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【摘要】感染人体的疟原虫主要可分为间日疟原虫、恶性疟原虫、卵形疟原虫及三日疟原虫四种。目前对疟原虫分子生物学和免疫方面的研究比较多，但是针对人混合感染的检测工作还需要进一步的深入，以便研发出试剂盒，一次性检测出人感染疟原虫的种类，方便于临床的运用。本综述就学者们检测人感染疟原虫种类方面的工作进行一次总结，包括同时检测四种疟原虫感染的几种分子标记和研究这些分子标记的几种PCR方法。
【关键词】 疟原虫；分子标记；PCR方法
1 检测四种疟原虫的分子标记
1.1 疟原虫小核糖体亚基序列
疟原虫的小核糖体亚基序列（ SSU rRNA）的基因全长约为1622-1640bp， 主要用于编码核糖体的18S小亚基。SSU rRNA是丰富基因簇， 具有高拷贝特点，转录单位数量可达100～5000个；同时在染色体上串联装重复排列，具备重复性强的特点；更为关键的是：SSU rRNA具备变异性若，特异性强的特点。因此，SSU rRNA 是目前最常用的分析不同疟原虫基因组差异的保守序列 [1]。SSU rRNA序列包含间日疟原虫、恶性疟原虫、卵形疟原虫及三日疟原虫这四种疟原虫的属特异性序列，同时也包含了区分他们的种特异性序列[2].综上所述，目前学术界普遍认为SSU rRNA是用于区分种、株、期的理想鉴别依据， 广泛用于进化、分类研究中的分子标记序列。国外学者最先以SSU rRNA为分子标记进行疟原虫的研究，Snounou等[3]在1993年首先依据人类疟原虫SSU rRNA的种属特异性合成了四种特异性引物，扩增出了出间日疟、恶性疟、卵形疟及三日疟的rRNA片段。日本科学家Eun-Taek Han等[4]用环介导等温PCR（LAMP），利用18S rRNA，设计属特异性引物和种特异性引物区分四种疟原虫，检测出了感染种类。国内许多学者也以SSU rRNA基因片段进行了疟原虫感染的研究。陶玉滨等[5]用荧光定量PCR方法，根据恶性疟、三日疟、卵形疟、间日疟的18S rRNA基因序列，设计属、种特异性引物和Taq-Man探针，用荧光定量扩增反应确定标本中的基因拷贝数，电泳区别各种疟原虫。孙明林等[6]建立的双温度点复合PCR扩增系统，在一次扩增中同时检出间日疟和恶性疟两种原虫。高世同等[7]也在同一反应体系中，扩增出预期的间日疟341bp条带和恶性疟431bp条带。
1.2 疟原虫裂殖子表面蛋白 I 基因（MSP～I基因）
疟原虫分子标记裂殖子表面蛋白I （Merozoite Surface Protein I ， MSP-I）基因具有多态性，学者们对MSP-I基因的分子结构和生物学功能进行了较深入的研究，发现MSP-I基因位于第9号染色体，为单拷贝基因，分子量约为195Ka，共分为17个区，其中3、5、12和17区为高度保守[8]。MSP-I主要存在于疟原虫红内期，在裂殖子入侵红细胞时起重要作用，具有较强的抗原性和免疫原性。该基因型鉴别特征已被广泛应用于分型研究[9]。张山鹰等[10]对间日疟原虫进行了MSP-I 等位基因型形态学观察，，试图从分子水平来解释生物学形态的差异，结果显示两种不同间日疟原虫的MSP-I等位基因型疟原虫测量宿主正常红细胞、寄生红细胞、环状体以及核大小差别有显著意义。宋杰等[11]利用套式PCR检测MSP-I基因分子标记对海南省恶性疟原虫进行分型研究工作。
目前，对几种疟原虫的MSP-I基因做得较多的研究为基因分型，而且大多都是结合其他的分子标记，比如CSP和MSP-2等来进行基因分型。如果能利用MSP-I基因，将形态学的差异以分子生物学手段来表现，将疟原虫的生物学形态差异通过MSP-I基因分型来表示，将MSP-I基因分型进行归类，用于种的鉴别，那么针对混合感染，检测疟原虫感染种类的工作将更加完善。
2 检测四种疟原虫的PCR方法
因为镜检疟原虫结果越来越遭到人们的质疑，学者们对更准确更可信方法的研究日益深入。
2.1 套式/复式PCR技术
国内学者从上世界90年代就将PCR技术用于疟疾的鉴别诊断，同时不断进行改进，现在已经可以实现套式/复式PCR，即从同一反应体系中同时检测几种疟原虫[12]。刘佩娜等[13]等利用套式PCR技术，初期仅使用2对外引物扩增人类疟原虫SSU rRNA特异片段，之后开始采用4对内引物同时扩增不同种属的疟原虫SSU rRNA特定片段，鉴别人体四种疟原虫，检测我国西南部分疟区疟原虫的感染情况。国外学者Kimura K[14]利用套式PCR对SSU rRNA对四种疟原虫进行了检测，能检测人感染的四种疟原虫类型。
2.2 荧光定量PCR检测四种疟原虫
荧光定量PCR检测疟原虫具有独特的优势，不但能检测人所感染的种类，而且能报告感染的数量[15]。陶玉滨等[5]利用18S rRNA基因序列，采用荧光定量PCR，建立检测感染人的恶性疟、间日疟、三日疟、卵形疟四种疟原虫的种类和数量的方法。先就四种疟原虫相对稳定的保守区设计1对属特异性引物[16]和1条荧光探针，后在可变区设计4条不同的种特异性引物。此研究方法提供标本中被测基因的数量和种类，使得本方法在监测疟疾疫区的虫种分布、数量变化具有独特的优势。
2.3 环介导等温PCR（LAMP）
