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摘要 [目的]建立一种分析微生物肥料菌种稳定性的T-RFLP指纹图谱技术。[方法]采用T-RFLP指纹图谱技术对进口细菌型微生物肥料菌种的稳定性进行分析。[结果]样品中优势菌的T-RFs片段主要是87、246、247、330 bp，其中330 bp为主要片段，Shannon多样性指数和均一性指数测定结果表明，不同批次产品间差异性较小，微生物群落结构较稳定。[结论]建立了微生物肥料菌种稳定性分析的T-RFLP指纹图谱技术，为进出口微生物肥料产品提供了一种快速分析方法。
关键词 T-RFLP；微生物肥料；稳定性
中图分类号 S144 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）01-0143-02
TRFLP Analysis for Stability of Bacterial Microbial Fertilizers
WEI Shuang1，LIU Jianhua2，WU Xiyuan3，LIU Zhongyong1* et al
（1.Shantou EntryExit Inspection and Quarantine Bureau，Shantou，Guangdong 515041；2.Standard and Technical Regulation Research Center of AQSIQ，Beijing 100028；3.Guangzhou Airport EntryExit Inspection and Quarantine Bureau，Guangzhou，Guangdong 510000）
Abstract [Objective] The aim was to establish a TRFLP technique for the stability of bacterial microbial fertilizers.[Method] We used terminal restriction fragment length polymorphism （TRFLP） technique to analyze the stability of import microbial fertilizers.[Result] The TRFs fragments with the sizes of 87，246，247 and 330 bp were the dominant bacteria.The TRFs fragments with the sizes of 330 bp was the most important dominant bacteria.The Shannon diversity index and evenness index show that the diversity between the different batches of products was small.The community of bacterial of products were stability.[Conclusion] A TRFLP technique has been developed for analyze the stability of microbial fertilizers，which can be used for the import or export of microbial fertilizers.
Key words TRFLP；Microbial fertilizers；Stability
化肥的使用使农产品的品质下降，营养价值、适口性降低，蔬菜硝态氮超标、亚硝态氮积累超标；还引起江河湖泊的富营养化，破坏土壤结构，致使土壤中有机质减少，保存养分、水分的能力下降，易发生风蚀和荒漠化[1]。微生物肥料是1种或多种功能微生物经工业化生产增殖后直接使用，或者浓缩或經载体吸附而制成的活菌制品。它具有多方面的优点：土壤团粒化及土壤改良、增加植物抗逆境能力；促进分解有机物质；防除病害，减少农药的需求；连续造肥作用，提供植物吸收，如氮肥制造、达成肥分的可溶性、提供有机营养等；解除毒素促进植物生长；增进肥效[2-3]。微生物肥料不仅可以促进植物生长，提高产量，而且还能够解决因长期使用化肥而造成的一系列生态环境问题，微生物肥料在绿色有机食品生产、农业生态环境保护以及高产、优质、高效农业的持续发展中发挥着重要作用。
当进出口微生物肥料量较大时，对批批产品都按照标准的传统分离培养鉴定检测流程进行检验检疫的工作量大，因此，探寻一种快速、自动化、准确的微生物肥料产品筛检技术对该类产品通关速度的加快具有重要意义。李朔[4]利用PCR-DGGE指纹图谱技术研究了微生物肥料培养过程中菌群的变化，同时还分析了微生物肥料施用过程中土壤的生物多样性变化；李武等[5]利用PCR-DGGE指纹图谱技术对同一生产批次3个不同包装样品的细菌和真菌群落进行分析，建立了对微生物肥料质量进行评估和检测的方法。T-RFLP是建立在PCR、RFLP等技术和DNA片段分析技术不断完善的基础上，由这些技术的融合产生的一种全新、快速、有效的微生物群落结构分析方法。该技术已被成功应用于菌种的鉴定、各种微生物群落的比较分析、微生物群落多样性及结构特征的研究等方面，是目前很有前景的微生物群落指纹图谱分析技术[6-8]。笔者利用微生物肥料中微生物群落的T-RFLP指纹图谱技术，分析了微生物肥料产品菌种组成稳定性，以便对大规模微生物肥料样品进行快速分析。
1 材料与方法
1.1 材料
试验所用的样品为进口液体微生物肥料，自广东汕头国际集装箱码头分3批进口，来源于美国，每批次取3个样品，分别是2015年11月（A1、A2、A3）、2016年5月（B1、B2、B3）、2016年7月（C1、C2、C3）进口。PCR产物纯化试剂盒为天根生化科技有限公司产品。 1.2 方法
