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中圖分类号 969.1;R917 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2021）11-1325-05
DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.11.08
摘 要 目的：建立测定肝微粒体中Foretinib衍生物LWK-126质量浓度的方法，研究其在大鼠、比格犬、人肝微粒体中的代谢稳定性。方法：采用体外肝微粒体孵育体系，将LWK-126分别溶于由还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸溶液启动的大鼠、比格犬、人肝微粒体孵育体系中，于37 ℃水浴下分别孵育0、5、10、20、30、60 min时加入含内标（1 μg/mL甲苯磺丁脲）的乙腈终止反应，并采用超高效液相色谱-串联质谱法检测各孵育体系中LWK-126的质量浓度。以Waters BEH C18为色谱柱，以水（含0.01%甲酸）-乙腈（含0.01%甲酸）为流动相进行梯度洗脱，流速为0.4 mL/min，柱温为30 ℃，进样量为2 μL;离子源为电喷雾电离源，采用正离子模式采集，扫描范围为m/z 50→1 200。以孵育0 min时LWK-126的质量浓度为参照，计算其在不同孵育体系中的剩余百分率与酶动力学参数。结果：LWK-126检测质量浓度的线性范围为0.05～15 μg/mL（R 2=0.999 2），定量下限为0.05 μg/mL，最低检测限为0.01 μg/mL，精密度、准确度、提取回收率和基质效应均符合生物样品定量分析的要求。LWK-126在人、大鼠、比格犬肝微粒体中孵育60 min后的剩余百分率分别为（33.17±4.52）%、（3.14±6.73）%、（1.38±5.85）%，半衰期分别为33.15、11.76、5.62 min，清除率分别为38.45、118.81、245.76 μL/（min·mg）。结论：成功建立了肝微粒体中LWK-126质量浓度的测定方法。LWK-126在不同种属肝微粒体中的代谢稳定性排序依次为人>大鼠>比格犬。
关键词 LWK-126;超高效液相色谱-串联质谱法;肝微粒体;代谢稳定性
ABSTRACT OBJECTIVE： To establish the method for the concentration determination of foretinib derivative LWK-126 in liver microsomes， and to study its metabolism stability in liver microsomes of rats， Beagle dogs and human. METHODS： In the in vitro incubation system of liver microsomes， LWK-126 was dissolved in liver microsomal incubation systems of rats， Beagle dog and human initiated by reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate solution. After incubation in water at 37 ℃ for 0，5，10，20，30 and 60 min， the reaction was terminated with acetonitrile containing internal standard （1 μg/mL tolbutamide）. UPLC-MS/MS method was applied to determine the concentration of LWK-126 in the incubation systems. The determination was performed on Waters BEH C18 column with mobile phase consisted of water （containing 0.1% formic acid）-acetonitrile （containing 0.1% formic acid） by gradient elution at the flow rate of 0.4 mL/min. The column temperature was 30 ℃， and the sample size was 2 μL. The mass spectral analysis was performed