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摘要 目的：研究差异性炮制方法对丹参药材中丹酚酸B的变化。方法：选取和制备炒丹参、丹参炭、米炒丹参、酒丹参、醋丹参，随后采用高效液相色谱法检测各种丹参炮制品中的丹酚酸B的含量。结果：酒丹参炮制品中丹酚酸B的含量最高，醋丹参位列第二，按照醋丹酚酸B含量从高到低的顺序依次为生丹参、米炒丹参、炒丹参、丹参炭。结论：丹酚酸B的热稳定性较差，通过乙醇以及酸性添加剂可在一定程度上增加丹酚酸B的熱稳定性，值得临床重点关注。
关键词 丹参;丹酚酸B;差异性炮制方法;高效液相色谱法;水平变化;热稳定性
Abstract Objective：To study the change of different processing methods on salvianolic acid B in Radix Salviae Miltiorrhizae.Methods：The preparation of fried Radix Salviae Miltiorrhizae，Radix Salviae Miltiorrhizae charcoal，rice fried Radix Salviae Miltiorrhizae，wine Radix Salviae Miltiorrhizae and vinegar Radix Salviae Miltiorrhizae were carried out respectively.Subsequently，high-performance liquid chromatography was used to detect salvianolic acid B in various processed products of Radix Salviae Miltiorrhizae.Results：The content of salvianolic acid B in the processed products of wine Radix Salviae Miltiorrhizae was the highest，and that of vinegar Radix Salviae Miltiorrhizae was the second.According to the order of vinegar salvianolic acid B content from high to low was Radix Salviae Miltiorrhizae，rice fried Radix Salviae Miltiorrhizae，fried Radix Salviae Miltiorrhizae and Radix Salviae Miltiorrhizae charcoal.Conclusion：The thermal stability of salvianolic acid B is poor，and the thermal stability of salvianolic acid B can be increased to some extent through ethanol and acidic additives，which is worthy of clinical attention.
Keywords Radix Salviae Miltiorrhizae; Salvianolic acid B; Different processing methods; High performance liquid chromatography; Horizontal variation; Thermal stability
丹参属于常见的中草药之一，属于唇形科植物丹参的干燥根或根茎，多为春、秋二季采挖，具有活血化瘀、通经止痛、清心除烦以及凉血消痈的功效，主要用于胸痹心痛、脘腹胁痛、热痹疼痛、月经不调以及癓瘕积聚等的治疗中，效果显著[1-2]。中医学认为，丹参多以治疗心血管系统疾病为主，而现代药理学研究发现，丹参在抗炎、心肌保护、抗氧化、免疫调节以及抗肿瘤等方面均有一定的药理作用，其中主要成分囊括丹参酮ⅡA、丹酚酸以及丹参素等[3-4]。有研究报道显示，丹酚酸B属于丹参水溶性成分的重要代表，同时亦是丹参发挥药理学作用的物质基础，其含量的高低直接影响丹参的药效。中药加工是中药品质形成的重要环节，亦是影响临床用药的主要因素之一[5]。目前，关于丹参的炮制方式较多，主要可包括炒丹参、米炒丹参、丹参炭、酒丹参以及醋丹参等[6]。本研究通过研究对比炒丹参、米炒丹参、丹参炭、酒丹参以及醋丹参中的丹酚酸B含量差异，旨在明确不同炮制方式对丹参中丹酚酸B含量的影响，继而为丹参的炮制方式提供参考依据。
1 仪器与试药
