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摘要：目的： 探讨5-Aza-CdR对人胃癌细胞p16基因启动子甲基化以及mRNA表达的影响。方法： 体外培养人胃癌细胞株MKN-28，分别用0.5、1.0、2.0、5.0μmol/L的5-Aza-CdR与之孵育72h。甲基化特异性PCR检测处理前后p16基因启动子甲基化水平。RT-PCR和Western blot检测p16 mRNA表达。结果： 随着药物浓度的增加，甲基化p16含量逐渐降低。而非甲基化p16逐渐增高。此外，5-Aza-CdR处理后，p16 mRNA和蛋白表达水平也随之增高。结论： 5-Aza-CdR可逆转MKN-28细胞株细胞中基因甲基化修饰状态，并上调其表达。
关键词：5-Aza-CdR；肝癌细胞；RASSFIA基因；启动子甲基化
资助项目：湖南省教育厅科技计划项目（13C963）
胃癌是一种恶性肿瘤，它严重危害着人们的身心健康，给胃癌患者带来了很大的身体危害及心理压力[1]。故本次研究利用5-Aza-CdR对体外培养的胃癌细胞株MKN-28的p16基因启动子区进行去甲基化反应，进一步探讨胃癌细胞中p16基因失活的机制以及5-Aza-CdR对其表达的调控作用。
1材料与方法
1.1主要试剂
5-Aza-CdR为Sigma产品，总RNA提取试剂为TRIzol，买自Invitrogen公司，RT-PCR试剂盒买自TaKaRa公司，RPMI1640培养基为Hyclone产品。
1.2细胞培养与处理
胃癌细胞株MKN-28接种于RPMI1640培养基，在37℃、含有50ml/LCO2 的湿润空气的恒温密闭式培养箱中进行培养。实验时细胞处于对数生长期，活细胞的数量要达到95%-100%。其中其培养瓶中加入含有不同浓度的5-Aza-CdR（0.5、1.0、2.0、5.0μmol/L）进行孵育24、48、72小时，孵育结束后收集细胞，进行实验。
1.3甲基化特异性PCR
蛋白酶K-苯酚抽取法从细胞中抽取DNA，利用紫外分光光度计检测DNA的含量以及纯度，利用琼脂糖凝胶电泳法检测DNA的完整性，重复测试3次。PCR反应条件为：特异性引物PCR的扩增条件为95℃下15min，95℃下40s，60℃下40s，72℃下40s，共进行35个循环，最后稳定在72℃下10 min。
1.4RNA提取与RT-PCR
将5-Aza-CdR处理的细胞收集起来，然后利用TRIzol试剂提取各组中MKN-28细胞的总RNA。PCR测试的反应条件为[2]：在95℃下进行预变性， 94℃下变性40s，58℃下复性40s，72℃下延伸1分钟，总进行35个循环，72℃下最后延伸6分钟。RT-PCR的产物利用琼脂糖胶进行分离，测试重复进行3次。
1.5Western blot检测p16蛋白表达
将5-Aza-CdR处理的细胞收集起来，将总蛋白进行提取，其蛋白的含量使用酚试剂法进行测定。以β-actin为内对照，利用条带密度值与内参照的密度值进行比较，分析结果，实验重复三次[2]。
1.6统计学分析
采用SPSS 15.0 统计学软件处理数据，结果采用均数±标准差表示，多组比较采用one-way方差分析并行Student’s t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。
2结果
2.1不同浓度5-Aza-CdR下调胃癌细胞甲基化p16水平
MKN-28中p16呈现出异常甲基化状态，p16基因在0.5μmol/L 5-Aza-CdR处理的条件下甲基化条带减弱，在浓度为1.0μmol/L的时候出现非甲基化条带，仅有剩余部分呈现甲基化，随着浓度的进一步增加，非甲基化p16含量逐渐升高，最后呈现出完全去甲基化状态。
2.2不同浓度5-Aza-CdR上调胃癌细胞中p16 mRNA表达
5-Aza-CdR处理前的MKN-28中检测到的p16基因mRNA的表达较低，但是经过不同浓度的5-Aza-CdR处理以后，其中的mRNA的表达逐渐增强。以药物处理前的mRNA表达强度与对应的β-actin mRNA的表达强度的比值为基准，设为1，不同浓度药物的比值如表1。
表 1细胞株MKN-28在用药前后mRNA的表达
注：与处理前相比，p<0.05。
2.3 5-Aza-CdR作用不同时间上调p16 mRNA表达
用5-Aza-CdR处理的MKN-28中检测到的mRNA的表达情况随着时间的增长，其上调的幅度越大。以mRNA表达强度与对应的β-actin mRNA的表达强度的比值为基准，设为1，不同浓度处理不同时间以后与处理前的比值如表2。