LAMP作为一种快速、简便的基因诊断方法，在60℃～65℃恒温条件下对基因进行扩增，可在短短60分钟内将目标基因扩增109倍～1010倍，该方法扩增效率极高，最大优势在于操作的简便性[17]。Birgit P?schl等[18]通过对比显微镜，套式PCR和LAMP方法来检测疟原虫感染，证实LAMP与套式PCR检测疟原虫的可靠性都胜于显微镜检测，两种方法没有明显区别。日本科学家Eun-Taek Han等[4]用LAMP，利用18S rRNA很好的检测出了四种感染类型。 参考文献
[1]郑徽，朱淮民，宁北芳，等.自然感染诺氏疟原虫患者血片样本PCR鉴定[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2006，24（4 ）：273～276
[2] Snounou G， Viriyakosol S， Jarra W，et al. Identification of the four human malaria parasite species in field samples by the polymerase chain reaction and detection of a high prevalence of mixed infections[J]. Mol Biochem Parasitol， 1993，58（2）：283
[3]Rougemont， M. Detection of four Plasmodium species in blood from humans by 18S rRNAgene subunit-based and species～specific real-time PCR assays[J]. J Clin Microbiol， 2004， 42（12）： 5636～5643.
[4]Eun-Taek H， Risa W，Jetsumon S，et al. Detection of Four Plasmodium Species by Genus- and Species-Specific Loop-Mediated Isothermal Amplification for Clinical Diagnosis[J]. J Clin Microbiol， Aug. 2007， 45（8）：2521-2528
[5]陶玉滨，许勇臣，杨利.基因扩增检测四种感染人的疟原虫种类、数量的方法[J].实用预防医学，2008，15（4）：1044～1047
[6]孙明林，薛采芳.疟疾复合PCR检测系统的建立[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志，1999，17（2）：109～111
[7]高世同，吴少庭，陈观今，等.PCR鉴别诊断间日疟及恶性疟的研究[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志，1997，15（6）：373～375
[8]刘彦文，余新炳，罗树红，等.恶性疟原虫FCCl/NH株裂殖子表面蛋白MSP-I第2-5区基因的PCR扩增及克隆[J].中国人兽共患病杂志，1998，14（5）：38～40
[9]张山鹰，许龙善，张莹珍，等.间日疟原虫不同MSP～I 等位基因型形态学观察[J].中国人兽共患病杂志，2005 ， 21 （3）：234～236
[10]张山鹰， 许龙善， 黄天谊，等.间日疟原虫MSP～I和CSP 基因遗传多样性的分析[J].中国寄生虫病防治杂志，2005 ，18（2 ）：108～110
[11]诸欣平，李明，董洁，等.套式PCR扩增特定SSrRNA基因片段诊断间日疟及混合感染的研究[J].中国寄生虫病防治杂志，1998，11（2）：92～95
[12]宋杰，江钢锋，陈沛泉.套式PCR用于海南省恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1和2的分型研究.热带医学杂志，2002，2（3）：230～232
[13] 刘佩娜，姜素华，廖琳，等.应用套式PCR技术检测我国西南部分疟区疟原虫的感染状况[J].华西医大学报，2002，33（3）：452～455
[14] Notomi， T.， H. Okayama， H. Masubuchi， T， et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J].Nucleic Acids Res，2000，28：E63.
[15]Perandin， F. Development of a real-time PCR assay for detection of Plasmodium falciparum， Plasmodium vivax， and Plasmodium ovale for routine clinical diagnosis[J]. J Clin Microbiol， 2004， 42（3）： 1214～1219.
[16]Kimura， K.， Kaneko， Q. Liu， M. Zhou， F. Kawamoto， et al. Identification of the four species of human malaria parasites by nested PCR that targets variant sequences in the small subunit rRNA gene[J]. Parasitol. Int. 1997，46：91-95.