1.1 仪器 电子天平（德国Sartorius公司，型号：BS124S），高效液相色谱仪（日本岛津公司，型号：Nexera Quaternary），薄层色谱成像仪（瑞士GAMAG公司，型号：REPROSTAR3），1/10万电子分析天平（德国Sartorius公司，型号R200D），GMB-20A系统连接器（上海祥树实业发展有限公司，型号：TSS6K），NANOMAT4型定量点样器（瑞士GAMAG公司，型号：Linomat-5），手动定量进样阀（杭州赛智公司，型号：7725i），二极管阵列检测器（上海玖梧公司，型号：SPD-M20A），柱温箱（购自日本岛津公司，型号：GTO-10AS），微量进样器（郑州克莱克特公司，型号：AS-2902-110通用型），LC solution工作软件（购自日本岛津公司，型号：LC-Solution）。
1.2 试剂 由中国药品生物制品鉴定所购入丹酚酸B对照品（批号11562-200907）。使用试剂中将甲醇作为色谱纯，水为超纯水，其与均为分析纯。本研究所用丹参均购自苏州市天灵中药饮片厂（批号：20180203），且符合2010年版《中华人民共和国药典》中所制定的质检合格相关标准。 1.3 分析样品 1）炒丹参的制备：采用文火炒丹参，直至其呈紫褐色为止，待其出现焦斑后取出放凉即可。2）丹参炭的制备：取丹参以武火炒至内外呈焦褐色为宜，随后取适量的凉水进行喷洒，取出丹参放凉即可。3）米炒丹参的制备：首先取适量的水对炒锅进行润湿处理，随后将适量的米撒贴在锅内，加热直至米冒烟时，将丹参倒入锅中，持续翻动，直至丹参片从红色转变为深紫色为止，出锅除去米粒，冷却后即可，制备过程中要求100 kg丹参片用米20 kg。4）酒丹参的制备：取丹参予以黄酒进行攪拌均匀，闷透，放置于锅内使用文火炒干，取出放凉即可，制备过程中要求100 kg丹参片用黄酒10 kg。5）醋丹参的制备：取丹参片加入适量的醋进行均匀搅拌，闷透。放置于锅内采用文火炒干，取出放凉即可，制备过程中要求100 kg丹参片用米醋10 kg。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 以乙腈-0.1%磷酸作为流动相，两者比例为21∶79，流速为1.0 mL/min，色谱柱为Kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），以室温作为柱温，检测波长设置为286 nm。
2.2 对照品溶液制备 采用电子天平精密称取丹酚酸B对照品共12.65 mg，将其放置于50 mL的量瓶中，加入甲醇直至刻度为止，晃荡均匀后获取253 mg/L的丹酚酸B对照品溶液。
2.3 供试品溶液制备 采用电子天平精密称取供试药粉0.500 g，加入25 mL浓度为75%的甲醇溶液，采用封口膜进行密封处理，超声处理30 min后放冷，通过0.45 μm的微孔滤膜进行滤过处理，即可获得供试品溶液。根据上述色谱条件可得到丹酚酸B色谱图以及丹参样品色谱图。见图1～2。
2.4 专属性试验 分别取适量的对照品溶液以及阴性对照品溶液混合，根据拟定色谱条件实施测定记录色谱图，结果证实，阴性对照无影响。
2.5 线性关系考察 精密吸取丹酚酸B对照品1，2，4，8，16，32依次进样，测定峰面积的积分值。将进样量作为横坐标，将色谱峰面积作为纵坐标，予以回归分析，可获得回归方程为Y=26 512.5+234 480.1X（r=1.000），结果提示了丹酚酸B于0.251～9.099 μg线性关系良好。
2.6 中间精密度试验 精密吸取丹酚酸B对照品10 μL，务必以上述色谱条件为准连续进样5次，获取丹酚酸B的峰面积，计算RSD为0.64%。
2.7 供试品溶液稳定性试验 精密吸取丹酚酸B对照品与供试品溶液10 μL，分别在0，2，4，8，16 h依次进样，测定峰面积，RSD分别为0.74%与0.87%。结果说明丹酚酸B对照品与供试品溶液在16 h内稳定性较佳。
2.8 重复性试验 遵从上述供试品的制备方式，分别制备5份丹参70%乙醇回流提取物供试品溶液，供试品溶液中丹酚酸B的含量平均值为6.255 0%，RSD为2.13%即表示本法的重复性良好。
2.9 回收率试验 精密称取上述5分丹参70%乙醇回流提取物药粉，每份为0.050 0 g，分别计入5，5，7.5，7.5以及10 mL，质量浓度为10.75 mg/L丹酚酸B对照品，加入甲醇不足溶液量至25 mL，根据上述供试品溶液的制备方式制备成供试品溶液，测量5份样品的平均加样回收率。
2.10 样品测定结果
分别精密吸取对照品溶液以及各供试品溶液20 L，依次进样测定，计算样品中丹酚酸B的含量。
2.10.1 丹参药材中丹酚酸B占加样回收率的测定结果
丹参药材的平均加样回收率为98.83%，RSD为1.34%。见表1。
2.10.2 丹参不同炮制品中丹酚酸B的含量测定结果
酒丹参炮制品中丹酚酸B的含量最高，醋丹参位列第2，其次按照醋丹酚酸B含量从高到低的顺序依次为生丹参、米炒丹参、炒丹参、丹参炭。见表2。
