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摘要 目的：本研究基于网络药理学和分子对接方法探讨四逆散治疗功能性消化不良的作用机制。方法：利用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）搜索四逆散中中药的活性成分与作用靶点，利用GeenCard、OMIM数据库搜索功能性消化不良的疾病靶点，利用R语言取得药物与疾病的共同靶点，通过Cytoscape3.7.2构建药物-疾病靶点网络，利用STRING平台构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络图，通过DAVID进行基因本体（GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析。通过Autodock Tools 1.5.6对核心靶点和核心成分进行对接验证。结果：共筛选出四逆散活性成分144个，有效作用靶点223个，药物疾病共同靶点152个。PPI网络发现AKT1、IL-6、MARK、JUN、STAT3等可能是四逆散治疗功能性消化不良的关键靶点。GO功能富集发现了795个GO条目，KEGG通路富集分析共筛选出作用通路127条，主要富集基因数量较大的通路有PI3K-AKT信号通路、MAPK信号通路、TNF信号通路等。分子对接验证显示核心靶点和核心成分有较强的结合活性。结论：四逆散中的有效成分主要通过AKT1、IL-6、MARK、JUN、STAT3等靶点调节多条信号通路从而发挥治疗功能性消化不良的作用。
关键词 四逆散;功能性消化不良;网络药理学;作用机制;分子对接
Abstract Objective：To explore the mechanism of Sini powder in the treatment of functional dyspepsia based on network pharmacology and molecular docking method.Methods：The effective components and corresponding target proteins of Sini Powder were screened by TCMSP，and the target of functional dyspepsia were screened by the GeenCards and OMIM data base.R software was used to obtain the common targets of drugs and diseases，and the “component-target-disease”network diagram was constructed by Cytoscape3.7.2 software.The STRING datebase was used to draw the protein interaction（PPI）network，and the DAVID was used to perform GO function and KEGG pathway enrichment analysis on effective targets.AutodockTools1.5.6 was used for docking verification of core targets and core components.Results：The result showed that 144 components were screened and 233 effective targets were screened.The 152 common targets were obtained.The PPI network found that AKT1，IL-6，MARK，JUN，STAT3，etc.may be the key targets for Sini Powder in treatment of functional dyspepsia.The GO function analysis found 795 items.The KEGG parhway analysis found 127 items，including enriched pathways with a large number of genes PI3K-Akt signaling pathway，MAPK signaling pathway，TNF signaling pathway and other pathways.The molecular docking shows that the core target and the core components have strong binding activity.Conclusion：The active components in Sini Powder mainly regulate multiple signaling pathways through targets such as AKT1，IL-6，MARK，JUN and STAT3，thus playing a role in the treatment of functional dyspepsia.
Keywords Sini powder; Functional dyspepsia; Network pharmacology; Mechanism of action; Molecular docking
中圖分类号：R289.4;R574文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.10.002
功能性消化不良是最常见的胃肠道疾病之一，流行病学调查显示，亚洲国家功能性消化不良发病率高达8%～23%[1]。该病的发病率逐年升高，发病机制尚未完全阐明，目前现代医学治疗大多应用促胃肠动力药、抑酸剂、胃黏膜保护剂、消化酶、抗抑郁药等[2]。但上述药物缺乏广泛疗效，长期应用会产生不良反应，在治疗过程中患者自我用药及应用非处方药物是非常常见的，也因此带来一定的直接和间接成本。 功能性消化不良在中医学中属于“胃痞”“胃痛”的范畴，其病机认识围绕肝、脾二脏。随着精神心理因素在功能性胃肠病发病机制中的重要性以及功能性胃肠病与精神心理疾患并发的现状被逐渐认识，这与中医理论中肝气的疏泄功能调控脾脏的运化功能的认识不谋而合。四逆散出自张仲景《伤寒论·辨少阴病脉证并治》，原方由柴胡、枳实、芍药、甘草4味药物组成，方中柴胡-枳实协同，疏肝理气，柴胡-芍药2药，兼顾肝脏体用，甘草调和诸药，4药合用，治疗少阴枢机不利，阳气不得宣达的四肢逆冷证。现代医家在古方古义上进行发展，常用四逆散来治疗肝脾不和的脾胃疾患，且已有临床研究证实了其治疗功能性消化不良的有效性[3]。本研究采用网络药理学方法，探讨其治疗功能性消化不良的作用机制，为进一步研究奠定基础。
