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摘要
[目的]为了验证红松种鳞多酚二次纯化及抗氧化特性。[方法]采用聚酰胺层析柱法对经AB8树脂纯化后的红松种鳞多酚纯化液进行二次纯化，并且测定其DPPH自由基清除率、总还原能力。[结果]通过正交试验分析，得到聚酰胺二次纯化的最优条件为：聚酰胺树脂30～60目、上样pH 5、吸附时间1 h、洗脱液为乙醇、上样量2 BV、洗脱浓度70%、洗脱pH 7。在此工艺下，多酚的纯度可达62%±2%。二次纯化后的多酚清除DPPH自由基的IC50值为10.94 μg/ml，总还原能力与VC的相似且略高于一次纯化的多酚液。[结论]红松种鳞二次纯化多酚纯度约为一次纯化多酚的2倍，且具有抗氧化特性。
关键词 红松；多酚；二次纯化；抗氧化
中图分类号 S791.247 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）26-08879-05
Korean Pine Species of Scale Secondary Purification Process of Polyphenols and Oxidation Resistance
FU Qun， WANG Zhenyu et al
（School of Forestry， Northeast Forestry University， Herbin， Heilongjiang 150040； School of Food Science and Engineering， Herbin Institute of Technology， Herbin， Heilongjiang 150001）
Abstract [Objective]The research aimed to test and verify secondary purification and antioxidant properties of Korean pine scale polyphenols. [Method]By polyamide column chromatography method for AB8 resin purification of Korean pine scale polyphenols， liquid after secondary purification was purified， and DPPH free radical clearance rate and the total reducing power were determined. [Result] Polyamide was obtained by the orthogonal experiment analysis. The optimal conditions for secondary purification was as follows： 30 to 60 mesh polyamide resin， sample pH 5， adsorption time1 h， eluent for ethanol 2 BV on sample amount， elution concentration 70%， elution pH 7. In this process， the purity of polyphenols was up to 62%±2%. IC50 value of secondary purified polyphenols removal DPPH free radical was 10.94 μg/ml， total reducing power was similar to VC and slightly higher than the fluid of a purified polyphenols. [Conclusion] Korean pine species of scale secondary purified polyphenols purity was about 2 times a purified polyphenols， and had antioxidant properties.
Key words Korean pine；Polyphenols；Secondary purification；Antioxidant activity