1.2.1 基因组DNA的提取。
采用试剂盒法提取样品基因组DNA，取1 mL样品，12 000 r/min离心5 min，去除上清液，按照DNA提取试剂盒说明书中的操作步骤进行提取，提取出的DNA保存于-20 ℃冰箱中。
1.2.2 PCR扩增及产物纯化。
选用细菌16S rRNA通用引物8F/1492r，8F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，1492r：ACGGTTACCTTGTTACGACTT，其中8F的5′端进行FAM荧光标记。反应体系包括：10×PCR Buffer缓冲液5.00 μL、dNTPs溶液4.00 μL，各引物终浓度均为0.2 μmol/L，DNA模板2.00 μL、Ex Taq酶0.25 μL，ddH2O调节最终体积至50.00 μL。反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，35个循环；72 ℃ 10 min。PCR扩增产物采用PCR产物纯化试剂盒进行纯化，后经2.0%琼脂糖电泳后，用凝胶成像系统观察并拍照。
1.2.3 酶切及T-RFs分析。
纯化后的PCR产物采用Hha Ⅰ进行酶切，方法根据相应内切酶的使用说明书进行。反应体系：10×M Buffer缓冲液0.50 μL，内切酶4.00 μL，PCR产物6.00 μL，ddH2O调节最终体积至40.00 μL。在37 ℃下消化6 h，反应完成后，Hha Ⅰ 在65°C水浴20 min失活，酶切后的产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行基因扫描，得到T-RFLP图谱。
1.2.4 数据处理。
T-RFLP图谱中数据处理，去除小于50 bp或大于500 bp的片段以及峰面积占总峰面积0.5%的片段。核糖核酸丰度指数（S）相当于限制性片段图谱中差异片段的总数；Shannon多样性指数（H）和均一度指数（E）根据Mills等[9]的方法计算。采用BIO-DAP软件计算样品之间的Jaccard 相似度指数，用于评价2个样品微生物群落的相似度。
2 结果与分析
2.1 T-RFLP数据初步分析
根据T-RFLP扫描结果统计T-RFs片段长度，挑选出片段峰面积占总峰面积比例超过10%作为优势片段，结果见表1。9个样品T-RFs片段数量为4～9个，片段大小集中在64～363 bp，优势T-RFs片段长度主要是87、246、247、330 bp，其中330 bp片段所占比例最大，集中在40.63%～74.81%，说明产品中优势菌株较稳定。
2.2 多样性分析
由表2可知，C批次样品T-RFs总片段数大于B批次样品，B批次样品T-RFs总片段数大于A批次样品，但结合峰面积比例计算出的Shannon多样性指数和均一性指数来看，大部分样品Shannon多样性指数集中在10～1.5，均一性指数集中在0.6～0.9，样品的微生物多样性变化不大，产品的微生物群落结构较稳定。
2.3 相似性分析
由表3可知，所有样品之间Jaccard相似度指数集中在0.250～0.857，A批次样品之间Jaccard相似度指数在0.400～0.750，B批次样品之间Jaccard相似度指数在0.400～0.750，C批次样品之间Jaccard相似度指数在0625～0.857。
3 结论
建立了用于细菌型微生物肥料中微生物群落分析的T-RFLP指纹图谱技术。结果表明，汕头口岸进口的微生物肥料菌株结构较稳定，优势菌种稳定且占整个群落结构的比例较高；该方法快速，在1 d之内能得到分析结果，比传统平板培养法更简便，可用于进出口微生物肥料产品菌落稳定性的初筛。
参考文献
[1]
王润涵.国际背景下我国农药使用及行业现状分析和发展趋势研究[D].杭州：浙江大学，2013.
[2] 孟瑶，徐凤花，孟庆有，等.中国微生物肥料研究及应用进展[J].中国农学通报，2008，24（6）：276-283.
[3] 王素英，陶光灿，谢光辉，等.我国微生物肥料的应用研究进展[J].中国农业大学学报，2003，8（1）：14-18.
[4] 李朔.利用DGGE法研究微生物肥料培养过程中菌群的变化[D].北京：北京化工大学，2012.
[5] 李武，王凌華，赵勇，等.分子生态学方法在微生物肥料质量监测中的应用[J].微生物学通报，2006，33（1）：53-58.
[6] SJOBERG F，NOWROUZIAN F，RANGEL I，et al.Comparison between terminalrestriction fragment length polymorphism （TRFLP） and quantitative culture for analysis of infants’ gut microbiota[J].Journal of microbiological methods，2013，94（1）：37-46.
[7] WANG Q，ZHANG X，ZHANG H Y，et al.Identification of 12 animal species meat by TRFLP on the 12S rRNA gene[J].Mea science，2010，85（2）：265-269.
[8] SAWAMURA H，YAMADA M，ENDOK，et al.Characterization of microorganisms at different landfill depths using carbonutilization patterns and 16S rRNA gene based TRFLP[J].Journal of bioscience and bioengineering，2010，109（2）：130-137.