1 资料与方法
1.1 四逆散活性成分及作用靶点的筛选 通过对中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）检索柴胡、枳实、白芍、甘草的有效成分，以口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18作为筛选条件，并利用此平台得到相关有效成分的蛋白作用靶点。筛选结束后，在Uniprot蛋白质数据库将化合物作用的蛋白质名称进行规范，剔除重复的蛋白作用靶点及没有作用靶点的活性成分，在Cytoscape3.7.2软件中建立“中药成分-作用靶点”关系图。
1.2 功能性消化不良相关靶点的筛选 通过对GeneCards数据库、OMIM数据库进行检索关键词“functional dyspepsia”，得到功能性消化不良的相关靶点。
1.3 药物-疾病靶点蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建 利用R软件取得药物与疾病靶点交集，用韦恩图的形式展现。将筛选得到的共同作用靶点上传至String在线平台数据库，构建PPI网络模型，将生物物种设定为“Homo sapiens”，最小互相作用阈值设定为>0.7，其余设置均为默认设置，得到PPI网络，并通过CytoScape3.7.2软件进行加工。运用CytoScape3.7.2内置工具分析PPI网络拓扑参数，包括连接度（Degree）、介度（Betweenness）及紧密度（Closeness），并根据网络拓扑学参数判断核心靶点。
1.4 功能富集分析与通路分析 将筛选得到共同靶点上传至DAVID数据库，将物种设置为“Homo sapiens”，进行GO功能分析和KEGG通路分析，以P<0.05进行富集通路筛选，并进一步筛选与功能性消化不良相关的内容，探讨四逆散治疗功能性消化不良可能的生物学过程及信号通路。
1.5 四逆散成分-核心靶点-通路网络图的构建
运用CytoScape3.7.2构建“四逆散成分-核心靶点-通路”网络图，内置工具分析药物成分的网络拓扑参数，包括连接度（Degree）、介度（Betweenness）及紧密度（Closeness），并根据网络拓扑学参数判断核心成分。
1.6 核心成分-靶點分子对接验证
根据拓扑学参数获得核心药物成分，从TCMSP数据库下载化合物结构，使用AutodockTools1.5.6在PMV中打开配体小分子，并加氢、加电荷、检测配体的root、进行可旋转键的搜寻与定义，并保存为pdbqt文件。将关键靶点蛋白的三维结构从RCSB Protein Data Bank（www.rcsb.org）下载得到，在AutodockTools 1.5.6 PMV中打开通过添加所有的氢原子、计算Gasteiger电荷、合并非极性氢后，将其定义为受体并保存成pdbqt文件。根据配体的位置，最终确定Vina分子对接的坐标和盒子大小，为了增加计算的准确度，将参数Exhaustiveness设置为20。除了特别说明，其他参数均采用默认值。采用Autodock vina 1.1.2进行半柔性对接，选取对接结合能量最低的构象用于对接结合模式分析，并使用Pymol进行作图。
2 结果
2.1 四逆散的有效成分
从TCMSP数据库以OB≥30%，DL≥0.18为筛选条件，共获得144个化学成分，其中柴胡17个，枳实22个，白芍13个，甘草92个。获得上述化学成分的有效靶点223个，将药物成分-有效靶点数据集导入CytoScape3.7.2，得到中药成分-作用靶点网络图。见图1。
2.2 功能性消化不良靶点的筛选
分别通过GeenCards数据库、OMIM数据库获得功能性消化不良相关靶点2 336个和23个，筛重后共获得靶点2 358个。
2.3 PPI网络构建及可视化分析
利用R软件将四逆散的活性成分对应的223个药物靶点与功能性消化不良的2 358个疾病靶点取交集，通过韦恩图的形式得到152个共同靶点。见图2。将152个共同靶点上传至STRING在线数据库平台，得到PPI网络，将该网络通过Cytoscape3.7.2软件进行可视化。见图3。图中152个节点为关键蛋白靶点，1 252条线条代表蛋白间的相互作用，图中节点的大小与Degree值正相关，度值越大，节点越大;边的粗细与Combined-score有关，分值越高，边越粗。
对PPI网络图进行拓扑分析，网络节点的介度、紧密度和连接度的中位数分别为53.046 184 54、0.440 476 19、13，以≥1倍介度和紧密度的中位数及≥2倍连接度的中位数为筛选条件，得到核心靶点30个，分别为AKT1、IL6、MAPK8、MAPK1、JUN、VEGFA、STAT3、EGF、EGFR、MYC、MAPK3、CXCL8、IL1B、CASP3、CCND1、MMP9、PTGS2、RELA、MAPK14、FOS、CCL2、ESR1、ICAM1、IL10、STAT1、APP、MMP2、HMOX1、AR、IL2，认为这些核心作用靶点相互作用紧密，在网络中起到关键作用，拓扑分析具体见表1。 2.4 四逆散治疗功能性消化不良的GO功能和KEGG通路的富集分析
通过David数据库对上述获得的152个生物靶点进行生物过程富集分析，研究四逆散治疗功能性消化不良的可能作用机制。
2.4.1 GO功能富集分析
通过GO分析，四逆散治疗功能性消化不良共得到了795个富集条目（P<0.05），其中生物过程（BP）、细胞成分（CC）、分子功能（MF）各为615个、65个、115个，每类按富集程度排序最高的15条。见图4。
2.4.2 KEGG通路富集分析 通过KEGG通路富集分析，以P<0.05为条件共筛选出作用通路127条，主要富集基因数量较大的通路见表2。
2.5 四逆散成分-核心靶点-通路网络图的构建
构建四逆散成分-核心靶点-通路网络图。通过分析网络，药物成分中MOL000422（山柰酚）連接度为48，介度为0.068 003 06，紧密度为0.526 490 07，预测山柰酚为四逆散治疗功能性消化不良的主要成分，其次为MOL000098（槲皮素）（连接度为30，介度为0.016 291 06，紧密度为0.478 915 66）、MOL000006（木犀草素）（连接度为18，介度为0.054 284 63，紧密度为0.506 369 43）和MOL004328（柚皮素）（连接度为14，介度为0.011 099 56，紧密度为0.473 214 29）。其中山柰酚为柴胡、白芍和甘草共有成分，槲皮素为柴胡和甘草共有成分，木犀草素为枳实成分，柚皮素为枳实和甘草共有成分，揭示了中药复方多成分协同作用的特点。见图5。
2.6 分子对接结果 将度值排名前4的化合物和排名前6的靶点蛋白进行分子对接，结果显示结合能（Affinity）均为负值，说明受体与配体可以自发结合，且均小于-5 kcal/mol，提示有较强的结合活性，分子对接结果见图6。根据结果可知结合能力最强的是MAPK8和山柰酚，利用PyMOL制作其模式图。见图7。分析表明山柰酚和MAPK8共形成3个氢键（图中为黄色）。