随着社会的持续发展，人们生活节奏的加快，环境污染日益严重，人们的患病几率大幅度增加。郑晶泉[1]在抗氧化剂抗氧化试验研究进展中提到，大多数疾病的发生均与自由基有关，如衰老、心脑血管病、类风湿、癌症、帕金森症、关节炎等。多数研究表明，抗氧化物质可以有效地抵消自由基对人体造成的损伤[2]。因此，人们对抗氧化剂的关注度不断加强。目前合成的食品抗氧化剂已被广泛应用于食品的生产、保藏，同时人们对这类合成抗氧化剂毒副作用堪忧[3]。因此，从天然食材中寻找安全的天然抗氧化物质成为了研究热点。天然抗氧化剂主要来源于植物多酚。而Petkovsek等[4]研究表明，多酚的抗氧化特性與其含量、种类有关。
聚酰胺是一类通过聚酰胺基聚合而成的高分子化合物[5]。其物理性质较稳定，操作方便，可循环利用，成本较低，污染较小，因此在分离纯化多酚类、黄酮类、汞、醌等物质上被广泛运用。杨武英等[6]通过聚酰胺精纯得到纯度为81.34%的青钱柳黄酮，纯度比粗提品提高6.14倍，且黄酮含量高，具有安全性。
1 材料与方法
1.1 试验材料
红松种鳞采自长白山；聚酰胺，购自浙江省台州市路桥四甲生化塑料；DPPH（ALDrich公司）；无水乙醇，购自天津市东丽区天大化学试剂。 1.2.4
红松种鳞多酚抗氧化研究。
1.2.4.1
清除DPPH·试验。以VC作为阳性对照，1 ml蒸馏水与3 ml无水乙醇混合液为空白对照。制备 0.10 mmol/L DPPH·无水乙醇溶液，取3 ml DPPH·溶液，加入1 ml不同浓度多酚样液，室温下反应30 min后在519 nm处测吸光度，读数为A1；取3 ml无水乙醇溶液，加入1 ml多酚样液，室温下在519 nm处测吸光值，读数为A2；取3.00 ml DPPH·溶液，加入1 ml无水乙醇，在519 nm处测吸光度，读数为A0。
DPPH·清除率=1-
1.2.4.2
总还原力的测定。以VC作为阳性对照，取不同浓度样品的溶液1 ml，立即加入1 ml 0.2 mol/L磷酸盐缓冲溶液（pH 6.6）和1 ml浓度1%铁氰化钾。将混合物放置在50 ℃的水浴锅中保温20 min，添加1 ml浓度10%三氯乙酸，将混合物在室温下3 500 r/min离心10 min，吸取1 ml上清液，加入6 ml蒸馏水和0.5 ml浓度0.1%三氯化铁，混匀后反应10 min。用分光光度计在700 nm下测得反应物的吸光值，空白以蒸馏水代替样液。吸光值和还原能力呈正比。以吸光值为结果，比较还原能力。
2 结果与分析
2.1 红松种鳞多酚二次纯化工艺条件的优化
2.1.1
红松种鳞多酚二次纯化静态试验。
2.1.1.1
不同型號聚酰胺树脂的筛选。由表1可知，随着聚酰胺目数的增大，吸附量增大，而洗脱率、纯度则反之。这是由于随着聚酰胺目数的增大，其与料液接触的面积也相应增加，因此其吸附量呈上升趋势；但是，由于目数越大，单个聚酰胺分子对多酚的吸附就越紧密，导致洗脱较困难，且目数较大的聚酰胺中含有较细的聚酰胺粉末，易随洗脱液一同流出，影响多酚的纯度；目数越大的聚酰胺树脂越难进行预处理。因此，综合考虑，应选30～60目聚酰胺作为该次试验的柱层析树脂。
2.1.1.2
吸附时间对多酚吸附量的影响。 通过聚酰胺静态吸附试验，每半个小时测定一次多酚含量，得出吸附时间与多酚吸附量的关系。由图1可知，随着时间的增加，聚酰胺对一次纯化液的吸附量也增加，且吸附速率较快，当吸附时间为1.5 h时达到吸附饱和。考虑到缩短吸附时间有利于缩短工业生产周期、提高生产效率，且1.0、1.5 h的吸附量相差不大，在进行柱层析时选择1.0 h为最佳吸附时间。该结果与吴新荣等[8]在聚酰胺颗粒分离纯化土茯苓总黄酮研究中对静态吸附时间的试验结果相符合，其试验的最佳吸附时间为1～2 h。
化学合成药的分离纯化成本一般是合成反应成本费用的1～2倍，且不同的分离提取方法对多酚的有效成分的影响不同。由此可见，分离提取是产品生产合格的重要保障。因此，研究和改善分离提取方法，对于产品质量的提高及发挥具有相当重要的作用。
该研究以AB8大孔吸附树脂将红松种鳞多酚提取物进行一次纯化后，采用聚酰胺以层析柱法，对红松种鳞多酚的一次纯化物进行二次纯化，分别考察聚酰胺树脂型号、上样pH、吸附时间、洗脱液、上样量、洗脱浓度、洗脱pH对纯化效果的影响。通过正交试验优化二次纯化的工艺条件，得到的最佳工艺条件为：聚酰胺树脂型号为30～60目、上样pH 5、吸附时间1 h、洗脱液为乙醇、上样量2 BV、解吸浓度70%、解吸pH 7。试验结果表明，聚酰胺柱层析对多酚的二次纯化具有显著的效果，可使纯度由粗提时的12%±3%提高到62%±2%，为多酚单体的获得奠定基础，同时为抗氧化产品的开发提供较优原料。
参考文献
[1]
郑晶泉.抗氧化剂抗氧化实验研究进展[J].国外医学：卫生学分册，2000，27（1）：37-40.
[2] 宋怀恩，闻韧.抗氧化剂筛选方法的研究进展[J].中国药物化学杂志，2003，13（2）：13-15.
