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[摘要] 目的 探讨雌二醇（E2）对原代小胶质细胞铁相关蛋白表达的影响。
方法原代培养Wistar大鼠腹侧中脑的小胶质细胞，分离纯化后将细胞分为对照组和E2组，其中E2组培养液内加入E2（终浓度为10 nmol/L），对照组培养液内加入等体积的二甲基亚砜，两组作用时间均为24 h。采用蛋白质免疫印迹实验检测两组细胞二价金属离子转运蛋白1（DMT1）、膜铁转运蛋白1（FPN1）和铁调节蛋白1（IRP1）的表达。
结果与对照组相比，E2组细胞DMT1的表达水平显著增高（t=2.937，P<0.05），FPN1的表达水平显著降低（t=2.294，P<0.05）;两组IRP1的表达水平比较差异无显著性（P>0.05）。
结论10 nmol/L的E2可引起原代小胶质细胞DMT1的表达增加、FPN1的表达降低，且这种变化与IRP1调节无关。
[关键词] 雌二醇;小神经胶质细胞;转铁蛋白类;铁调节蛋白质1;铁
[中图分类号] R322.8
[文献标志码] A
[文章编号] 2096-5532（2019）01-0047-03
EFFECT OF ESTRADIOL ON EXPRESSION OF IRON-RELATED PROTEINS IN PRIMARY CULTURED MICROGLIAL CELLS
[WTBX]
LI Na， DU Chenchen， DONG Dong， XIE Junxia， WANG Jun
（Department of Physiology， Medical College of Qingdao University， Qingdao 266071， China）
[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the effect of estradiol （E2） on the expression of iron-related proteins in primary cultured microglial cells.
MethodsPrimary cultured microglial cells from the ventral midbrain of Wistar rats were divided into control group and E2 group after isolation and purification. The cells in the E2 group were treated with E2 at a final concentration of 10 nmol/L for 24 h and those in the control group were treated with an equal volume of dimethyl sulfoxide for 24 h. Western blot was used to measure the expression of divalent metal transporter 1 （DMT1）， ferroportin 1 （FPN1）， and iron regulatory protein 1 （IRP1） in cells.
ResultsCompared with the control group， the E2 group had significantly higher expression of DMT1 （t=2.937，P<0.05） and significantly lower expression of FPN1 （t=2.294，P<0.05）. There was no significant difference in the expression of IRP1 between the two groups （P>0.05）.
ConclusionE2 at a concentration of 10 nmol/L can increase the expression of DMT1 and reduce the expression of FPN1 in primary cultured microglial cells， which is not associated with IRP1 regulation.
[KEY WORDS]estradiol; microglia; transferrins; iron regulatory protein 1; iron
鐵是所有生命形式的基本要素，也是具有氧输送、电子转移、能量代谢、转录调节和DNA复制等多种功能蛋白的必要组成成分[1-3]。因此，维持机体内的铁稳态尤其重要。在阿尔兹海默病、肌萎缩侧索硬化症、多发性硬化症等慢性退行性疾病病人中均观察到铁代谢异常[4-6]。且有大量研究表明细胞内的铁沉积与帕金森病（PD）的发病密切相关[4，7-9]。小胶质细胞作为一种重要的神经胶质细胞，在脑功能方面发挥重要作用。研究表明，雌二醇（E2）可通过抑制小胶质细胞释放肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎症递质发挥抗炎作用[10-13]。本实验室前期研究显示，E2可降低原代培养腹侧中脑神经元二价金属离子转运蛋白1（DMT1）的表达，增加膜铁转运蛋白1（FPN1）的表达，这可能与铁调节蛋白1（IRP1）表达降低有关[14]。然而，E2是否影响小胶质细胞铁代谢仍不清楚。因此，本研究观察了E2对原代小胶质细胞DMT1和FPN1表达的影响，并分析其表达变化是否与IRP1的异常调节有关。 1 材料与方法
1.1 小胶质细胞的原代培养与分离纯化