3 讨论
中医学异病同治的本质为辨证论治，将经方四逆散用于治疗功能性消化不良，属于根据经方的内在方义进行延伸以适应现代。现代社会节奏加快，患者多由情志失调或脾胃虚弱而致功能性消化不良。中医理论中的情志失调导致肝气郁滞，肝木乘脾或忧思多虑伤脾，可类比于现代医学中应激后的系列反应。应激发生后，由于环境因素变化而引起心理变化，进而脑肠互动异常，脑肠肽分泌紊乱，产生痞满等功能性消化不良相关症状，这是现代医学和中医学理论对功能性消化不良病机解释的不同，但肝脾不和与脑肠轴理论有相通之处[4]。
现代医学认为本病发病机制与胃肠道运动障碍、内脏高敏、胃酸、Hp感染、精神心理因素、脑肠肽等相关[5]。对于胃肠道动力障碍的机制的认识，主要集中在胃肠激素的调节机制障碍以及胃肠道运动的电起搏细胞-Cajal间质细胞（Interstitial Cells of Cajal，ICC）异常2方面。另外，近期研究认为十二指肠微炎症与本病关系密切，尤其是十二指肠炎症细胞浸润、局部炎症介质水平升高及屏障功能-紧密连接蛋白受损等[6-7]。本研究基于中药君臣佐使共同作用的特点，初步研究四逆散治疗功能性消化不良的生物学过程，以揭示其作用机制。
本研究显示，四逆散与功能性消化不良相关的作用靶点152个。从“药物成分-核心靶点-通路”网络图来看，连接靶点较多的化合物有山柰酚（Kaempferol）、槲皮素（Quercetin）、木犀草素（Luteolin）、柚皮素（Naringenin）和川陈皮素（Nobiletin）等。据报道，槲皮素能促进功能性便秘大鼠的胃肠动力[8]，也被实验证实了具有双相调节胃肠平滑肌的作用[9]。柚皮素在何娟[10]的实验中被证实，是功能性消化不良患者口服四逆散汤剂后吸收入血液的成分，且具有促进正常大鼠胃肠动力的作用。木犀草素可以抑制模型鼠神经元的氧化应激损伤，具有抗抑郁作用[11]。川陈皮素是促进胃肠动力的活性物质[12]。
四逆散治疗功能性消化不良的关键靶点为AKT1、IL6、MARK8、MARK1、JUN、STAT3等。AKT1是苏氨酸蛋白激酶家族的成员，是位于PI3K-AKT信号通路中的重要调节分子，位于其上游的PI3K能够在受到体内细胞因子和内环境各种理化因素的刺激后被激活，产生肌醇，肌醇作为第二信使，调控磷酸化的AKT进而调控下游相关因子，调节许多细胞周期过程，包括新陈代谢、增殖、成活、生长等。位于其下游的eNOS是NO的调节酶，NO作为信号通路末端及其重要的信使分子，具有抑制胃肠道肌肉收缩和抑制胃肠蠕动的作用[13-14]。功能性消化不良大鼠胃窦NO水平明显增高[15-16]。另有研究发现，NO不仅是重要的胃肠道抑制性递质，还是维持ICC成活的因子之一，神经源性的NO有助于ICC的成活和增殖[17-18]。
IL-6是细胞免疫因子，局部免疫因子的释放可刺激位于胃肠黏膜中的神经元，其高表达可通过级联反应，激活或扩大炎症反应，影响肾上腺应激反应以及胃肠蠕动，导致胃肠功能紊乱[19-20]。FD患者血清IL-6水平明显升高，IL-6与抑郁的发生相关，IL-6与抑郁症有明显剂量-反应关系，而抑郁是功能性消化不良的危险因素，IL-6水平或与患者功能性消化不良反复发作相关[21-22]。
MARK是丝裂原活化蛋白激酶，可以使肌动蛋白细肌丝相关蛋白磷酸化，引起肌丝滑行，最终平滑肌收缩[23]。此外，MARK-ERK信号转导通路，可激活下游靶基因c-fos。c-fos是公认的伤害性刺激神经元激活的标志物，当表达c-fos的神经元增加时，可促进痛觉敏感的形成，使痛阈降低[24]，导致功能性胃肠病内脏高敏感性的发生[25]，进而引起胃痛、胃胀等症状。同时MARK通路可激活下游的核因子κB，导致十二指肠微炎症的发生[26]。 JUN也是MARK信号转导通路的下游效应因子，是信号从细胞表明转导到细胞核内部的重要传递者，活化的JUN可和多基因启动子上的激活蛋白结合，使c-jun磷酸化，增强其转录活性并促进c-jun、c-fos的表达，此二者与疼痛、抑郁等有密切关系[27]。
STAT3是信号转导与转录激活因子，对神经肽阳性神经元的能量表达非常重要，研究指出下丘脑中STAT3下调，可调节胃肠激素从而增强胃肠运动[28-29]。
GO功能富集分析结果中，生物过程主要有药物反应、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控，细胞成分主要有细胞外隙、细胞溶质，分子功能主要有酶结合和蛋白质结合等。在靶点基因的KEGG富集分析中，可以发现PI3K-AKT信号通路、TNF信号通路、MAPK信号通路和Toll样受体信号富集程度较高，与功能性消化不良关系密切。其中，PI3K-AKT信号通路和MAPK信号通路与上述分析中的关键靶点相吻合，证实上述靶点蛋白通过此信号通路发挥作用。PI3K-AKT-eNOS信号通路介导了胃肠激素NO的分泌，并进一步影响ICC的增殖与成活，从多方面调控胃肠动力。MARK信号通路是调控炎症、疼痛、抑郁等的经典信号通路，可通过多种机制参与功能性胃肠病内脏痛敏的形成与发展[30]。TNF信号通路也被证实参与功能性消化不良的发生，研究表明四逆散可以通过降低肿瘤坏死因子（Tumor Nucrosis Factor，TNF），改善功能性消化不良大鼠紧密连接完整性，减轻十二指肠轻度炎症[6]。Toll样受体信号通路是经典炎症通路，在机体应激条件下，通路中受体异常激活，使下游核因子κB等信号分子激活，炎性细胞和炎症介质的释放增加产生多种炎症反应。
利用Autodock软件对4个药物成分及6个靶点进行分子对接，提示筛选出的药物成分和靶点结合性较高，验证了运用网络药理学方法对四逆散治疗功能性消化不良进行探讨结果的可靠性。
综上所述，本研究发现四逆散中山柰酚、槲皮素、木犀草素等成分直接作用于AKT1、IL6、MAPK8、MAPK1、JUN、STAT3等相关靶点起作用，并通过PI3K-AKT、MARK和TNF等信号通路，改善胃肠动力、降低内脏高敏感性、调节免疫反应减轻炎症及缓解抑郁等负面情绪，抑制功能性消化不良的病理发展机制，体现了中药复方君臣佐使，多靶点协作的调节作用，为其药效物质基础的进一步研究提供了理论基础。同时结果中大量炎症反应相关通路揭示了十二指肠微炎症可能在功能性消化不良发病机制中非常重要，是未来治疗功能性消化不良研究的一大方向。本研究仅从理论及网络预测的角度进行分析，具体的作用机制仍有待进一步的实验验证。
参考文献
[1]Ghoshal UC，Singh R，Chang FY，et al.Epidemiology of uninvestigated and functional dyspepsia in Asia：facts and fiction[J].J Neurogastroenterol Motil，2011，17（3）：235-244.