in a positive electrospray ionization mode，and the full MS experiment was run with the selective reaction monitoring mode with a scanning range of m/z 50→1 200. Taking the concentration of LWK-126 at 0 min as reference，the remaining percentage and the enzyme kinetic parameters were calculated. RESULTS： The linear range of LWK-126 was 0.05-15 μg/mL （R 2=0.999 2）; the lower limit of quantification was 0.05 μg/mL， and the lowest detection limit was 0.01 μg/mL. The precision， accuracy， extraction recovery and matrix effect all met the analysis requirements of biological samples. The remaining percentage of LWK-126 in liver microsomes of human， rats and Beagle dogs for 60 min were （33.17±4.52）%，（3.14±6.73）%，（1.38±5.85）%; t1/2 of them were 33.15， 11.76， 5.62 min; the clearance rates were 38.45， 118.81， 245.76 μL/（min·mg）， respectively. CONCLUSIONS： The method for the content determination of LWK-126 in liver microsomes is established successfully. The order of metabolic stability of LWK-126 in liver microsomes of different species is human>rats>Beagle dogs. 2.3 LWK-126质量浓度的测定方法
2.3.1 色谱条件与质谱条件 以Waters BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）为色谱柱，Waters VanGuard BEH C18（5 mm×2.1 mm，1.7 μm）为保护柱;以水（含0.01%甲酸）为流动相A、乙腈（含0.01%甲酸）为流动相A进行梯度洗脱（0～0.5 min，5%A;0.5～4.5 min，5%A→98%A;4.5～5 min，98%A→5%A）;流速为0.4 mL/min;柱温为30 ℃;进样量为2 μL。离子源为电喷雾电离源（ESI），离子源温度为100 ℃;毛细管电压为1.5 kV，锥孔电压为30 V，脱溶剂气温度为400 ℃，锥孔气流量为50 L/h，脱溶剂气流量为800 L/h;采用选择反应检测（SRM），采集正离子，扫描范围为m/z 50→1 200;数据采集分析软件为Masslynx V4.1，采集时间为5 min。
2.3.2 专属性考察 分别取适量空白孵育样品（不含待测物和内标，以高温灭活的大鼠肝微粒体为介质，其余按“2.2”项下方法制得）、LWK-126对照样品（含待测物5 μg/mL和内标1 μg/mL，以高温灭活的大鼠肝微粒为介质，按“2.2”项下方法制得）和孵育15 min时的LWK-126样品（大鼠肝微粒体，按“2.2”项下方法制得）各适量，按“2.3.1”项下条件进样分析，记录色谱图。结果，LWK-126的色谱峰峰形良好，保留时间约为2.08 min，孵育体系中内源性物质不干扰LWK-126的测定，表明该方法专属性良好，详见图2。
2.3.3 线性关系、定量下限与最低检测限考察 取“2.1.1”项下LWK-126贮备液适量，加入至经高温灭活的大鼠肝微粒体孵育体系中，制成LWK-126质量浓度分别为0.05、0.1、0.5、1、2.5、5、10、15 μg/mL的系列孵育样品溶液，按“2.2”项下方法处理后，取上清液按“2.3.1”项下条件进样分析，记录峰面积。以LWK-126质量浓度（x， μg/mL）为横坐标、LWK-126与内标的峰面积比值（y）为纵坐标进行回归分析，得回归方程为y=11.16x+0.5 （R 2=0.999 2），结果表明LWK-126检测质量浓度的线性范围为0.05～15 μg/mL，定量下限为0.05 μg/mL，最低检测限为0.01 μg/mL（按信噪比3 ∶ 1计）。
