【摘 要】
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目的 构建靶向神经纤毛蛋白-1(NRP-1)基因的RNA干扰慢病毒表达载体[pLB-NRP-1/短发卡RNA(shRNA)],并观察其对人T淋巴瘤Jurkat细胞靶基因NRP-1的沉默效应.方法设计、合成3对人
【机 构】
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徐州医学院附属医院肿瘤科, 江苏,221000
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目的 构建靶向神经纤毛蛋白-1(NRP-1)基因的RNA干扰慢病毒表达载体[pLB-NRP-1/短发卡RNA(shRNA)],并观察其对人T淋巴瘤Jurkat细胞靶基因NRP-1的沉默效应.方法设计、合成3对人NRP-1的特异性干扰序列(NRP-1/shRNA1-3)和1对非特异性对照序列(NRP-1/shRNA4),分别亚克隆至经Hpa Ⅰ、Xho Ⅰ双酶切线性化的慢病毒载体pLB中,得到pLB-NRP-1/shRNA重组慢病毒质粒;经酶切和测序鉴定成功后,与包膜质粒pCMV△8.91、被摸蛋白质粒pMD.G重组并包装成为慢病毒表达载体;将其感染至Jurkat细胞;分选阳性细胞后应用荧光定量聚合酶链反应(PCR)和Western blot检测对NRP-1 mRNA和蛋白表达的沉默效应.结果 酶切和测序结果证实3个靶向NRP-1基因的慢病毒载体构建成功,包装成慢病毒滴度可达108 IU/ml;感染Jurkat细胞后,NRP-1 mRNA表达量分别下降了95.9％、92.3％、87.1％,NRP-1蛋白的表达量分别下降了33.8％、29.7％、17.9％,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05),shRNA1为最佳干扰靶序,pLB-NRP-1/shRNA1为最佳干扰靶序列慢病毒表达载体.结论 成功构建慢病毒表达载体可高效感染体外培养的人Jurkat细胞株,并可显著抑制靶基因NRP-1 mRNA和蛋白的表达.
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