1.1.1小胶质细胞的原代培养 出生24 h内的Wistar大鼠（由青岛市药检所动物中心提供）用体积分数0.75乙醇消毒5 min，在超净工作台（苏州净化，江苏）上开颅取脑，快速剥除脑膜及血管，取腹侧中脑组织置于装有适量DMEM/F12培养基（Hyclone公司，美国）的培养皿中，用移液枪和10 mL一次性注射器反复吹打均匀至无大组织颗粒，移至50 mL大离心管中并用低速离心机（中科中佳科学仪器有限公司，安徽）以1 000 r/min离心5 min，弃上清，在沉淀物中加入含有体积分数0.10胎牛血清（Gibco公司，美国）、10 g/L青/链霉素（Solarbio公司，美国）的培养液，重新吹打均匀接种于250 cm2培养瓶中，在37 ℃、含体积分数0.05 CO2的培养箱（Thermo Electron Corporation公司，美國）中倒置培养30 min，随后正置继续培养。第2天半量换液1次，第3天全量换液1次，所换液体均为DMEM/F12全培养液。继续培养至第7天，细胞可铺满瓶底并充分分层生长。
1.1.2小胶质细胞的分离纯化 细胞培养至第7天，更换DMEM/F12全培养液，随后将培养瓶置于37 ℃恒温摇床（东明医疗仪器厂，哈尔滨）中并以180 r/min振摇2 h，收集细胞悬液于50 mL大离心管中，用低速离心机以1 000 r/min离心5 min，去上清，沉淀物用新的DMEM/F12全培养液吹打成细胞悬液，将细胞密度调至约5×105/L，种植到至少提前4 h铺好Poly-D-lysine（Sigma公司，美国）的6孔板内，每孔1 mL。在37 ℃、含体积分数0.05 CO2的培养箱内静置30 min后完全换液1次，加入新的DMEM/FI2完全培养液继续培养1 d。一般板内细胞培养1 d后即可加药，加药前所有孔内培养液换为无血清DMEM/F12培养液。
1.2 实验分组
分离纯化后将细胞分为对照组和E2组，E2组细胞培养液内加入1 μmol/L的E2 10 μL（E2的终浓度为10 nmol/L），对照组细胞培养液内加入等体积的二甲基亚砜，孵育24 h后提取细胞内总蛋白。
1.3 蛋白质免疫印迹实验检测铁相关蛋白表达
提取两组原代小胶质细胞蛋白，用BCA蛋白定量试剂盒（碧云天，江苏）检测蛋白浓度。根据蛋白浓度计算每个样本的上样量。配制分离胶和浓缩胶，两组原代小胶质细胞蛋白经80 V、30 min和120 V、 60 min电泳，300 mA、100 min转膜，100 g/L脱脂奶粉2 h封闭，再分别加入兔抗小鼠单克隆一抗DMT1（Origen公司，美国，1∶800）、兔抗人单克隆一抗FPN1（Sigma公司，美国，1∶800）和兔抗鼠单克隆一抗IRP1（ADI公司，美国，1∶1 000），4 ℃振摇过夜。用TBST洗3次，每次10 min，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗（Absin公司，上海，1∶10 000）在室温下孵育1 h，用TBST再洗涤3次，每次10 min。通过化学发光液进行显影，使用Image J软件分析条带灰度值。以β-actin为内参，以目的蛋白与内参β-actin比值来反映各目的蛋白表达情况。
1.4 统计学分析
所得计量资料数据以[AKx-D]±s表示，采用SPSS 20.0软件、两样本t检验进行统计学处理，以P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结 果
E2组DMT1蛋白表达水平明显高于对照组（t=2.937，P<0.05），FPN1蛋白表达水平明显低于对照组（t=2.294，P<0.05）;两组IRP1的表达水平比较差异无显著性（P>0.05）。见表1。
3 讨 论
铁相关蛋白调节细胞铁摄取和释放，在维持机体内环境稳态方面起到重要作用。DMT1是哺乳类动物中第一个被发现的跨膜铁转运蛋白，它参与二价铁转运，在细胞铁摄取方面起到了至关重要的作用[15]。DMT1广泛分布于人体各组织中，在脑内的中脑黑质区DMT1呈高水平表达[16]。已有研究证实，PD病人脑黑质区DMT1表达异常增高[17]。FPN1是目前已知的唯一具有细胞转出铁功能的转运蛋白[18]。它作为跨膜转运蛋白，主要控制巨噬细胞和其他细胞的铁释放[19-20]。IRPs控制细胞铁的摄取、贮存与释放，在脑铁平衡中起重要作用。在大多数哺乳动物细胞中，IRP1含量远高于IRP2[21]，而且IRP1与铁反应元件（IRE）的结合能力也大于IRP2[22]。IRP1作为细胞铁代谢转录后调节最主要的调节器，它通过与DMT1和FPN1 mRNA中的IRE结合[22]，上调DMT1的表达，下调FPN1的表达，从而调节铁代谢[23]。本实验室前期研究已证实，在6-羟基多巴胺诱导的PD动物模型和细胞模型中，细胞内的铁沉积与DMT1的上调和FPN1的下调有关，且DMT1的上调和FPN1的下调依赖于IRE/IRP1的调节[24]。
有研究显示，E2可引起小鼠骨髓来源的巨噬细胞内的铁蛋白增加，FPN表达减少[25]。且E2可逆
转由卵巢切除术引起的脂肪组织细胞内IRP1结合活性的降低[26]。本室前期研究证实，E2可降低原代培养的中脑神经元DMT1表达，增加FPN1表达，这可能与IRP1表达降低有关[14]。而本实验研究结果显示，10 nmol/L的E2可增加原代培养小胶质细胞DMT1的表达，降低FPN1的表达，而这种变化可能与IRP1的调节无关，其具体机制有待进一步研究探讨。 [参考文献]
[1]SHEFTEL A， STEHLING O， LILL R. Iron-sulfur proteins in health and disease[J]. Trends in Endocrinology and Metabolism， 2010，21（5）：302-314.