[2]李军祥，陈誩，李岩.功能性消化不良中西医结合诊疗共识意见（2017年）[J].中国中西医结合消化杂志，2017，25（12）：889-894.
[3]田军.功能性消化不良经方研究进展[J].内蒙古中医药，2019，38（12）：165-166.
[4]汪龙德，杜晓娟，刘俊宏，等.基于脑肠互动探讨疏肝健脾法治疗功能性消化不良的研究思路[J].中医研究，2019，32（4）：1-3.
[5]罗欣，王玉珍.功能性消化不良发病机制研究进展[J].世界最新医学信息文摘，2019，19（76）：91-92，107.
[6]Chang X，Zhao L，Wang J，et al.Sini-san improves duodenal tight junction integrity in a rat model of functional dyspepsia[J].BMC Complement Altern Med，2017，17（1）：432.
[7]Walker MM，Potter MD，Talley NJ.Tangible pathologies in functional dyspepsia[J].Best Pract Res Clin Gastroenterol，2019，40（41）：101650.
[8]Kim JE，Lee MR，Park JJ，et al.Quercetin promotes gastrointestinal motility and mucin secretion in loperamide-induced constipation of SD rats through regulation of the mAChRs downstream signal[J].Pharm Biol，2018，56（1）：309-317.
[9]van der Woude H，Gliszczyńska-Swigo A，Struijs K，et al.Biphasic modulation of cell proliferation by quercetin at concentrations physiologically relevant in humans[J].Cancer Lett，2003，200（1）：41-47.
[10]何娟.四逆散促胃腸动力成分的药物动力学研究[D].长沙：中南大学，2013.
[11]刘毅，蓝诺，刘莉，等.木犀草素对慢性不可预知性温和应激所致小鼠抑郁的改善作用[J].时珍国医国药，2013，24（6）：1382-1384. [12]宋玉鹏，陈海芳，胡源祥，等.陈皮及其主要活性成分对脾虚模型大鼠血清胃泌素、血浆乙酰胆碱、P物质、胃动素和血管活性肠肽的影响[J].中药药理与临床，2017，33（3）：79-83.
[13]Ma P，Gu B，Xiong W，et al.Glimepiride promotes osteogenic differentiation in rat osteoblasts via the PI3K/Akt/eNOS pathway in a high glucose microenvironment[J].PLoS One，2014，9（11）：e112243.
[14]Matsumoto Y，Ito M，Tsuge M，et al.Ecabet sodium induces neuronal nitric oxide synthase-derived nitric oxide synthesis and gastric adaptive relaxation in the human stomach[J].J Gastroenterol，2009，44（11）：1118-1124.
[15]刘英超，钟继红，孙静.莪术对功能性消化不良大鼠胃窦神经介质NO及AchE的影响[J].中国中医药科技，2014，21（1）：37-38，47.
[16]伍早安，李国成，胡道松.肝胃不和型功能性消化不良大鼠幽门括约肌乙酰胆碱酯酶及一氧化氮合酶的表达[J].中国中西医结合消化杂志，2004，12（1）：8-10.
[17]Iwasaki H，Kajimura M，Osawa S，et al.A deficiency of gastric interstitial cells of Cajal accompanied by decreased expression of neuronal nitric oxide synthase and substance P in patients with type 2 diabetes mellitus[J].J Gastroenterol，2006，41（11）：1076-1087.
[18]Choi KM，Gibbons SJ，Roeder JL，et al.Regulation of interstitial cells of Cajal in the mouse gastric body by neuronal nitric oxide[J].Neurogastroenterol Motil，2007，19（7）：585-595.
[19]夏菁，孙涛.罗马Ⅲ诊断标准的制定与功能性胃肠疾病的研究进展[J].海军总医院学报，2011，24（3）：166-168.
[20]赵波.炎症性肠病患者IL-6、sICAM-1及chemerin改变及与自主神经功能相关性研究[J].胃肠病学和肝病学杂志，2017，26（5）：555-558.
[21]李春儒.功能性消化不良患者血清白介素-6水平与焦虑、抑郁的相关性[J].临床医学工程，2019，26（4）：531-532.
[22]黄更珍，贺国斌，周晓晴，等.功能性消化不良患者血浆脑肠肽及白介素6与精神心理因素关系的研究[J].中国临床新医学，2017，10（2）：127-130.
[23]谢燕东.PKC及MAPK信号转导途径在针刺足三里穴调节大鼠胃运动中的作用研究[D].西安：第四军医大学，2012.
[24]Traub RJ，Stitt S，Gebhart GF.Attenuation of c-Fos expression in the rat lumbosacral spinal cord by morphine or tramadol following noxious colorectal distention[J].Brain Res，1995，701（1-2）：175-82.
[25]肖兴会.基于MAPK-ERK信号通路研究痛泻要方及其拆方缓解IBS-D内脏高敏性的作用机制[D].成都：成都中医药大学，2017.
[26]常雄飞，赵鲁卿，贾梦迪，等.健脾理气方对功能性消化不良模型大鼠十二指肠TLR9/NF-κB/iNOS通路的影响[J].北京中医药，2018，37（7）：606-609.
[27]代维，张明洁，邱恩超，等.cAMP反应元件结合蛋白在头痛与抑郁中的研究现状[J].中国疼痛医学杂志，2017，23（12）：923-926.