[17] Rougemont， M. Detection of four Plasmodium species in blood from humans by 18S rRNAgene subunit-based and species-specific realtime PCR assays[J]. J Clin Microbiol， 2004， 42（12）： 5636～5643.
[18]Birgit P？schl， Jarurin Waneesorn， Oriel Thekisoe， et al. Comparative Diagnosis of Malaria Infections by Microscopy， Nested PCR， and LAMP in Northern Thailand[J].Am J Trop Med Hyg， Jul 2010； 83： 56 ～ 60.
【关键词】 疟原虫；分子标记；PCR方法
1 检测四种疟原虫的分子标记
1.1 疟原虫小核糖体亚基序列
疟原虫的小核糖体亚基序列（ SSU rRNA）的基因全长约为1622-1640bp， 主要用于编码核糖体的18S小亚基。SSU rRNA是丰富基因簇， 具有高拷贝特点，转录单位数量可达100～5000个；同时在染色体上串联装重复排列，具备重复性强的特点；更为关键的是：SSU rRNA具备变异性若，特异性强的特点。因此，SSU rRNA 是目前最常用的分析不同疟原虫基因组差异的保守序列 [1]。SSU rRNA序列包含间日疟原虫、恶性疟原虫、卵形疟原虫及三日疟原虫这四种疟原虫的属特异性序列，同时也包含了区分他们的种特异性序列[2].综上所述，目前学术界普遍认为SSU rRNA是用于区分种、株、期的理想鉴别依据， 广泛用于进化、分类研究中的分子标记序列。国外学者最先以SSU rRNA为分子标记进行疟原虫的研究，Snounou等[3]在1993年首先依据人类疟原虫SSU rRNA的种属特异性合成了四种特异性引物，扩增出了出间日疟、恶性疟、卵形疟及三日疟的rRNA片段。日本科学家Eun-Taek Han等[4]用环介导等温PCR（LAMP），利用18S rRNA，设计属特异性引物和种特异性引物区分四种疟原虫，检测出了感染种类。国内许多学者也以SSU rRNA基因片段进行了疟原虫感染的研究。陶玉滨等[5]用荧光定量PCR方法，根据恶性疟、三日疟、卵形疟、间日疟的18S rRNA基因序列，设计属、种特异性引物和Taq-Man探针，用荧光定量扩增反应确定标本中的基因拷贝数，电泳区别各种疟原虫。孙明林等[6]建立的双温度点复合PCR扩增系统，在一次扩增中同时检出间日疟和恶性疟两种原虫。高世同等[7]也在同一反应体系中，扩增出预期的间日疟341bp条带和恶性疟431bp条带。
1.2 疟原虫裂殖子表面蛋白 I 基因（MSP～I基因）
疟原虫分子标记裂殖子表面蛋白I （Merozoite Surface Protein I ， MSP-I）基因具有多态性，学者们对MSP-I基因的分子结构和生物学功能进行了较深入的研究，发现MSP-I基因位于第9号染色体，为单拷贝基因，分子量约为195Ka，共分为17个区，其中3、5、12和17区为高度保守[8]。MSP-I主要存在于疟原虫红内期，在裂殖子入侵红细胞时起重要作用，具有较强的抗原性和免疫原性。该基因型鉴别特征已被广泛应用于分型研究[9]。张山鹰等[10]对间日疟原虫进行了MSP-I 等位基因型形态学观察，，试图从分子水平来解释生物学形态的差异，结果显示两种不同间日疟原虫的MSP-I等位基因型疟原虫测量宿主正常红细胞、寄生红细胞、环状体以及核大小差别有显著意义。宋杰等[11]利用套式PCR检测MSP-I基因分子标记对海南省恶性疟原虫进行分型研究工作。
目前，对几种疟原虫的MSP-I基因做得较多的研究为基因分型，而且大多都是结合其他的分子标记，比如CSP和MSP-2等来进行基因分型。如果能利用MSP-I基因，将形态学的差异以分子生物学手段来表现，将疟原虫的生物学形态差异通过MSP-I基因分型来表示，将MSP-I基因分型进行归类，用于种的鉴别，那么针对混合感染，检测疟原虫感染种类的工作将更加完善。
2 检测四种疟原虫的PCR方法
因为镜检疟原虫结果越来越遭到人们的质疑，学者们对更准确更可信方法的研究日益深入。
2.1 套式/复式PCR技术
国内学者从上世界90年代就将PCR技术用于疟疾的鉴别诊断，同时不断进行改进，现在已经可以实现套式/复式PCR，即从同一反应体系中同时检测几种疟原虫[12]。刘佩娜等[13]等利用套式PCR技术，初期仅使用2对外引物扩增人类疟原虫SSU rRNA特异片段，之后开始采用4对内引物同时扩增不同种属的疟原虫SSU rRNA特定片段，鉴别人体四种疟原虫，检测我国西南部分疟区疟原虫的感染情况。国外学者Kimura K[14]利用套式PCR对SSU rRNA对四种疟原虫进行了检测，能检测人感染的四种疟原虫类型。
2.2 荧光定量PCR检测四种疟原虫
荧光定量PCR检测疟原虫具有独特的优势，不但能检测人所感染的种类，而且能报告感染的数量[15]。陶玉滨等[5]利用18S rRNA基因序列，采用荧光定量PCR，建立检测感染人的恶性疟、间日疟、三日疟、卵形疟四种疟原虫的种类和数量的方法。先就四种疟原虫相对稳定的保守区设计1对属特异性引物[16]和1条荧光探针，后在可变区设计4条不同的种特异性引物。此研究方法提供标本中被测基因的数量和种类，使得本方法在监测疟疾疫区的虫种分布、数量变化具有独特的优势。
2.3 环介导等温PCR（LAMP）
