、24、26、27、28、29、30和31 h时测定其菌株固定化效果，结果如图6所示。
由图6可见，该两种固定化载体对于菌株的固定化效率随时间的变化规律均为先增高后降低。当培养时间低于28 h时，随着培养时间的延长，载体对菌株的固定化效率也随之增加；而当培养时间超过30 h后，载体对菌株的固定化效果出现明显的下降。出现这种现象可能与菌株本身的生长曲线具有一定的相关性。当培养时间超过30 h后，菌株的生长进人衰亡期，大量的菌体死亡，导致载体表面固定化的菌株大面积脱落，从而降低了载体的固定化效果。由此确定28 h为珊瑚石载体柴油降解菌固定化的最佳培养时间，29h为沸石载体柴油降解菌固定化的最佳培养时间。
分别加入4、6、8、10、12、14、16 mL的不同载体于富集培养基，之后接人菌种O.6 mL，于28℃、80 r/min摇床中培养28 h后，测定菌株固定化的效果，结果如图7所示。
由图7可见，对于珊瑚石和沸石两种载体，其载体投加量对于菌株的固定化效率的影响，均是随载体量增加均呈现先增高后降低的变化规律。在沸石投加量为10 mL、珊瑚石投加量为12 mL时，载体中含菌量最多。因此，对于石油降解菌株B HB—16的固定化考察，沸石的最适投加量为10 mL，而珊瑚石的最适投加量为12 mL。
2.5 BHB—16固定化对其石油降解性能的影响
应用实验获得的沸石和珊瑚石作为载体对于菌株的最佳固定化条件，对菌株BHB—16进行固定化，在含100 mg/L柴油的60 mL无菌海水中分别加入10 mL固定化菌和等量的游离菌，以不加菌的海水作为对照，将菌株于28℃、80 r/min摇床振荡培养7 d，分析它们对0#柴油的降解效果，结果如表1所示。
从表中可以看出，使用珊瑚石作为载体的实验组中，游离菌对柴油的降解率为52.5%，而固定化菌对柴油的降解率为82.2%，降解效率提高了29.7%。使用沸石作为载体的实验组中，游离菌对柴油的降解率为33.9%，而固定化菌对柴油的降解率为48.3%，降解效率提高了14.4%。
两种不同载体固定化实验组中游离菌对柴油的降解效率相差18.6%，原因可能是由于相比于沸石，珊瑚石对于菌株的固定率更高。同样体积的沸石和珊瑚石，珊瑚石固定菌株的重量是沸石的2～3倍。而相比于沸石而言，将珊瑚石作为载体固定菌株后，可有效提高菌体对柴油的降解效率，此外，珊瑚石在沿海区域中较为常见，环境友好性更强，因此选用珊瑚石作为载体对石油降解菌BHB—16进行固定化，并应用于沿海区域石油污染的修复，会产生更好的效果，同时对环境产生的影响更小。
3结论
从辽东湾受污染沉积物中分离筛选出一株石油降解菌，结合形态分析以及16S rDNA鉴定结果进行系统发育分析，确定该菌株属于Lutibac-terium菌属。
使用沸石作为载体对柴油降解菌BHB—16进行固定化效果考察，确定最适的固定化条件为菌体接种量0.6 mL，培养时间29 h，载体投加量10 mL。
使用珊瑚石作为载体对柴油降解菌BHB—16进行固定化，最适的固定化条件为菌体接种量0.6 mL，培养时间28 h，载体投加量12 mL。
相比于沸石，珊瑚石最为固定化的载体，具有更好的环境适应性，同时珊瑚石对于柴油降解菌BHB—16的固定化效果更好，对于菌株柴油降解能力的提升更为明显。