2.3.4 准确度与精密度试验 取“2.1.1”项下LWK-126贮备液适量，加入至经高温灭活的大鼠肝微粒体孵育体系中，制成定量下限质量浓度（0.05 μg/mL）的孵育样品溶液和低、中、高质量浓度（0.1、2.5、10 μg/mL）的質控样品溶液，各5份。各样品按“2.2”项下方法处理后，取上清液按“2.3.1”项下条件进样分析，记录峰面积，考察日内精密度;连续测定3天，考察日间精密度。以实测质量浓度与理论质量浓度进行比较以评价准确度，结果以相对误差（RE）表示。结果，定量下限质量浓度孵育样品与各质控样品的日内、日间RSD均小于10%，RE均在±6%之内，表明方法准确度和精密度良好，详见表1。
2.3.5 提取回收率与基质效应试验 取“2.1.1”项下LWK-126贮备液适量，加入至经高温灭活的大鼠肝微粒体孵育体系中，制成低、中、高质量浓度（0.1、2.5、10 μg/mL）的质控样品溶液，按“2.2”项下方法处理后，取上清液按“2.3.1”项下条件进样分析，记录峰面积（A1）。将经高温灭活的大鼠肝微粒体孵育体系按“2.2”项下方法处理后，加入LWK-126贮备液适量，制成与上述低、中、高质量浓度一致的样品溶液，按“2.3.1”项下条件进样分析，记录峰面积（A2）。以甲醇配制与上述低、中、高质量浓度一致的LWK-126溶液，按“2.3.1”项下条件进样分析，记录峰面积（A3）。每种样品平行操作5次，计算提取回收率和基质效应：提取回收率（%）=（A1/A2）×100%，基质效应（%）=（A2/A3）×100%，结果见表2。
2.3.6 稳定性试验 取“2.1.1”项下LWK-126贮备液适量，加入至经高温灭活的大鼠肝微粒体孵育体系中，制成低、中、高质量浓度的孵育样品溶液（0.1、2.5、10 μg/mL），各5份。各样品按“2.2”项下方法处理后，分别在室温放置24 h、4 ℃冰箱中冷藏24 h、常温至-80 ℃反复冻融3次后，按“2.3.1”项下条件进样分析，记录峰面积，代入回归方程计算质量浓度。结果，各孵育样品溶液质量浓度的RSD均小于10%，表明LWK-126孵育样品溶液在上述条件下稳定性良好，详见表3。
2.4 LWK-126在肝微粒体中的代谢稳定性
2.4.1 肝微粒体孵育体系建立的验证 为考察待测物是否受到非酶催化降解的影响，本研究按“2.2”项下方法设立空白组（即肝微粒体孵育体系中加入经高温灭活的肝微粒体）和阴性对照组（即肝微粒体孵育体系中不加入启动因子NADPH辅酶溶液）人、大鼠、比格犬肝微粒体孵育体系，分别于孵育0、5、10、20、30、60 min时按“2.3.1”项下条件进样分析，并按标准曲线法计算体系中LWK-126的质量浓度。以孵育0 min时LWK-126的质量浓度为参照，以其余各时间点LWK-126的质量浓度与参照的比值计算剩余百分率。实验平行操作3次。结果，LWK-126在空白组和阴性对照组孵育体系中孵育60 min时的剩余百分率在101.3%～108.8%（以平均值表示）范围内，表明可用本研究所创建的肝微粒体孵育体系对LWK-126的代谢特征进行探究，详见表4。
2.4.2 LWK-126在不同种属肝微粒体中的剩余百分率测定 按“2.2”项下方法建立人、大鼠、比格犬肝微粒体孵育体系，分别于孵育0、5、10、20、30、60 min时按“2.3.1”项下条件进样分析，并按标准曲线法计算体系中LWK-126的质量浓度，再按“2.4.1”项下方法计算各时间点LWK-126的剩余百分率。实验平行操作3次。结果，LWK-126在人、大鼠肝微粒体孵育体系中在5～10 min时消除最快，而在比格犬肝微粒体孵育体系中则是0～5 min时消除最快。LWK-126在人、大鼠、比格犬肝微粒体中孵育60 min时的剩余百分率分别为（33.17±4.52）%、（3.14±6.73）%、（1.38±5.85）%，详见表5。 2.4.3 LWK-126在肝微粒体中的酶动力学参数计算 在人、大鼠、比格犬肝微粒体中，以LWK-126剩余百分率的自然对数（y）与孵育时间（x）进行线性回归分析，得LWK-126在人、大鼠、比格犬肝微粒体中的回归方程分别为y人=-0.019 3x人+4.557 1（R 2=0.994 3）、y鼠= -0.059 2x鼠+4.590 0（R 2=0.998 7）、y犬=-0.123 7x犬+4.602 6（R 2=0.992 6）。根据各线性回归方程的斜率计算体外代谢的半衰期（t1/2）与清除率（CLint）：t1/2=-0.693/k（k是消除速率常数）、CLint=[（0.693/t1/2）×孵育体积（mL）]/肝微粒体质量（mg）[11]。结果显示，LWK-126在人、大鼠、比格犬肝微粒体中的t1/2分别为33.15、11.76、5.62 min，CLint分别为38.45、118.81、245.76 μL/（min·mg）。