LAMP作为一种快速、简便的基因诊断方法，在60℃～65℃恒温条件下对基因进行扩增，可在短短60分钟内将目标基因扩增109倍～1010倍，该方法扩增效率极高，最大优势在于操作的简便性[17]。Birgit P?schl等[18]通过对比显微镜，套式PCR和LAMP方法来检测疟原虫感染，证实LAMP与套式PCR检测疟原虫的可靠性都胜于显微镜检测，两种方法没有明显区别。日本科学家Eun-Taek Han等[4]用LAMP，利用18S rRNA很好的检测出了四种感染类型。 参考文献
[1]郑徽，朱淮民，宁北芳，等.自然感染诺氏疟原虫患者血片样本PCR鉴定[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2006，24（4 ）：273～276
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[3]Rougemont， M. Detection of four Plasmodium species in blood from humans by 18S rRNAgene subunit-based and species～specific real-time PCR assays[J]. J Clin Microbiol， 2004， 42（12）： 5636～5643.
[4]Eun-Taek H， Risa W，Jetsumon S，et al. Detection of Four Plasmodium Species by Genus- and Species-Specific Loop-Mediated Isothermal Amplification for Clinical Diagnosis[J]. J Clin Microbiol， Aug. 2007， 45（8）：2521-2528
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[7]高世同，吴少庭，陈观今，等.PCR鉴别诊断间日疟及恶性疟的研究[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志，1997，15（6）：373～375
[8]刘彦文，余新炳，罗树红，等.恶性疟原虫FCCl/NH株裂殖子表面蛋白MSP-I第2-5区基因的PCR扩增及克隆[J].中国人兽共患病杂志，1998，14（5）：38～40
[9]张山鹰，许龙善，张莹珍，等.间日疟原虫不同MSP～I 等位基因型形态学观察[J].中国人兽共患病杂志，2005 ， 21 （3）：234～236
[10]张山鹰， 许龙善， 黄天谊，等.间日疟原虫MSP～I和CSP 基因遗传多样性的分析[J].中国寄生虫病防治杂志，2005 ，18（2 ）：108～110
[11]诸欣平，李明，董洁，等.套式PCR扩增特定SSrRNA基因片段诊断间日疟及混合感染的研究[J].中国寄生虫病防治杂志，1998，11（2）：92～95
[12]宋杰，江钢锋，陈沛泉.套式PCR用于海南省恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1和2的分型研究.热带医学杂志，2002，2（3）：230～232
[13] 刘佩娜，姜素华，廖琳，等.应用套式PCR技术检测我国西南部分疟区疟原虫的感染状况[J].华西医大学报，2002，33（3）：452～455
[14] Notomi， T.， H. Okayama， H. Masubuchi， T， et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J].Nucleic Acids Res，2000，28：E63.
[15]Perandin， F. Development of a real-time PCR assay for detection of Plasmodium falciparum， Plasmodium vivax， and Plasmodium ovale for routine clinical diagnosis[J]. J Clin Microbiol， 2004， 42（3）： 1214～1219.
[16]Kimura， K.， Kaneko， Q. Liu， M. Zhou， F. Kawamoto， et al. Identification of the four species of human malaria parasites by nested PCR that targets variant sequences in the small subunit rRNA gene[J]. Parasitol. Int. 1997，46：91-95.
[17] Rougemont， M. Detection of four Plasmodium species in blood from humans by 18S rRNAgene subunit-based and species-specific realtime PCR assays[J]. J Clin Microbiol， 2004， 42（12）： 5636～5643.
[18]Birgit P？schl， Jarurin Waneesorn， Oriel Thekisoe， et al. Comparative Diagnosis of Malaria Infections by Microscopy， Nested PCR， and LAMP in Northern Thailand[J].Am J Trop Med Hyg， Jul 2010； 83： 56 ～ 60.