3 讨论
丹参的化学成分主要涵盖脂溶性有效成分、水溶性有效成分以及其他成分，而丹酚酸B是丹参最主要的水溶性有效成分，更是被《中华人民共和国药典》列为测定丹参含量的重要指标之一[7-8]。相关研究报道显示，丹酚酸B是丹参用于心血管疾病治疗中的重要药效物质基础成分，具有抗氧化、抗血栓形成、调血脂、细胞保护以及抗凝血等药理作用，同时可发挥保护心血管系统、肾脏、肝脏等系统器官以及抗肿瘤等药理作用[9-11]。丹参片是临床上应用较为广泛的丹参炮制品，《中华人民共和国药典》中明文规定其加工过程如下，首先去除杂质以及残茎，洗净润透后切厚片，并予以干燥处理。而在饮片炮制过程中，极易导致根皮中的水溶性有效成分丹酚酸B的损失，继而可能影响丹参炮制品的药效，不利于临床疾病的治疗，同时会大量浪费药材资源[12-15]。因此，寻找一种有效减少丹参炮制品中丹酚酸B损失的方式显得尤为重要，亦是目前临床广大医务人员共同关注的热点。
本研究结果显示，酒丹参炮制品中丹酚酸B的含量最高，醋丹参位列第二，其次按照醋丹酚酸B含量从高到低的顺序依次为生丹参、米炒丹参、炒丹参、丹参炭。这与相关研究报道相一致[16-18]，说明了酒丹参以及醋丹参中的丹酚酸B含量最高，可将其作为丹参炮制品制备的主要方式。分析原因，认为丹酚酸B主要是由3个分子的丹参素以及1个分子的咖啡酸结合形成，具有2个羧基，以不同的盐形式广泛存在，其中酯键的存在直接影响其于水溶液中的稳定性[19-21]。在对丹参进行煎煮以及浓缩的过程中，可能导致部分丹酚酸水解形成紫草酸以及丹参素，另有少部分丹参素可在酸性的条件下转变成迷迭香酸。现代药理学研究证实，丹酚酸B对温度的敏感性较高，而丹参提取液中的丹酚酸B含量与加热方式存在密切相关，其中不同的加热方式会对其造成差异性影响[22-24]。此外，丹酚酸B的含量在一定程度上受pH值、提取溶液剂以及缓冲盐浓度等因素的影响，其在1 参考文献
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（2019-04-20收稿 责任编辑：张雄杰）
关键词 丹参;丹酚酸B;差异性炮制方法;高效液相色谱法;水平变化;热稳定性
Abstract Objective：To study the change of different processing methods on salvianolic acid B in Radix Salviae Miltiorrhizae.Methods：The preparation of fried Radix Salviae Miltiorrhizae，Radix Salviae Miltiorrhizae charcoal，rice fried Radix Salviae Miltiorrhizae，wine Radix Salviae Miltiorrhizae and vinegar Radix Salviae Miltiorrhizae were carried out respectively.Subsequently，high-performance liquid chromatography was used to detect salvianolic acid B in various processed products of Radix Salviae Miltiorrhizae.Results：The content of salvianolic acid B in the processed products of wine Radix Salviae Miltiorrhizae was the highest，and that of vinegar Radix Salviae Miltiorrhizae was the second.According to the order of vinegar salvianolic acid B content from high to low was Radix Salviae Miltiorrhizae，rice fried Radix Salviae Miltiorrhizae，fried Radix Salviae Miltiorrhizae and Radix Salviae Miltiorrhizae charcoal.Conclusion：The thermal stability of salvianolic acid B is poor，and the thermal stability of salvianolic acid B can be increased to some extent through ethanol and acidic additives，which is worthy of clinical attention.