3 讨论
本研究成功建立了LWK-126的UPLC-MS/MS定量分析方法，方法的专属性、线性关系、定量下限、精密度、准确度、提取回收率和基质效应均符合生物样品定量分析的相关要求[12]。为防止溶解药物的有机溶剂对肝微粒体起灭活作用，在实验操作中保证了孵育总体系中有机溶剂（甲醇）的体积分数不超过1%，以确保实验结果的可信度[11]。在本研究中，LWK-126加入到孵育体系中的终质量浓度为5 μg/mL、加入到孵育体系的肝微粒体的终质量浓度为0.5 μg/mL较为合适，因LWK-126的质量浓度过高，可能导致肝微粒体中酶系饱和，而质量浓度过低又不利于检测[11]。
为进一步确认本实验中肝微粒体孵育体系的可靠性，本研究还设置了空白组与阴性对照组。结果显示，在高温使酶灭活的空白组以及不加入NADPH辅酶溶液的阴性对照组中LWK-126的剩余百分率在101.3%～108.8%之间，表明本实验所建立的肝微粒体孵育体系可靠，可用于对待测物LWK-126的代谢特征探究。
根据t1/2可判断化合物是否稳定，参照标准如下：t1/2<30 min，表明受试物代谢不稳定;t1/2在30～90 min之间，表明受试物代谢稳定性中等;t1/2>90 min，表明受试物代谢稳定性良好[13]。本研究结果显示，LWK-126在大鼠肝微粒体（t1/2=11.76 min）、比格犬肝微粒体（t1/2= 5.62 min）中的代谢速率相近且代谢不稳定，而在人肝微粒体（t1/2=36.15 min）中的代谢速率相对于前两种肝微粒体较慢，属于中等稳定。这表明LWK-126在不同种属肝微粒体中的代谢速率存在种属差异，推测其体内代谢稳定性不理想，易被细胞色素P450酶所代谢[8，11]，需进一步对其结构进行修饰以提高代谢稳定性。
综上所述，本研究成功建立了测定肝微粒体中LWK-126质量浓度的UPLC-MS/MS法;LWK-126在不同种属肝微粒体中的代谢稳定性排序依次为人>大鼠>比格犬。后期应借助高分辨质谱及核磁共振等波谱手段对肝微粒体代谢产物进行结构确证，明确其体外代谢特征，为设计出代谢稳定、成药性好的c-Met抑制剂提供理论依据。
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（收稿日期：2021-01-15 修回日期：2021-03-16）
（编辑：邹丽娟）
DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.11.08
摘 要 目的：建立测定肝微粒体中Foretinib衍生物LWK-126质量浓度的方法，研究其在大鼠、比格犬、人肝微粒体中的代谢稳定性。方法：采用体外肝微粒体孵育体系，将LWK-126分别溶于由还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸溶液启动的大鼠、比格犬、人肝微粒体孵育体系中，于37 ℃水浴下分别孵育0、5、10、20、30、60 min时加入含内标（1 μg/mL甲苯磺丁脲）的乙腈终止反应，并采用超高效液相色谱-串联质谱法检测各孵育体系中LWK-126的质量浓度。以Waters BEH C18为色谱柱，以水（含0.01%甲酸）-乙腈（含0.01%甲酸）为流动相进行梯度洗脱，流速为0.4 mL/min，柱温为30 ℃，进样量为2 μL;离子源为电喷雾电离源，采用正离子模式采集，扫描范围为m/z 50→1 200。以孵育0 min时LWK-126的质量浓度为参照，计算其在不同孵育体系中的剩余百分率与酶动力学参数。结果：LWK-126检测质量浓度的线性范围为0.05～15 μg/mL（R 2=0.999 2），定量下限为0.05 μg/mL，最低检测限为0.01 μg/mL，精密度、准确度、提取回收率和基质效应均符合生物样品定量分析的要求。LWK-126在人、大鼠、比格犬肝微粒体中孵育60 min后的剩余百分率分别为（33.17±4.52）%、（3.14±6.73）%、（1.38±5.85）%，半衰期分别为33.15、11.76、5.62 min，清除率分别为38.45、118.81、245.76 μL/（min·mg）。结论：成功建立了肝微粒体中LWK-126质量浓度的测定方法。LWK-126在不同种属肝微粒体中的代谢稳定性排序依次为人>大鼠>比格犬。
关键词 LWK-126;超高效液相色谱-串联质谱法;肝微粒体;代谢稳定性