[9] MILLS D K，FITZGERALD K，LITCHFIELD C D，et al.A comparison of DNA profiling techniques for monitoring nutrient impact on microbial community composition during bioremediation of petroleumcontaminated soils[J].Journal of microbiol methods，2003，54（1）：57-74.
关键词 T-RFLP；微生物肥料；稳定性
中图分类号 S144 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）01-0143-02
TRFLP Analysis for Stability of Bacterial Microbial Fertilizers
WEI Shuang1，LIU Jianhua2，WU Xiyuan3，LIU Zhongyong1* et al
（1.Shantou EntryExit Inspection and Quarantine Bureau，Shantou，Guangdong 515041；2.Standard and Technical Regulation Research Center of AQSIQ，Beijing 100028；3.Guangzhou Airport EntryExit Inspection and Quarantine Bureau，Guangzhou，Guangdong 510000）
Abstract [Objective] The aim was to establish a TRFLP technique for the stability of bacterial microbial fertilizers.[Method] We used terminal restriction fragment length polymorphism （TRFLP） technique to analyze the stability of import microbial fertilizers.[Result] The TRFs fragments with the sizes of 87，246，247 and 330 bp were the dominant bacteria.The TRFs fragments with the sizes of 330 bp was the most important dominant bacteria.The Shannon diversity index and evenness index show that the diversity between the different batches of products was small.The community of bacterial of products were stability.[Conclusion] A TRFLP technique has been developed for analyze the stability of microbial fertilizers，which can be used for the import or export of microbial fertilizers.
Key words TRFLP；Microbial fertilizers；Stability
化肥的使用使农产品的品质下降，营养价值、适口性降低，蔬菜硝态氮超标、亚硝态氮积累超标；还引起江河湖泊的富营养化，破坏土壤结构，致使土壤中有机质减少，保存养分、水分的能力下降，易发生风蚀和荒漠化[1]。微生物肥料是1种或多种功能微生物经工业化生产增殖后直接使用，或者浓缩或經载体吸附而制成的活菌制品。它具有多方面的优点：土壤团粒化及土壤改良、增加植物抗逆境能力；促进分解有机物质；防除病害，减少农药的需求；连续造肥作用，提供植物吸收，如氮肥制造、达成肥分的可溶性、提供有机营养等；解除毒素促进植物生长；增进肥效[2-3]。微生物肥料不仅可以促进植物生长，提高产量，而且还能够解决因长期使用化肥而造成的一系列生态环境问题，微生物肥料在绿色有机食品生产、农业生态环境保护以及高产、优质、高效农业的持续发展中发挥着重要作用。
当进出口微生物肥料量较大时，对批批产品都按照标准的传统分离培养鉴定检测流程进行检验检疫的工作量大，因此，探寻一种快速、自动化、准确的微生物肥料产品筛检技术对该类产品通关速度的加快具有重要意义。李朔[4]利用PCR-DGGE指纹图谱技术研究了微生物肥料培养过程中菌群的变化，同时还分析了微生物肥料施用过程中土壤的生物多样性变化；李武等[5]利用PCR-DGGE指纹图谱技术对同一生产批次3个不同包装样品的细菌和真菌群落进行分析，建立了对微生物肥料质量进行评估和检测的方法。T-RFLP是建立在PCR、RFLP等技术和DNA片段分析技术不断完善的基础上，由这些技术的融合产生的一种全新、快速、有效的微生物群落结构分析方法。该技术已被成功应用于菌种的鉴定、各种微生物群落的比较分析、微生物群落多样性及结构特征的研究等方面，是目前很有前景的微生物群落指纹图谱分析技术[6-8]。笔者利用微生物肥料中微生物群落的T-RFLP指纹图谱技术，分析了微生物肥料产品菌种组成稳定性，以便对大规模微生物肥料样品进行快速分析。
1 材料与方法
1.1 材料
试验所用的样品为进口液体微生物肥料，自广东汕头国际集装箱码头分3批进口，来源于美国，每批次取3个样品，分别是2015年11月（A1、A2、A3）、2016年5月（B1、B2、B3）、2016年7月（C1、C2、C3）进口。PCR产物纯化试剂盒为天根生化科技有限公司产品。 1.2 方法
1.2.1 基因组DNA的提取。
采用试剂盒法提取样品基因组DNA，取1 mL样品，12 000 r/min离心5 min，去除上清液，按照DNA提取试剂盒说明书中的操作步骤进行提取，提取出的DNA保存于-20 ℃冰箱中。