[28]He Y，Yang C，Wang P，et al.Child compound Endothelium corneum attenuates gastrointestinal dysmotility through regulating the homeostasis of brain-gut-microbiota axis in functional dyspepsia rats[J].J Ethnopharmacol，2019，240：111953.
[29]王郁金，周永学，谢培，等硝菔通结方对功能性便秘大鼠排便及胃肠动力的影响[J].中国实验方剂学杂志，2014，20（17）：146-149.
[30]付晨瑜，高珊杉，李春雨，等.電针对功能性胃肠病大鼠内脏敏感性影响机制研究[J].辽宁中医药大学学报，2020，22（7）：32-36.
（2020-08-01收稿 责任编辑：杨觉雄）
关键词 四逆散;功能性消化不良;网络药理学;作用机制;分子对接
Abstract Objective：To explore the mechanism of Sini powder in the treatment of functional dyspepsia based on network pharmacology and molecular docking method.Methods：The effective components and corresponding target proteins of Sini Powder were screened by TCMSP，and the target of functional dyspepsia were screened by the GeenCards and OMIM data base.R software was used to obtain the common targets of drugs and diseases，and the “component-target-disease”network diagram was constructed by Cytoscape3.7.2 software.The STRING datebase was used to draw the protein interaction（PPI）network，and the DAVID was used to perform GO function and KEGG pathway enrichment analysis on effective targets.AutodockTools1.5.6 was used for docking verification of core targets and core components.Results：The result showed that 144 components were screened and 233 effective targets were screened.The 152 common targets were obtained.The PPI network found that AKT1，IL-6，MARK，JUN，STAT3，etc.may be the key targets for Sini Powder in treatment of functional dyspepsia.The GO function analysis found 795 items.The KEGG parhway analysis found 127 items，including enriched pathways with a large number of genes PI3K-Akt signaling pathway，MAPK signaling pathway，TNF signaling pathway and other pathways.The molecular docking shows that the core target and the core components have strong binding activity.Conclusion：The active components in Sini Powder mainly regulate multiple signaling pathways through targets such as AKT1，IL-6，MARK，JUN and STAT3，thus playing a role in the treatment of functional dyspepsia.
Keywords Sini powder; Functional dyspepsia; Network pharmacology; Mechanism of action; Molecular docking
中圖分类号：R289.4;R574文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.10.002
功能性消化不良是最常见的胃肠道疾病之一，流行病学调查显示，亚洲国家功能性消化不良发病率高达8%～23%[1]。该病的发病率逐年升高，发病机制尚未完全阐明，目前现代医学治疗大多应用促胃肠动力药、抑酸剂、胃黏膜保护剂、消化酶、抗抑郁药等[2]。但上述药物缺乏广泛疗效，长期应用会产生不良反应，在治疗过程中患者自我用药及应用非处方药物是非常常见的，也因此带来一定的直接和间接成本。 功能性消化不良在中医学中属于“胃痞”“胃痛”的范畴，其病机认识围绕肝、脾二脏。随着精神心理因素在功能性胃肠病发病机制中的重要性以及功能性胃肠病与精神心理疾患并发的现状被逐渐认识，这与中医理论中肝气的疏泄功能调控脾脏的运化功能的认识不谋而合。四逆散出自张仲景《伤寒论·辨少阴病脉证并治》，原方由柴胡、枳实、芍药、甘草4味药物组成，方中柴胡-枳实协同，疏肝理气，柴胡-芍药2药，兼顾肝脏体用，甘草调和诸药，4药合用，治疗少阴枢机不利，阳气不得宣达的四肢逆冷证。现代医家在古方古义上进行发展，常用四逆散来治疗肝脾不和的脾胃疾患，且已有临床研究证实了其治疗功能性消化不良的有效性[3]。本研究采用网络药理学方法，探讨其治疗功能性消化不良的作用机制，为进一步研究奠定基础。
1 资料与方法
1.1 四逆散活性成分及作用靶点的筛选 通过对中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）检索柴胡、枳实、白芍、甘草的有效成分，以口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18作为筛选条件，并利用此平台得到相关有效成分的蛋白作用靶点。筛选结束后，在Uniprot蛋白质数据库将化合物作用的蛋白质名称进行规范，剔除重复的蛋白作用靶点及没有作用靶点的活性成分，在Cytoscape3.7.2软件中建立“中药成分-作用靶点”关系图。