ABSTRACT OBJECTIVE： To establish the method for the concentration determination of foretinib derivative LWK-126 in liver microsomes， and to study its metabolism stability in liver microsomes of rats， Beagle dogs and human. METHODS： In the in vitro incubation system of liver microsomes， LWK-126 was dissolved in liver microsomal incubation systems of rats， Beagle dog and human initiated by reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate solution. After incubation in water at 37 ℃ for 0，5，10，20，30 and 60 min， the reaction was terminated with acetonitrile containing internal standard （1 μg/mL tolbutamide）. UPLC-MS/MS method was applied to determine the concentration of LWK-126 in the incubation systems. The determination was performed on Waters BEH C18 column with mobile phase consisted of water （containing 0.1% formic acid）-acetonitrile （containing 0.1% formic acid） by gradient elution at the flow rate of 0.4 mL/min. The column temperature was 30 ℃， and the sample size was 2 μL. The mass spectral analysis was performed in a positive electrospray ionization mode，and the full MS experiment was run with the selective reaction monitoring mode with a scanning range of m/z 50→1 200. Taking the concentration of LWK-126 at 0 min as reference，the remaining percentage and the enzyme kinetic parameters were calculated. RESULTS： The linear range of LWK-126 was 0.05-15 μg/mL （R 2=0.999 2）; the lower limit of quantification was 0.05 μg/mL， and the lowest detection limit was 0.01 μg/mL. The precision， accuracy， extraction recovery and matrix effect all met the analysis requirements of biological samples. The remaining percentage of LWK-126 in liver microsomes of human， rats and Beagle dogs for 60 min were （33.17±4.52）%，（3.14±6.73）%，（1.38±5.85）%; t1/2 of them were 33.15， 11.76， 5.62 min; the clearance rates were 38.45， 118.81， 245.76 μL/（min·mg）， respectively. CONCLUSIONS： The method for the content determination of LWK-126 in liver microsomes is established successfully. The order of metabolic stability of LWK-126 in liver microsomes of different species is human>rats>Beagle dogs. 2.3 LWK-126质量浓度的测定方法