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[3]EVSTATIEV R， GASCHE C. Iron sensing and signalling[J]. Gut， 2012，61（6）：933-952.
[4]KELL D B. Towards a unifying， systems biology understanding of large-scale cellular death and destruction caused by poorly liganded Iron：Parkinson’s， Huntington’s， Alzheimer’s， prions， bactericides， chemical toxicology and others as examples[J]. Archives of Toxicology， 2010，84（11）：825-889.
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结果与对照组相比，E2组细胞DMT1的表达水平显著增高（t=2.937，P<0.05），FPN1的表达水平显著降低（t=2.294，P<0.05）;两组IRP1的表达水平比较差异无显著性（P>0.05）。
结论10 nmol/L的E2可引起原代小胶质细胞DMT1的表达增加、FPN1的表达降低，且这种变化与IRP1调节无关。
[关键词] 雌二醇;小神经胶质细胞;转铁蛋白类;铁调节蛋白质1;铁
[中图分类号] R322.8
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MethodsPrimary cultured microglial cells from the ventral midbrain of Wistar rats were divided into control group and E2 group after isolation and purification. The cells in the E2 group were treated with E2 at a final concentration of 10 nmol/L for 24 h and those in the control group were treated with an equal volume of dimethyl sulfoxide for 24 h. Western blot was used to measure the expression of divalent metal transporter 1 （DMT1）， ferroportin 1 （FPN1）， and iron regulatory protein 1 （IRP1） in cells.
ResultsCompared with the control group， the E2 group had significantly higher expression of DMT1 （t=2.937，P<0.05） and significantly lower expression of FPN1 （t=2.294，P<0.05）. There was no significant difference in the expression of IRP1 between the two groups （P>0.05）.
ConclusionE2 at a concentration of 10 nmol/L can increase the expression of DMT1 and reduce the expression of FPN1 in primary cultured microglial cells， which is not associated with IRP1 regulation.
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鐵是所有生命形式的基本要素，也是具有氧输送、电子转移、能量代谢、转录调节和DNA复制等多种功能蛋白的必要组成成分[1-3]。因此，维持机体内的铁稳态尤其重要。在阿尔兹海默病、肌萎缩侧索硬化症、多发性硬化症等慢性退行性疾病病人中均观察到铁代谢异常[4-6]。且有大量研究表明细胞内的铁沉积与帕金森病（PD）的发病密切相关[4，7-9]。小胶质细胞作为一种重要的神经胶质细胞，在脑功能方面发挥重要作用。研究表明，雌二醇（E2）可通过抑制小胶质细胞释放肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎症递质发挥抗炎作用[10-13]。本实验室前期研究显示，E2可降低原代培养腹侧中脑神经元二价金属离子转运蛋白1（DMT1）的表达，增加膜铁转运蛋白1（FPN1）的表达，这可能与铁调节蛋白1（IRP1）表达降低有关[14]。然而，E2是否影响小胶质细胞铁代谢仍不清楚。因此，本研究观察了E2对原代小胶质细胞DMT1和FPN1表达的影响，并分析其表达变化是否与IRP1的异常调节有关。 1 材料与方法
1.1 小胶质细胞的原代培养与分离纯化