1.2 功能性消化不良相关靶点的筛选 通过对GeneCards数据库、OMIM数据库进行检索关键词“functional dyspepsia”，得到功能性消化不良的相关靶点。
1.3 药物-疾病靶点蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建 利用R软件取得药物与疾病靶点交集，用韦恩图的形式展现。将筛选得到的共同作用靶点上传至String在线平台数据库，构建PPI网络模型，将生物物种设定为“Homo sapiens”，最小互相作用阈值设定为>0.7，其余设置均为默认设置，得到PPI网络，并通过CytoScape3.7.2软件进行加工。运用CytoScape3.7.2内置工具分析PPI网络拓扑参数，包括连接度（Degree）、介度（Betweenness）及紧密度（Closeness），并根据网络拓扑学参数判断核心靶点。
1.4 功能富集分析与通路分析 将筛选得到共同靶点上传至DAVID数据库，将物种设置为“Homo sapiens”，进行GO功能分析和KEGG通路分析，以P<0.05进行富集通路筛选，并进一步筛选与功能性消化不良相关的内容，探讨四逆散治疗功能性消化不良可能的生物学过程及信号通路。
1.5 四逆散成分-核心靶点-通路网络图的构建
运用CytoScape3.7.2构建“四逆散成分-核心靶点-通路”网络图，内置工具分析药物成分的网络拓扑参数，包括连接度（Degree）、介度（Betweenness）及紧密度（Closeness），并根据网络拓扑学参数判断核心成分。
1.6 核心成分-靶點分子对接验证
根据拓扑学参数获得核心药物成分，从TCMSP数据库下载化合物结构，使用AutodockTools1.5.6在PMV中打开配体小分子，并加氢、加电荷、检测配体的root、进行可旋转键的搜寻与定义，并保存为pdbqt文件。将关键靶点蛋白的三维结构从RCSB Protein Data Bank（www.rcsb.org）下载得到，在AutodockTools 1.5.6 PMV中打开通过添加所有的氢原子、计算Gasteiger电荷、合并非极性氢后，将其定义为受体并保存成pdbqt文件。根据配体的位置，最终确定Vina分子对接的坐标和盒子大小，为了增加计算的准确度，将参数Exhaustiveness设置为20。除了特别说明，其他参数均采用默认值。采用Autodock vina 1.1.2进行半柔性对接，选取对接结合能量最低的构象用于对接结合模式分析，并使用Pymol进行作图。
2 结果
2.1 四逆散的有效成分
从TCMSP数据库以OB≥30%，DL≥0.18为筛选条件，共获得144个化学成分，其中柴胡17个，枳实22个，白芍13个，甘草92个。获得上述化学成分的有效靶点223个，将药物成分-有效靶点数据集导入CytoScape3.7.2，得到中药成分-作用靶点网络图。见图1。
2.2 功能性消化不良靶点的筛选
分别通过GeenCards数据库、OMIM数据库获得功能性消化不良相关靶点2 336个和23个，筛重后共获得靶点2 358个。
2.3 PPI网络构建及可视化分析
利用R软件将四逆散的活性成分对应的223个药物靶点与功能性消化不良的2 358个疾病靶点取交集，通过韦恩图的形式得到152个共同靶点。见图2。将152个共同靶点上传至STRING在线数据库平台，得到PPI网络，将该网络通过Cytoscape3.7.2软件进行可视化。见图3。图中152个节点为关键蛋白靶点，1 252条线条代表蛋白间的相互作用，图中节点的大小与Degree值正相关，度值越大，节点越大;边的粗细与Combined-score有关，分值越高，边越粗。
对PPI网络图进行拓扑分析，网络节点的介度、紧密度和连接度的中位数分别为53.046 184 54、0.440 476 19、13，以≥1倍介度和紧密度的中位数及≥2倍连接度的中位数为筛选条件，得到核心靶点30个，分别为AKT1、IL6、MAPK8、MAPK1、JUN、VEGFA、STAT3、EGF、EGFR、MYC、MAPK3、CXCL8、IL1B、CASP3、CCND1、MMP9、PTGS2、RELA、MAPK14、FOS、CCL2、ESR1、ICAM1、IL10、STAT1、APP、MMP2、HMOX1、AR、IL2，认为这些核心作用靶点相互作用紧密，在网络中起到关键作用，拓扑分析具体见表1。 2.4 四逆散治疗功能性消化不良的GO功能和KEGG通路的富集分析
通过David数据库对上述获得的152个生物靶点进行生物过程富集分析，研究四逆散治疗功能性消化不良的可能作用机制。
2.4.1 GO功能富集分析
通过GO分析，四逆散治疗功能性消化不良共得到了795个富集条目（P<0.05），其中生物过程（BP）、细胞成分（CC）、分子功能（MF）各为615个、65个、115个，每类按富集程度排序最高的15条。见图4。
2.4.2 KEGG通路富集分析 通过KEGG通路富集分析，以P<0.05为条件共筛选出作用通路127条，主要富集基因数量较大的通路见表2。
2.5 四逆散成分-核心靶点-通路网络图的构建
构建四逆散成分-核心靶点-通路网络图。通过分析网络，药物成分中MOL000422（山柰酚）連接度为48，介度为0.068 003 06，紧密度为0.526 490 07，预测山柰酚为四逆散治疗功能性消化不良的主要成分，其次为MOL000098（槲皮素）（连接度为30，介度为0.016 291 06，紧密度为0.478 915 66）、MOL000006（木犀草素）（连接度为18，介度为0.054 284 63，紧密度为0.506 369 43）和MOL004328（柚皮素）（连接度为14，介度为0.011 099 56，紧密度为0.473 214 29）。其中山柰酚为柴胡、白芍和甘草共有成分，槲皮素为柴胡和甘草共有成分，木犀草素为枳实成分，柚皮素为枳实和甘草共有成分，揭示了中药复方多成分协同作用的特点。见图5。
2.6 分子对接结果 将度值排名前4的化合物和排名前6的靶点蛋白进行分子对接，结果显示结合能（Affinity）均为负值，说明受体与配体可以自发结合，且均小于-5 kcal/mol，提示有较强的结合活性，分子对接结果见图6。根据结果可知结合能力最强的是MAPK8和山柰酚，利用PyMOL制作其模式图。见图7。分析表明山柰酚和MAPK8共形成3个氢键（图中为黄色）。
3 讨论