[3] SOOBRATTEE M A，NEERGHEEN V S，LUXIMONRAMMA A，et al.Phenolics as potential antioxidant therapeutic agents： mechanism and actions[J].Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis，2005，579（1/2）：200-213.
[4] PETKOVSEK M M，SLATNAR A，STAMPAR F，et al.The influence of organic/integrated production on the content of phenolic compounds in apple leaves and fruits in four different varieties over a 2year period[J].Journal of the Science of Food and Agriculture，2010，90（14）：2366-2378.
[5] 薛扬，吴唯.聚酰胺树脂的层析分离应用[J].化工新型材料，2005，33（4）：50-53.
[6] 杨武英，上官新晨，徐明生，等.聚酰胺树脂精制青钱柳黄酮的研究[J].天然产物研究与开发，2008，20（2）：320-324.
[7] 向丽，周铁军，叶迎春，等.青果多酚超声波醇提工艺条件的研究[J].安徽农业科学，1012，40（2）：772-774.
[8] 吴新荣，刘志刚，颜仁梁，等.聚酰胺颗粒分离纯化土茯苓总黄酮研究[J].中药材，2009，32（10）：1606-1609.
[9] 蔡凌云，黎云祥，石凤湘，等.白簕叶总黄酮的聚酰胺树脂纯化工艺[J].时珍国医国药，2011，22（4）：926-929.
[10] 张伟，葛志强，蒋建兰.聚酰胺树脂分离纯化复方山楂提取物中总黄酮的研究[J].中草药，2009，40（1）：63-66.
[11] 王克勤，严志慧，罗军武，等.聚酰胺树脂分离纯化芹菜黄酮的工艺研究[J].食品与机械，2009，25（3）：46-50.
[12] 贾薇，陈家仪，曾元儿，等.聚酰胺纯化枳实总黄酮的工艺研究[J].中药新药与临床药理，2012，23（5）：586-588.
[13] 蔡凌云，黎云祥，石凤湘，等.白簕叶总黄酮的聚酰胺树脂纯化工艺[J].时珍国医国药，2011，22（4）：926-929.
[14] 李厚全，陈磊，宋洪涛，等.聚酰胺纯化白背三七总黄酮的研究[J].中国药师，2010，13（2）：172-175.
[目的]为了验证红松种鳞多酚二次纯化及抗氧化特性。[方法]采用聚酰胺层析柱法对经AB8树脂纯化后的红松种鳞多酚纯化液进行二次纯化，并且测定其DPPH自由基清除率、总还原能力。[结果]通过正交试验分析，得到聚酰胺二次纯化的最优条件为：聚酰胺树脂30～60目、上样pH 5、吸附时间1 h、洗脱液为乙醇、上样量2 BV、洗脱浓度70%、洗脱pH 7。在此工艺下，多酚的纯度可达62%±2%。二次纯化后的多酚清除DPPH自由基的IC50值为10.94 μg/ml，总还原能力与VC的相似且略高于一次纯化的多酚液。[结论]红松种鳞二次纯化多酚纯度约为一次纯化多酚的2倍，且具有抗氧化特性。
关键词 红松；多酚；二次纯化；抗氧化
中图分类号 S791.247 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）26-08879-05
Korean Pine Species of Scale Secondary Purification Process of Polyphenols and Oxidation Resistance
FU Qun， WANG Zhenyu et al
（School of Forestry， Northeast Forestry University， Herbin， Heilongjiang 150040； School of Food Science and Engineering， Herbin Institute of Technology， Herbin， Heilongjiang 150001）
Abstract [Objective]The research aimed to test and verify secondary purification and antioxidant properties of Korean pine scale polyphenols. [Method]By polyamide column chromatography method for AB8 resin purification of Korean pine scale polyphenols， liquid after secondary purification was purified， and DPPH free radical clearance rate and the total reducing power were determined. [Result] Polyamide was obtained by the orthogonal experiment analysis. The optimal conditions for secondary purification was as follows： 30 to 60 mesh polyamide resin， sample pH 5， adsorption time1 h， eluent for ethanol 2 BV on sample amount， elution concentration 70%， elution pH 7. In this process， the purity of polyphenols was up to 62%±2%. IC50 value of secondary purified polyphenols removal DPPH free radical was 10.94 μg/ml， total reducing power was similar to VC and slightly higher than the fluid of a purified polyphenols. [Conclusion] Korean pine species of scale secondary purified polyphenols purity was about 2 times a purified polyphenols， and had antioxidant properties.