Keywords Radix Salviae Miltiorrhizae; Salvianolic acid B; Different processing methods; High performance liquid chromatography; Horizontal variation; Thermal stability
丹参属于常见的中草药之一，属于唇形科植物丹参的干燥根或根茎，多为春、秋二季采挖，具有活血化瘀、通经止痛、清心除烦以及凉血消痈的功效，主要用于胸痹心痛、脘腹胁痛、热痹疼痛、月经不调以及癓瘕积聚等的治疗中，效果显著[1-2]。中医学认为，丹参多以治疗心血管系统疾病为主，而现代药理学研究发现，丹参在抗炎、心肌保护、抗氧化、免疫调节以及抗肿瘤等方面均有一定的药理作用，其中主要成分囊括丹参酮ⅡA、丹酚酸以及丹参素等[3-4]。有研究报道显示，丹酚酸B属于丹参水溶性成分的重要代表，同时亦是丹参发挥药理学作用的物质基础，其含量的高低直接影响丹参的药效。中药加工是中药品质形成的重要环节，亦是影响临床用药的主要因素之一[5]。目前，关于丹参的炮制方式较多，主要可包括炒丹参、米炒丹参、丹参炭、酒丹参以及醋丹参等[6]。本研究通过研究对比炒丹参、米炒丹参、丹参炭、酒丹参以及醋丹参中的丹酚酸B含量差异，旨在明确不同炮制方式对丹参中丹酚酸B含量的影响，继而为丹参的炮制方式提供参考依据。
1 仪器与试药
1.1 仪器 电子天平（德国Sartorius公司，型号：BS124S），高效液相色谱仪（日本岛津公司，型号：Nexera Quaternary），薄层色谱成像仪（瑞士GAMAG公司，型号：REPROSTAR3），1/10万电子分析天平（德国Sartorius公司，型号R200D），GMB-20A系统连接器（上海祥树实业发展有限公司，型号：TSS6K），NANOMAT4型定量点样器（瑞士GAMAG公司，型号：Linomat-5），手动定量进样阀（杭州赛智公司，型号：7725i），二极管阵列检测器（上海玖梧公司，型号：SPD-M20A），柱温箱（购自日本岛津公司，型号：GTO-10AS），微量进样器（郑州克莱克特公司，型号：AS-2902-110通用型），LC solution工作软件（购自日本岛津公司，型号：LC-Solution）。
1.2 试剂 由中国药品生物制品鉴定所购入丹酚酸B对照品（批号11562-200907）。使用试剂中将甲醇作为色谱纯，水为超纯水，其与均为分析纯。本研究所用丹参均购自苏州市天灵中药饮片厂（批号：20180203），且符合2010年版《中华人民共和国药典》中所制定的质检合格相关标准。 1.3 分析样品 1）炒丹参的制备：采用文火炒丹参，直至其呈紫褐色为止，待其出现焦斑后取出放凉即可。2）丹参炭的制备：取丹参以武火炒至内外呈焦褐色为宜，随后取适量的凉水进行喷洒，取出丹参放凉即可。3）米炒丹参的制备：首先取适量的水对炒锅进行润湿处理，随后将适量的米撒贴在锅内，加热直至米冒烟时，将丹参倒入锅中，持续翻动，直至丹参片从红色转变为深紫色为止，出锅除去米粒，冷却后即可，制备过程中要求100 kg丹参片用米20 kg。4）酒丹参的制备：取丹参予以黄酒进行攪拌均匀，闷透，放置于锅内使用文火炒干，取出放凉即可，制备过程中要求100 kg丹参片用黄酒10 kg。5）醋丹参的制备：取丹参片加入适量的醋进行均匀搅拌，闷透。放置于锅内采用文火炒干，取出放凉即可，制备过程中要求100 kg丹参片用米醋10 kg。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 以乙腈-0.1%磷酸作为流动相，两者比例为21∶79，流速为1.0 mL/min，色谱柱为Kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），以室温作为柱温，检测波长设置为286 nm。
2.2 对照品溶液制备 采用电子天平精密称取丹酚酸B对照品共12.65 mg，将其放置于50 mL的量瓶中，加入甲醇直至刻度为止，晃荡均匀后获取253 mg/L的丹酚酸B对照品溶液。