2.3.1 色谱条件与质谱条件 以Waters BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）为色谱柱，Waters VanGuard BEH C18（5 mm×2.1 mm，1.7 μm）为保护柱;以水（含0.01%甲酸）为流动相A、乙腈（含0.01%甲酸）为流动相A进行梯度洗脱（0～0.5 min，5%A;0.5～4.5 min，5%A→98%A;4.5～5 min，98%A→5%A）;流速为0.4 mL/min;柱温为30 ℃;进样量为2 μL。离子源为电喷雾电离源（ESI），离子源温度为100 ℃;毛细管电压为1.5 kV，锥孔电压为30 V，脱溶剂气温度为400 ℃，锥孔气流量为50 L/h，脱溶剂气流量为800 L/h;采用选择反应检测（SRM），采集正离子，扫描范围为m/z 50→1 200;数据采集分析软件为Masslynx V4.1，采集时间为5 min。
2.3.2 专属性考察 分别取适量空白孵育样品（不含待测物和内标，以高温灭活的大鼠肝微粒体为介质，其余按“2.2”项下方法制得）、LWK-126对照样品（含待测物5 μg/mL和内标1 μg/mL，以高温灭活的大鼠肝微粒为介质，按“2.2”项下方法制得）和孵育15 min时的LWK-126样品（大鼠肝微粒体，按“2.2”项下方法制得）各适量，按“2.3.1”项下条件进样分析，记录色谱图。结果，LWK-126的色谱峰峰形良好，保留时间约为2.08 min，孵育体系中内源性物质不干扰LWK-126的测定，表明该方法专属性良好，详见图2。
2.3.3 线性关系、定量下限与最低检测限考察 取“2.1.1”项下LWK-126贮备液适量，加入至经高温灭活的大鼠肝微粒体孵育体系中，制成LWK-126质量浓度分别为0.05、0.1、0.5、1、2.5、5、10、15 μg/mL的系列孵育样品溶液，按“2.2”项下方法处理后，取上清液按“2.3.1”项下条件进样分析，记录峰面积。以LWK-126质量浓度（x， μg/mL）为横坐标、LWK-126与内标的峰面积比值（y）为纵坐标进行回归分析，得回归方程为y=11.16x+0.5 （R 2=0.999 2），结果表明LWK-126检测质量浓度的线性范围为0.05～15 μg/mL，定量下限为0.05 μg/mL，最低检测限为0.01 μg/mL（按信噪比3 ∶ 1计）。
2.3.4 准确度与精密度试验 取“2.1.1”项下LWK-126贮备液适量，加入至经高温灭活的大鼠肝微粒体孵育体系中，制成定量下限质量浓度（0.05 μg/mL）的孵育样品溶液和低、中、高质量浓度（0.1、2.5、10 μg/mL）的質控样品溶液，各5份。各样品按“2.2”项下方法处理后，取上清液按“2.3.1”项下条件进样分析，记录峰面积，考察日内精密度;连续测定3天，考察日间精密度。以实测质量浓度与理论质量浓度进行比较以评价准确度，结果以相对误差（RE）表示。结果，定量下限质量浓度孵育样品与各质控样品的日内、日间RSD均小于10%，RE均在±6%之内，表明方法准确度和精密度良好，详见表1。
2.3.5 提取回收率与基质效应试验 取“2.1.1”项下LWK-126贮备液适量，加入至经高温灭活的大鼠肝微粒体孵育体系中，制成低、中、高质量浓度（0.1、2.5、10 μg/mL）的质控样品溶液，按“2.2”项下方法处理后，取上清液按“2.3.1”项下条件进样分析，记录峰面积（A1）。将经高温灭活的大鼠肝微粒体孵育体系按“2.2”项下方法处理后，加入LWK-126贮备液适量，制成与上述低、中、高质量浓度一致的样品溶液，按“2.3.1”项下条件进样分析，记录峰面积（A2）。以甲醇配制与上述低、中、高质量浓度一致的LWK-126溶液，按“2.3.1”项下条件进样分析，记录峰面积（A3）。每种样品平行操作5次，计算提取回收率和基质效应：提取回收率（%）=（A1/A2）×100%，基质效应（%）=（A2/A3）×100%，结果见表2。
2.3.6 稳定性试验 取“2.1.1”项下LWK-126贮备液适量，加入至经高温灭活的大鼠肝微粒体孵育体系中，制成低、中、高质量浓度的孵育样品溶液（0.1、2.5、10 μg/mL），各5份。各样品按“2.2”项下方法处理后，分别在室温放置24 h、4 ℃冰箱中冷藏24 h、常温至-80 ℃反复冻融3次后，按“2.3.1”项下条件进样分析，记录峰面积，代入回归方程计算质量浓度。结果，各孵育样品溶液质量浓度的RSD均小于10%，表明LWK-126孵育样品溶液在上述条件下稳定性良好，详见表3。
2.4 LWK-126在肝微粒体中的代谢稳定性