Key words Korean pine；Polyphenols；Secondary purification；Antioxidant activity
随着社会的持续发展，人们生活节奏的加快，环境污染日益严重，人们的患病几率大幅度增加。郑晶泉[1]在抗氧化剂抗氧化试验研究进展中提到，大多数疾病的发生均与自由基有关，如衰老、心脑血管病、类风湿、癌症、帕金森症、关节炎等。多数研究表明，抗氧化物质可以有效地抵消自由基对人体造成的损伤[2]。因此，人们对抗氧化剂的关注度不断加强。目前合成的食品抗氧化剂已被广泛应用于食品的生产、保藏，同时人们对这类合成抗氧化剂毒副作用堪忧[3]。因此，从天然食材中寻找安全的天然抗氧化物质成为了研究热点。天然抗氧化剂主要来源于植物多酚。而Petkovsek等[4]研究表明，多酚的抗氧化特性與其含量、种类有关。
聚酰胺是一类通过聚酰胺基聚合而成的高分子化合物[5]。其物理性质较稳定，操作方便，可循环利用，成本较低，污染较小，因此在分离纯化多酚类、黄酮类、汞、醌等物质上被广泛运用。杨武英等[6]通过聚酰胺精纯得到纯度为81.34%的青钱柳黄酮，纯度比粗提品提高6.14倍，且黄酮含量高，具有安全性。
1 材料与方法
1.1 试验材料
红松种鳞采自长白山；聚酰胺，购自浙江省台州市路桥四甲生化塑料；DPPH（ALDrich公司）；无水乙醇，购自天津市东丽区天大化学试剂。 1.2.4
红松种鳞多酚抗氧化研究。
1.2.4.1
清除DPPH·试验。以VC作为阳性对照，1 ml蒸馏水与3 ml无水乙醇混合液为空白对照。制备 0.10 mmol/L DPPH·无水乙醇溶液，取3 ml DPPH·溶液，加入1 ml不同浓度多酚样液，室温下反应30 min后在519 nm处测吸光度，读数为A1；取3 ml无水乙醇溶液，加入1 ml多酚样液，室温下在519 nm处测吸光值，读数为A2；取3.00 ml DPPH·溶液，加入1 ml无水乙醇，在519 nm处测吸光度，读数为A0。
DPPH·清除率=1-
1.2.4.2
总还原力的测定。以VC作为阳性对照，取不同浓度样品的溶液1 ml，立即加入1 ml 0.2 mol/L磷酸盐缓冲溶液（pH 6.6）和1 ml浓度1%铁氰化钾。将混合物放置在50 ℃的水浴锅中保温20 min，添加1 ml浓度10%三氯乙酸，将混合物在室温下3 500 r/min离心10 min，吸取1 ml上清液，加入6 ml蒸馏水和0.5 ml浓度0.1%三氯化铁，混匀后反应10 min。用分光光度计在700 nm下测得反应物的吸光值，空白以蒸馏水代替样液。吸光值和还原能力呈正比。以吸光值为结果，比较还原能力。
2 结果与分析
2.1 红松种鳞多酚二次纯化工艺条件的优化
2.1.1
红松种鳞多酚二次纯化静态试验。
2.1.1.1
不同型號聚酰胺树脂的筛选。由表1可知，随着聚酰胺目数的增大，吸附量增大，而洗脱率、纯度则反之。这是由于随着聚酰胺目数的增大，其与料液接触的面积也相应增加，因此其吸附量呈上升趋势；但是，由于目数越大，单个聚酰胺分子对多酚的吸附就越紧密，导致洗脱较困难，且目数较大的聚酰胺中含有较细的聚酰胺粉末，易随洗脱液一同流出，影响多酚的纯度；目数越大的聚酰胺树脂越难进行预处理。因此，综合考虑，应选30～60目聚酰胺作为该次试验的柱层析树脂。
2.1.1.2
吸附时间对多酚吸附量的影响。 通过聚酰胺静态吸附试验，每半个小时测定一次多酚含量，得出吸附时间与多酚吸附量的关系。由图1可知，随着时间的增加，聚酰胺对一次纯化液的吸附量也增加，且吸附速率较快，当吸附时间为1.5 h时达到吸附饱和。考虑到缩短吸附时间有利于缩短工业生产周期、提高生产效率，且1.0、1.5 h的吸附量相差不大，在进行柱层析时选择1.0 h为最佳吸附时间。该结果与吴新荣等[8]在聚酰胺颗粒分离纯化土茯苓总黄酮研究中对静态吸附时间的试验结果相符合，其试验的最佳吸附时间为1～2 h。