中医学异病同治的本质为辨证论治，将经方四逆散用于治疗功能性消化不良，属于根据经方的内在方义进行延伸以适应现代。现代社会节奏加快，患者多由情志失调或脾胃虚弱而致功能性消化不良。中医理论中的情志失调导致肝气郁滞，肝木乘脾或忧思多虑伤脾，可类比于现代医学中应激后的系列反应。应激发生后，由于环境因素变化而引起心理变化，进而脑肠互动异常，脑肠肽分泌紊乱，产生痞满等功能性消化不良相关症状，这是现代医学和中医学理论对功能性消化不良病机解释的不同，但肝脾不和与脑肠轴理论有相通之处[4]。
现代医学认为本病发病机制与胃肠道运动障碍、内脏高敏、胃酸、Hp感染、精神心理因素、脑肠肽等相关[5]。对于胃肠道动力障碍的机制的认识，主要集中在胃肠激素的调节机制障碍以及胃肠道运动的电起搏细胞-Cajal间质细胞（Interstitial Cells of Cajal，ICC）异常2方面。另外，近期研究认为十二指肠微炎症与本病关系密切，尤其是十二指肠炎症细胞浸润、局部炎症介质水平升高及屏障功能-紧密连接蛋白受损等[6-7]。本研究基于中药君臣佐使共同作用的特点，初步研究四逆散治疗功能性消化不良的生物学过程，以揭示其作用机制。
本研究显示，四逆散与功能性消化不良相关的作用靶点152个。从“药物成分-核心靶点-通路”网络图来看，连接靶点较多的化合物有山柰酚（Kaempferol）、槲皮素（Quercetin）、木犀草素（Luteolin）、柚皮素（Naringenin）和川陈皮素（Nobiletin）等。据报道，槲皮素能促进功能性便秘大鼠的胃肠动力[8]，也被实验证实了具有双相调节胃肠平滑肌的作用[9]。柚皮素在何娟[10]的实验中被证实，是功能性消化不良患者口服四逆散汤剂后吸收入血液的成分，且具有促进正常大鼠胃肠动力的作用。木犀草素可以抑制模型鼠神经元的氧化应激损伤，具有抗抑郁作用[11]。川陈皮素是促进胃肠动力的活性物质[12]。
四逆散治疗功能性消化不良的关键靶点为AKT1、IL6、MARK8、MARK1、JUN、STAT3等。AKT1是苏氨酸蛋白激酶家族的成员，是位于PI3K-AKT信号通路中的重要调节分子，位于其上游的PI3K能够在受到体内细胞因子和内环境各种理化因素的刺激后被激活，产生肌醇，肌醇作为第二信使，调控磷酸化的AKT进而调控下游相关因子，调节许多细胞周期过程，包括新陈代谢、增殖、成活、生长等。位于其下游的eNOS是NO的调节酶，NO作为信号通路末端及其重要的信使分子，具有抑制胃肠道肌肉收缩和抑制胃肠蠕动的作用[13-14]。功能性消化不良大鼠胃窦NO水平明显增高[15-16]。另有研究发现，NO不仅是重要的胃肠道抑制性递质，还是维持ICC成活的因子之一，神经源性的NO有助于ICC的成活和增殖[17-18]。
IL-6是细胞免疫因子，局部免疫因子的释放可刺激位于胃肠黏膜中的神经元，其高表达可通过级联反应，激活或扩大炎症反应，影响肾上腺应激反应以及胃肠蠕动，导致胃肠功能紊乱[19-20]。FD患者血清IL-6水平明显升高，IL-6与抑郁的发生相关，IL-6与抑郁症有明显剂量-反应关系，而抑郁是功能性消化不良的危险因素，IL-6水平或与患者功能性消化不良反复发作相关[21-22]。
MARK是丝裂原活化蛋白激酶，可以使肌动蛋白细肌丝相关蛋白磷酸化，引起肌丝滑行，最终平滑肌收缩[23]。此外，MARK-ERK信号转导通路，可激活下游靶基因c-fos。c-fos是公认的伤害性刺激神经元激活的标志物，当表达c-fos的神经元增加时，可促进痛觉敏感的形成，使痛阈降低[24]，导致功能性胃肠病内脏高敏感性的发生[25]，进而引起胃痛、胃胀等症状。同时MARK通路可激活下游的核因子κB，导致十二指肠微炎症的发生[26]。 JUN也是MARK信号转导通路的下游效应因子，是信号从细胞表明转导到细胞核内部的重要传递者，活化的JUN可和多基因启动子上的激活蛋白结合，使c-jun磷酸化，增强其转录活性并促进c-jun、c-fos的表达，此二者与疼痛、抑郁等有密切关系[27]。
STAT3是信号转导与转录激活因子，对神经肽阳性神经元的能量表达非常重要，研究指出下丘脑中STAT3下调，可调节胃肠激素从而增强胃肠运动[28-29]。
GO功能富集分析结果中，生物过程主要有药物反应、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控，细胞成分主要有细胞外隙、细胞溶质，分子功能主要有酶结合和蛋白质结合等。在靶点基因的KEGG富集分析中，可以发现PI3K-AKT信号通路、TNF信号通路、MAPK信号通路和Toll样受体信号富集程度较高，与功能性消化不良关系密切。其中，PI3K-AKT信号通路和MAPK信号通路与上述分析中的关键靶点相吻合，证实上述靶点蛋白通过此信号通路发挥作用。PI3K-AKT-eNOS信号通路介导了胃肠激素NO的分泌，并进一步影响ICC的增殖与成活，从多方面调控胃肠动力。MARK信号通路是调控炎症、疼痛、抑郁等的经典信号通路，可通过多种机制参与功能性胃肠病内脏痛敏的形成与发展[30]。TNF信号通路也被证实参与功能性消化不良的发生，研究表明四逆散可以通过降低肿瘤坏死因子（Tumor Nucrosis Factor，TNF），改善功能性消化不良大鼠紧密连接完整性，减轻十二指肠轻度炎症[6]。Toll样受体信号通路是经典炎症通路，在机体应激条件下，通路中受体异常激活，使下游核因子κB等信号分子激活，炎性细胞和炎症介质的释放增加产生多种炎症反应。
利用Autodock软件对4个药物成分及6个靶点进行分子对接，提示筛选出的药物成分和靶点结合性较高，验证了运用网络药理学方法对四逆散治疗功能性消化不良进行探讨结果的可靠性。
综上所述，本研究发现四逆散中山柰酚、槲皮素、木犀草素等成分直接作用于AKT1、IL6、MAPK8、MAPK1、JUN、STAT3等相关靶点起作用，并通过PI3K-AKT、MARK和TNF等信号通路，改善胃肠动力、降低内脏高敏感性、调节免疫反应减轻炎症及缓解抑郁等负面情绪，抑制功能性消化不良的病理发展机制，体现了中药复方君臣佐使，多靶点协作的调节作用，为其药效物质基础的进一步研究提供了理论基础。同时结果中大量炎症反应相关通路揭示了十二指肠微炎症可能在功能性消化不良发病机制中非常重要，是未来治疗功能性消化不良研究的一大方向。本研究仅从理论及网络预测的角度进行分析，具体的作用机制仍有待进一步的实验验证。
参考文献
[1]Ghoshal UC，Singh R，Chang FY，et al.Epidemiology of uninvestigated and functional dyspepsia in Asia：facts and fiction[J].J Neurogastroenterol Motil，2011，17（3）：235-244.