1.2.2 PCR扩增及产物纯化。
选用细菌16S rRNA通用引物8F/1492r，8F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，1492r：ACGGTTACCTTGTTACGACTT，其中8F的5′端进行FAM荧光标记。反应体系包括：10×PCR Buffer缓冲液5.00 μL、dNTPs溶液4.00 μL，各引物终浓度均为0.2 μmol/L，DNA模板2.00 μL、Ex Taq酶0.25 μL，ddH2O调节最终体积至50.00 μL。反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，35个循环；72 ℃ 10 min。PCR扩增产物采用PCR产物纯化试剂盒进行纯化，后经2.0%琼脂糖电泳后，用凝胶成像系统观察并拍照。
1.2.3 酶切及T-RFs分析。
纯化后的PCR产物采用Hha Ⅰ进行酶切，方法根据相应内切酶的使用说明书进行。反应体系：10×M Buffer缓冲液0.50 μL，内切酶4.00 μL，PCR产物6.00 μL，ddH2O调节最终体积至40.00 μL。在37 ℃下消化6 h，反应完成后，Hha Ⅰ 在65°C水浴20 min失活，酶切后的产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行基因扫描，得到T-RFLP图谱。
1.2.4 数据处理。
T-RFLP图谱中数据处理，去除小于50 bp或大于500 bp的片段以及峰面积占总峰面积0.5%的片段。核糖核酸丰度指数（S）相当于限制性片段图谱中差异片段的总数；Shannon多样性指数（H）和均一度指数（E）根据Mills等[9]的方法计算。采用BIO-DAP软件计算样品之间的Jaccard 相似度指数，用于评价2个样品微生物群落的相似度。
2 结果与分析
2.1 T-RFLP数据初步分析
根据T-RFLP扫描结果统计T-RFs片段长度，挑选出片段峰面积占总峰面积比例超过10%作为优势片段，结果见表1。9个样品T-RFs片段数量为4～9个，片段大小集中在64～363 bp，优势T-RFs片段长度主要是87、246、247、330 bp，其中330 bp片段所占比例最大，集中在40.63%～74.81%，说明产品中优势菌株较稳定。
2.2 多样性分析
由表2可知，C批次样品T-RFs总片段数大于B批次样品，B批次样品T-RFs总片段数大于A批次样品，但结合峰面积比例计算出的Shannon多样性指数和均一性指数来看，大部分样品Shannon多样性指数集中在10～1.5，均一性指数集中在0.6～0.9，样品的微生物多样性变化不大，产品的微生物群落结构较稳定。
2.3 相似性分析
由表3可知，所有样品之间Jaccard相似度指数集中在0.250～0.857，A批次样品之间Jaccard相似度指数在0.400～0.750，B批次样品之间Jaccard相似度指数在0.400～0.750，C批次样品之间Jaccard相似度指数在0625～0.857。
3 结论
建立了用于细菌型微生物肥料中微生物群落分析的T-RFLP指纹图谱技术。结果表明，汕头口岸进口的微生物肥料菌株结构较稳定，优势菌种稳定且占整个群落结构的比例较高；该方法快速，在1 d之内能得到分析结果，比传统平板培养法更简便，可用于进出口微生物肥料产品菌落稳定性的初筛。
参考文献
[1]
王润涵.国际背景下我国农药使用及行业现状分析和发展趋势研究[D].杭州：浙江大学，2013.
[2] 孟瑶，徐凤花，孟庆有，等.中国微生物肥料研究及应用进展[J].中国农学通报，2008，24（6）：276-283.
[3] 王素英，陶光灿，谢光辉，等.我国微生物肥料的应用研究进展[J].中国农业大学学报，2003，8（1）：14-18.
[4] 李朔.利用DGGE法研究微生物肥料培养过程中菌群的变化[D].北京：北京化工大学，2012.
[5] 李武，王凌華，赵勇，等.分子生态学方法在微生物肥料质量监测中的应用[J].微生物学通报，2006，33（1）：53-58.
[6] SJOBERG F，NOWROUZIAN F，RANGEL I，et al.Comparison between terminalrestriction fragment length polymorphism （TRFLP） and quantitative culture for analysis of infants’ gut microbiota[J].Journal of microbiological methods，2013，94（1）：37-46.
[7] WANG Q，ZHANG X，ZHANG H Y，et al.Identification of 12 animal species meat by TRFLP on the 12S rRNA gene[J].Mea science，2010，85（2）：265-269.
[8] SAWAMURA H，YAMADA M，ENDOK，et al.Characterization of microorganisms at different landfill depths using carbonutilization patterns and 16S rRNA gene based TRFLP[J].Journal of bioscience and bioengineering，2010，109（2）：130-137.
[9] MILLS D K，FITZGERALD K，LITCHFIELD C D，et al.A comparison of DNA profiling techniques for monitoring nutrient impact on microbial community composition during bioremediation of petroleumcontaminated soils[J].Journal of microbiol methods，2003，54（1）：57-74.