2.4.1 肝微粒体孵育体系建立的验证 为考察待测物是否受到非酶催化降解的影响，本研究按“2.2”项下方法设立空白组（即肝微粒体孵育体系中加入经高温灭活的肝微粒体）和阴性对照组（即肝微粒体孵育体系中不加入启动因子NADPH辅酶溶液）人、大鼠、比格犬肝微粒体孵育体系，分别于孵育0、5、10、20、30、60 min时按“2.3.1”项下条件进样分析，并按标准曲线法计算体系中LWK-126的质量浓度。以孵育0 min时LWK-126的质量浓度为参照，以其余各时间点LWK-126的质量浓度与参照的比值计算剩余百分率。实验平行操作3次。结果，LWK-126在空白组和阴性对照组孵育体系中孵育60 min时的剩余百分率在101.3%～108.8%（以平均值表示）范围内，表明可用本研究所创建的肝微粒体孵育体系对LWK-126的代谢特征进行探究，详见表4。
2.4.2 LWK-126在不同种属肝微粒体中的剩余百分率测定 按“2.2”项下方法建立人、大鼠、比格犬肝微粒体孵育体系，分别于孵育0、5、10、20、30、60 min时按“2.3.1”项下条件进样分析，并按标准曲线法计算体系中LWK-126的质量浓度，再按“2.4.1”项下方法计算各时间点LWK-126的剩余百分率。实验平行操作3次。结果，LWK-126在人、大鼠肝微粒体孵育体系中在5～10 min时消除最快，而在比格犬肝微粒体孵育体系中则是0～5 min时消除最快。LWK-126在人、大鼠、比格犬肝微粒体中孵育60 min时的剩余百分率分别为（33.17±4.52）%、（3.14±6.73）%、（1.38±5.85）%，详见表5。 2.4.3 LWK-126在肝微粒体中的酶动力学参数计算 在人、大鼠、比格犬肝微粒体中，以LWK-126剩余百分率的自然对数（y）与孵育时间（x）进行线性回归分析，得LWK-126在人、大鼠、比格犬肝微粒体中的回归方程分别为y人=-0.019 3x人+4.557 1（R 2=0.994 3）、y鼠= -0.059 2x鼠+4.590 0（R 2=0.998 7）、y犬=-0.123 7x犬+4.602 6（R 2=0.992 6）。根据各线性回归方程的斜率计算体外代谢的半衰期（t1/2）与清除率（CLint）：t1/2=-0.693/k（k是消除速率常数）、CLint=[（0.693/t1/2）×孵育体积（mL）]/肝微粒体质量（mg）[11]。结果显示，LWK-126在人、大鼠、比格犬肝微粒体中的t1/2分别为33.15、11.76、5.62 min，CLint分别为38.45、118.81、245.76 μL/（min·mg）。
3 讨论
本研究成功建立了LWK-126的UPLC-MS/MS定量分析方法，方法的专属性、线性关系、定量下限、精密度、准确度、提取回收率和基质效应均符合生物样品定量分析的相关要求[12]。为防止溶解药物的有机溶剂对肝微粒体起灭活作用，在实验操作中保证了孵育总体系中有机溶剂（甲醇）的体积分数不超过1%，以确保实验结果的可信度[11]。在本研究中，LWK-126加入到孵育体系中的终质量浓度为5 μg/mL、加入到孵育体系的肝微粒体的终质量浓度为0.5 μg/mL较为合适，因LWK-126的质量浓度过高，可能导致肝微粒体中酶系饱和，而质量浓度过低又不利于检测[11]。
为进一步确认本实验中肝微粒体孵育体系的可靠性，本研究还设置了空白组与阴性对照组。结果显示，在高温使酶灭活的空白组以及不加入NADPH辅酶溶液的阴性对照组中LWK-126的剩余百分率在101.3%～108.8%之间，表明本实验所建立的肝微粒体孵育体系可靠，可用于对待测物LWK-126的代谢特征探究。
根据t1/2可判断化合物是否稳定，参照标准如下：t1/2<30 min，表明受试物代谢不稳定;t1/2在30～90 min之间，表明受试物代谢稳定性中等;t1/2>90 min，表明受试物代谢稳定性良好[13]。本研究结果显示，LWK-126在大鼠肝微粒体（t1/2=11.76 min）、比格犬肝微粒体（t1/2= 5.62 min）中的代谢速率相近且代谢不稳定，而在人肝微粒体（t1/2=36.15 min）中的代谢速率相对于前两种肝微粒体较慢，属于中等稳定。这表明LWK-126在不同种属肝微粒体中的代谢速率存在种属差异，推测其体内代谢稳定性不理想，易被细胞色素P450酶所代谢[8，11]，需进一步对其结构进行修饰以提高代谢稳定性。
综上所述，本研究成功建立了测定肝微粒体中LWK-126质量浓度的UPLC-MS/MS法;LWK-126在不同种属肝微粒体中的代谢稳定性排序依次为人>大鼠>比格犬。后期应借助高分辨质谱及核磁共振等波谱手段对肝微粒体代谢产物进行结构确证，明确其体外代谢特征，为设计出代谢稳定、成药性好的c-Met抑制剂提供理论依据。
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（收稿日期：2021-01-15 修回日期：2021-03-16）
（编辑：邹丽娟）