[2]李军祥，陈誩，李岩.功能性消化不良中西医结合诊疗共识意见（2017年）[J].中国中西医结合消化杂志，2017，25（12）：889-894.
[3]田军.功能性消化不良经方研究进展[J].内蒙古中医药，2019，38（12）：165-166.
[4]汪龙德，杜晓娟，刘俊宏，等.基于脑肠互动探讨疏肝健脾法治疗功能性消化不良的研究思路[J].中医研究，2019，32（4）：1-3.
[5]罗欣，王玉珍.功能性消化不良发病机制研究进展[J].世界最新医学信息文摘，2019，19（76）：91-92，107.
[6]Chang X，Zhao L，Wang J，et al.Sini-san improves duodenal tight junction integrity in a rat model of functional dyspepsia[J].BMC Complement Altern Med，2017，17（1）：432.
[7]Walker MM，Potter MD，Talley NJ.Tangible pathologies in functional dyspepsia[J].Best Pract Res Clin Gastroenterol，2019，40（41）：101650.
[8]Kim JE，Lee MR，Park JJ，et al.Quercetin promotes gastrointestinal motility and mucin secretion in loperamide-induced constipation of SD rats through regulation of the mAChRs downstream signal[J].Pharm Biol，2018，56（1）：309-317.
[9]van der Woude H，Gliszczyńska-Swigo A，Struijs K，et al.Biphasic modulation of cell proliferation by quercetin at concentrations physiologically relevant in humans[J].Cancer Lett，2003，200（1）：41-47.
[10]何娟.四逆散促胃腸动力成分的药物动力学研究[D].长沙：中南大学，2013.
[11]刘毅，蓝诺，刘莉，等.木犀草素对慢性不可预知性温和应激所致小鼠抑郁的改善作用[J].时珍国医国药，2013，24（6）：1382-1384. [12]宋玉鹏，陈海芳，胡源祥，等.陈皮及其主要活性成分对脾虚模型大鼠血清胃泌素、血浆乙酰胆碱、P物质、胃动素和血管活性肠肽的影响[J].中药药理与临床，2017，33（3）：79-83.
[13]Ma P，Gu B，Xiong W，et al.Glimepiride promotes osteogenic differentiation in rat osteoblasts via the PI3K/Akt/eNOS pathway in a high glucose microenvironment[J].PLoS One，2014，9（11）：e112243.
[14]Matsumoto Y，Ito M，Tsuge M，et al.Ecabet sodium induces neuronal nitric oxide synthase-derived nitric oxide synthesis and gastric adaptive relaxation in the human stomach[J].J Gastroenterol，2009，44（11）：1118-1124.
[15]刘英超，钟继红，孙静.莪术对功能性消化不良大鼠胃窦神经介质NO及AchE的影响[J].中国中医药科技，2014，21（1）：37-38，47.
[16]伍早安，李国成，胡道松.肝胃不和型功能性消化不良大鼠幽门括约肌乙酰胆碱酯酶及一氧化氮合酶的表达[J].中国中西医结合消化杂志，2004，12（1）：8-10.
[17]Iwasaki H，Kajimura M，Osawa S，et al.A deficiency of gastric interstitial cells of Cajal accompanied by decreased expression of neuronal nitric oxide synthase and substance P in patients with type 2 diabetes mellitus[J].J Gastroenterol，2006，41（11）：1076-1087.
[18]Choi KM，Gibbons SJ，Roeder JL，et al.Regulation of interstitial cells of Cajal in the mouse gastric body by neuronal nitric oxide[J].Neurogastroenterol Motil，2007，19（7）：585-595.
[19]夏菁，孙涛.罗马Ⅲ诊断标准的制定与功能性胃肠疾病的研究进展[J].海军总医院学报，2011，24（3）：166-168.
[20]赵波.炎症性肠病患者IL-6、sICAM-1及chemerin改变及与自主神经功能相关性研究[J].胃肠病学和肝病学杂志，2017，26（5）：555-558.
[21]李春儒.功能性消化不良患者血清白介素-6水平与焦虑、抑郁的相关性[J].临床医学工程，2019，26（4）：531-532.
[22]黄更珍，贺国斌，周晓晴，等.功能性消化不良患者血浆脑肠肽及白介素6与精神心理因素关系的研究[J].中国临床新医学，2017，10（2）：127-130.
[23]谢燕东.PKC及MAPK信号转导途径在针刺足三里穴调节大鼠胃运动中的作用研究[D].西安：第四军医大学，2012.
[24]Traub RJ，Stitt S，Gebhart GF.Attenuation of c-Fos expression in the rat lumbosacral spinal cord by morphine or tramadol following noxious colorectal distention[J].Brain Res，1995，701（1-2）：175-82.
[25]肖兴会.基于MAPK-ERK信号通路研究痛泻要方及其拆方缓解IBS-D内脏高敏性的作用机制[D].成都：成都中医药大学，2017.
[26]常雄飞，赵鲁卿，贾梦迪，等.健脾理气方对功能性消化不良模型大鼠十二指肠TLR9/NF-κB/iNOS通路的影响[J].北京中医药，2018，37（7）：606-609.
[27]代维，张明洁，邱恩超，等.cAMP反应元件结合蛋白在头痛与抑郁中的研究现状[J].中国疼痛医学杂志，2017，23（12）：923-926.
[28]He Y，Yang C，Wang P，et al.Child compound Endothelium corneum attenuates gastrointestinal dysmotility through regulating the homeostasis of brain-gut-microbiota axis in functional dyspepsia rats[J].J Ethnopharmacol，2019，240：111953.
[29]王郁金，周永学，谢培，等硝菔通结方对功能性便秘大鼠排便及胃肠动力的影响[J].中国实验方剂学杂志，2014，20（17）：146-149.
[30]付晨瑜，高珊杉，李春雨，等.電针对功能性胃肠病大鼠内脏敏感性影响机制研究[J].辽宁中医药大学学报，2020，22（7）：32-36.
（2020-08-01收稿 责任编辑：杨觉雄）