1.1.1小胶质细胞的原代培养 出生24 h内的Wistar大鼠（由青岛市药检所动物中心提供）用体积分数0.75乙醇消毒5 min，在超净工作台（苏州净化，江苏）上开颅取脑，快速剥除脑膜及血管，取腹侧中脑组织置于装有适量DMEM/F12培养基（Hyclone公司，美国）的培养皿中，用移液枪和10 mL一次性注射器反复吹打均匀至无大组织颗粒，移至50 mL大离心管中并用低速离心机（中科中佳科学仪器有限公司，安徽）以1 000 r/min离心5 min，弃上清，在沉淀物中加入含有体积分数0.10胎牛血清（Gibco公司，美国）、10 g/L青/链霉素（Solarbio公司，美国）的培养液，重新吹打均匀接种于250 cm2培养瓶中，在37 ℃、含体积分数0.05 CO2的培养箱（Thermo Electron Corporation公司，美國）中倒置培养30 min，随后正置继续培养。第2天半量换液1次，第3天全量换液1次，所换液体均为DMEM/F12全培养液。继续培养至第7天，细胞可铺满瓶底并充分分层生长。
1.1.2小胶质细胞的分离纯化 细胞培养至第7天，更换DMEM/F12全培养液，随后将培养瓶置于37 ℃恒温摇床（东明医疗仪器厂，哈尔滨）中并以180 r/min振摇2 h，收集细胞悬液于50 mL大离心管中，用低速离心机以1 000 r/min离心5 min，去上清，沉淀物用新的DMEM/F12全培养液吹打成细胞悬液，将细胞密度调至约5×105/L，种植到至少提前4 h铺好Poly-D-lysine（Sigma公司，美国）的6孔板内，每孔1 mL。在37 ℃、含体积分数0.05 CO2的培养箱内静置30 min后完全换液1次，加入新的DMEM/FI2完全培养液继续培养1 d。一般板内细胞培养1 d后即可加药，加药前所有孔内培养液换为无血清DMEM/F12培养液。
1.2 实验分组
分离纯化后将细胞分为对照组和E2组，E2组细胞培养液内加入1 μmol/L的E2 10 μL（E2的终浓度为10 nmol/L），对照组细胞培养液内加入等体积的二甲基亚砜，孵育24 h后提取细胞内总蛋白。
1.3 蛋白质免疫印迹实验检测铁相关蛋白表达
提取两组原代小胶质细胞蛋白，用BCA蛋白定量试剂盒（碧云天，江苏）检测蛋白浓度。根据蛋白浓度计算每个样本的上样量。配制分离胶和浓缩胶，两组原代小胶质细胞蛋白经80 V、30 min和120 V、 60 min电泳，300 mA、100 min转膜，100 g/L脱脂奶粉2 h封闭，再分别加入兔抗小鼠单克隆一抗DMT1（Origen公司，美国，1∶800）、兔抗人单克隆一抗FPN1（Sigma公司，美国，1∶800）和兔抗鼠单克隆一抗IRP1（ADI公司，美国，1∶1 000），4 ℃振摇过夜。用TBST洗3次，每次10 min，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗（Absin公司，上海，1∶10 000）在室温下孵育1 h，用TBST再洗涤3次，每次10 min。通过化学发光液进行显影，使用Image J软件分析条带灰度值。以β-actin为内参，以目的蛋白与内参β-actin比值来反映各目的蛋白表达情况。
1.4 统计学分析
所得计量资料数据以[AKx-D]±s表示，采用SPSS 20.0软件、两样本t检验进行统计学处理，以P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结 果
E2组DMT1蛋白表达水平明显高于对照组（t=2.937，P<0.05），FPN1蛋白表达水平明显低于对照组（t=2.294，P<0.05）;两组IRP1的表达水平比较差异无显著性（P>0.05）。见表1。
3 讨 论
铁相关蛋白调节细胞铁摄取和释放，在维持机体内环境稳态方面起到重要作用。DMT1是哺乳类动物中第一个被发现的跨膜铁转运蛋白，它参与二价铁转运，在细胞铁摄取方面起到了至关重要的作用[15]。DMT1广泛分布于人体各组织中，在脑内的中脑黑质区DMT1呈高水平表达[16]。已有研究证实，PD病人脑黑质区DMT1表达异常增高[17]。FPN1是目前已知的唯一具有细胞转出铁功能的转运蛋白[18]。它作为跨膜转运蛋白，主要控制巨噬细胞和其他细胞的铁释放[19-20]。IRPs控制细胞铁的摄取、贮存与释放，在脑铁平衡中起重要作用。在大多数哺乳动物细胞中，IRP1含量远高于IRP2[21]，而且IRP1与铁反应元件（IRE）的结合能力也大于IRP2[22]。IRP1作为细胞铁代谢转录后调节最主要的调节器，它通过与DMT1和FPN1 mRNA中的IRE结合[22]，上调DMT1的表达，下调FPN1的表达，从而调节铁代谢[23]。本实验室前期研究已证实，在6-羟基多巴胺诱导的PD动物模型和细胞模型中，细胞内的铁沉积与DMT1的上调和FPN1的下调有关，且DMT1的上调和FPN1的下调依赖于IRE/IRP1的调节[24]。
有研究显示，E2可引起小鼠骨髓来源的巨噬细胞内的铁蛋白增加，FPN表达减少[25]。且E2可逆
转由卵巢切除术引起的脂肪组织细胞内IRP1结合活性的降低[26]。本室前期研究证实，E2可降低原代培养的中脑神经元DMT1表达，增加FPN1表达，这可能与IRP1表达降低有关[14]。而本实验研究结果显示，10 nmol/L的E2可增加原代培养小胶质细胞DMT1的表达，降低FPN1的表达，而这种变化可能与IRP1的调节无关，其具体机制有待进一步研究探讨。 [参考文献]
[1]SHEFTEL A， STEHLING O， LILL R. Iron-sulfur proteins in health and disease[J]. Trends in Endocrinology and Metabolism， 2010，21（5）：302-314.
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