2.3 供试品溶液制备 采用电子天平精密称取供试药粉0.500 g，加入25 mL浓度为75%的甲醇溶液，采用封口膜进行密封处理，超声处理30 min后放冷，通过0.45 μm的微孔滤膜进行滤过处理，即可获得供试品溶液。根据上述色谱条件可得到丹酚酸B色谱图以及丹参样品色谱图。见图1～2。
2.4 专属性试验 分别取适量的对照品溶液以及阴性对照品溶液混合，根据拟定色谱条件实施测定记录色谱图，结果证实，阴性对照无影响。
2.5 线性关系考察 精密吸取丹酚酸B对照品1，2，4，8，16，32依次进样，测定峰面积的积分值。将进样量作为横坐标，将色谱峰面积作为纵坐标，予以回归分析，可获得回归方程为Y=26 512.5+234 480.1X（r=1.000），结果提示了丹酚酸B于0.251～9.099 μg线性关系良好。
2.6 中间精密度试验 精密吸取丹酚酸B对照品10 μL，务必以上述色谱条件为准连续进样5次，获取丹酚酸B的峰面积，计算RSD为0.64%。
2.7 供试品溶液稳定性试验 精密吸取丹酚酸B对照品与供试品溶液10 μL，分别在0，2，4，8，16 h依次进样，测定峰面积，RSD分别为0.74%与0.87%。结果说明丹酚酸B对照品与供试品溶液在16 h内稳定性较佳。
2.8 重复性试验 遵从上述供试品的制备方式，分别制备5份丹参70%乙醇回流提取物供试品溶液，供试品溶液中丹酚酸B的含量平均值为6.255 0%，RSD为2.13%即表示本法的重复性良好。
2.9 回收率试验 精密称取上述5分丹参70%乙醇回流提取物药粉，每份为0.050 0 g，分别计入5，5，7.5，7.5以及10 mL，质量浓度为10.75 mg/L丹酚酸B对照品，加入甲醇不足溶液量至25 mL，根据上述供试品溶液的制备方式制备成供试品溶液，测量5份样品的平均加样回收率。
2.10 样品测定结果
分别精密吸取对照品溶液以及各供试品溶液20 L，依次进样测定，计算样品中丹酚酸B的含量。
2.10.1 丹参药材中丹酚酸B占加样回收率的测定结果
丹参药材的平均加样回收率为98.83%，RSD为1.34%。见表1。
2.10.2 丹参不同炮制品中丹酚酸B的含量测定结果
酒丹参炮制品中丹酚酸B的含量最高，醋丹参位列第2，其次按照醋丹酚酸B含量从高到低的顺序依次为生丹参、米炒丹参、炒丹参、丹参炭。见表2。
3 讨论
丹参的化学成分主要涵盖脂溶性有效成分、水溶性有效成分以及其他成分，而丹酚酸B是丹参最主要的水溶性有效成分，更是被《中华人民共和国药典》列为测定丹参含量的重要指标之一[7-8]。相关研究报道显示，丹酚酸B是丹参用于心血管疾病治疗中的重要药效物质基础成分，具有抗氧化、抗血栓形成、调血脂、细胞保护以及抗凝血等药理作用，同时可发挥保护心血管系统、肾脏、肝脏等系统器官以及抗肿瘤等药理作用[9-11]。丹参片是临床上应用较为广泛的丹参炮制品，《中华人民共和国药典》中明文规定其加工过程如下，首先去除杂质以及残茎，洗净润透后切厚片，并予以干燥处理。而在饮片炮制过程中，极易导致根皮中的水溶性有效成分丹酚酸B的损失，继而可能影响丹参炮制品的药效，不利于临床疾病的治疗，同时会大量浪费药材资源[12-15]。因此，寻找一种有效减少丹参炮制品中丹酚酸B损失的方式显得尤为重要，亦是目前临床广大医务人员共同关注的热点。
本研究结果显示，酒丹参炮制品中丹酚酸B的含量最高，醋丹参位列第二，其次按照醋丹酚酸B含量从高到低的顺序依次为生丹参、米炒丹参、炒丹参、丹参炭。这与相关研究报道相一致[16-18]，说明了酒丹参以及醋丹参中的丹酚酸B含量最高，可将其作为丹参炮制品制备的主要方式。分析原因，认为丹酚酸B主要是由3个分子的丹参素以及1个分子的咖啡酸结合形成，具有2个羧基，以不同的盐形式广泛存在，其中酯键的存在直接影响其于水溶液中的稳定性[19-21]。在对丹参进行煎煮以及浓缩的过程中，可能导致部分丹酚酸水解形成紫草酸以及丹参素，另有少部分丹参素可在酸性的条件下转变成迷迭香酸。现代药理学研究证实，丹酚酸B对温度的敏感性较高，而丹参提取液中的丹酚酸B含量与加热方式存在密切相关，其中不同的加热方式会对其造成差异性影响[22-24]。此外，丹酚酸B的含量在一定程度上受pH值、提取溶液剂以及缓冲盐浓度等因素的影响，其在1
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（2019-04-20收稿 责任编辑：张雄杰）