化学合成药的分离纯化成本一般是合成反应成本费用的1～2倍，且不同的分离提取方法对多酚的有效成分的影响不同。由此可见，分离提取是产品生产合格的重要保障。因此，研究和改善分离提取方法，对于产品质量的提高及发挥具有相当重要的作用。
该研究以AB8大孔吸附树脂将红松种鳞多酚提取物进行一次纯化后，采用聚酰胺以层析柱法，对红松种鳞多酚的一次纯化物进行二次纯化，分别考察聚酰胺树脂型号、上样pH、吸附时间、洗脱液、上样量、洗脱浓度、洗脱pH对纯化效果的影响。通过正交试验优化二次纯化的工艺条件，得到的最佳工艺条件为：聚酰胺树脂型号为30～60目、上样pH 5、吸附时间1 h、洗脱液为乙醇、上样量2 BV、解吸浓度70%、解吸pH 7。试验结果表明，聚酰胺柱层析对多酚的二次纯化具有显著的效果，可使纯度由粗提时的12%±3%提高到62%±2%，为多酚单体的获得奠定基础，同时为抗氧化产品的开发提供较优原料。
参考文献
[1]
郑晶泉.抗氧化剂抗氧化实验研究进展[J].国外医学：卫生学分册，2000，27（1）：37-40.
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[3] SOOBRATTEE M A，NEERGHEEN V S，LUXIMONRAMMA A，et al.Phenolics as potential antioxidant therapeutic agents： mechanism and actions[J].Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis，2005，579（1/2）：200-213.
[4] PETKOVSEK M M，SLATNAR A，STAMPAR F，et al.The influence of organic/integrated production on the content of phenolic compounds in apple leaves and fruits in four different varieties over a 2year period[J].Journal of the Science of Food and Agriculture，2010，90（14）：2366-2378.
[5] 薛扬，吴唯.聚酰胺树脂的层析分离应用[J].化工新型材料，2005，33（4）：50-53.
[6] 杨武英，上官新晨，徐明生，等.聚酰胺树脂精制青钱柳黄酮的研究[J].天然产物研究与开发，2008，20（2）：320-324.
[7] 向丽，周铁军，叶迎春，等.青果多酚超声波醇提工艺条件的研究[J].安徽农业科学，1012，40（2）：772-774.
[8] 吴新荣，刘志刚，颜仁梁，等.聚酰胺颗粒分离纯化土茯苓总黄酮研究[J].中药材，2009，32（10）：1606-1609.
[9] 蔡凌云，黎云祥，石凤湘，等.白簕叶总黄酮的聚酰胺树脂纯化工艺[J].时珍国医国药，2011，22（4）：926-929.
[10] 张伟，葛志强，蒋建兰.聚酰胺树脂分离纯化复方山楂提取物中总黄酮的研究[J].中草药，2009，40（1）：63-66.
[11] 王克勤，严志慧，罗军武，等.聚酰胺树脂分离纯化芹菜黄酮的工艺研究[J].食品与机械，2009，25（3）：46-50.
[12] 贾薇，陈家仪，曾元儿，等.聚酰胺纯化枳实总黄酮的工艺研究[J].中药新药与临床药理，2012，23（5）：586-588.
[13] 蔡凌云，黎云祥，石凤湘，等.白簕叶总黄酮的聚酰胺树脂纯化工艺[J].时珍国医国药，2011，22（4）：926-929.
[14] 李厚全，陈磊，宋洪涛，等.聚酰胺纯化白背三七总黄酮的研究[J].中国药师，2010，13（2）：172-175.