表 2细胞株MKN-28在用药前后mRNA的表达
注：与处理前相比，p<0.05。
2.4不同浓度5-Aza-CdR促进p16蛋白表达
MKN-28在用5-Aza-CdR处理以前，经检测其中的p16蛋白仅有微弱的表达，但是在使用5-Aza-CdR处理以后，其中的p16蛋白的表达增强，并且随药物浓度的增加，其增强程度越大。以5-Aza-CdR处理前MKN-28中p16基因蛋白的表达条带强度与对应的β-actin蛋白的表达强度之比作为基准值，不同浓度下其具体的蛋白表达如表3。
表 3细胞株MKN-28在用药前后p16基因蛋白的表达
注：与处理前相比，p<0.05。
3讨论
根据国内外大量的研究资料显示[4]，遗传学以及表观遗传学共同导致了胃癌的发生，其具有多基因参与、多阶段变异累积的病理特点。目前临床医学中已经证实，DNA甲基化在胃癌的发生以及发展中有很大的影响作用。DNA甲基化是一种能够使抑癌基因失活的一种机制，并且在某些条件下。它是抑癌基因失活的唯一机制。
5-Aza-CdR是一种胞苷类似物，它可以用作去甲基化的制剂，其主要的作用机理是通过与DNA中的甲基转移酶产生共价作用的结合，使得DNA中甲基转移酶的活性受到影响而有一定程度的降低，从而会使甲基化的水平得到一定程度的降低，目前临床医学中已经将这种药物应用于白血病的治疗[3]。
故本次研究采用5-Aza-CdR作为处理药物，在胃癌细胞株MKN-28经过5-Aza-CdR处理后，随着药物浓度的逐渐升高，甲基化的程度逐渐降低，并且最终呈现出完全去甲基化的状态。另外，在胃癌细胞株MKN-28中检测到P16基因的mRNA以及p16蛋白均有微弱的表达，但是在经过5-Aza-CdR处理后，P16基因的mRNA以及p16蛋白的检测均具有显著的增强，具有统计学意义（p<0.05）。
故5-Aza-CdR具有逆转MKN-28细胞株细胞中基因甲基化修饰状态，降低甲基化水平，提高非甲基化水平，并上调其表达。对于P16基因的mRNA以及p16蛋白的检测均具有显著的增强。值得推广使用。
参考文献：
[1]刘丽乔，罗达亚，付晶晶，龚慧，万福生. 5-Aza-CdR对人结肠癌Caco-2细胞系P16基因甲基化状态及其生物学表型的影响[J]. 基础医学与临床，2011，32（02）：161-165.
[2]邱庆安，吕云福，陈一明，林友刚，伍海鹰，刘宁. 5-氮杂-2′-脱氧胞苷对胃癌AGS细胞CHFR基因去甲基化作用及意义[J]. 山东医药，2011，51（14）：6-7.
[3]阮细玲，李永继，吴琼，廖柳凤，徐恒. P21对胃癌细胞MGC-803的增殖抑制及对POLD1基因表达的调控[J]. 世界华人消化杂志，2011，19（19）：1990-1995.
[4]杨晓红，黄孝天，朱伟锋，刘卓琦，余乐涵，李华，王晟，罗达亚. CpG岛靶向siRNA诱导P16沉默的甲基化分析[J]. 基础医学与临床，2013，33（12）：1533-1537.
关键词：5-Aza-CdR；肝癌细胞；RASSFIA基因；启动子甲基化
资助项目：湖南省教育厅科技计划项目（13C963）
胃癌是一种恶性肿瘤，它严重危害着人们的身心健康，给胃癌患者带来了很大的身体危害及心理压力[1]。故本次研究利用5-Aza-CdR对体外培养的胃癌细胞株MKN-28的p16基因启动子区进行去甲基化反应，进一步探讨胃癌细胞中p16基因失活的机制以及5-Aza-CdR对其表达的调控作用。
1材料与方法
1.1主要试剂
5-Aza-CdR为Sigma产品，总RNA提取试剂为TRIzol，买自Invitrogen公司，RT-PCR试剂盒买自TaKaRa公司，RPMI1640培养基为Hyclone产品。
1.2细胞培养与处理
胃癌细胞株MKN-28接种于RPMI1640培养基，在37℃、含有50ml/LCO2 的湿润空气的恒温密闭式培养箱中进行培养。实验时细胞处于对数生长期，活细胞的数量要达到95%-100%。其中其培养瓶中加入含有不同浓度的5-Aza-CdR（0.5、1.0、2.0、5.0μmol/L）进行孵育24、48、72小时，孵育结束后收集细胞，进行实验。
1.3甲基化特异性PCR
蛋白酶K-苯酚抽取法从细胞中抽取DNA，利用紫外分光光度计检测DNA的含量以及纯度，利用琼脂糖凝胶电泳法检测DNA的完整性，重复测试3次。PCR反应条件为：特异性引物PCR的扩增条件为95℃下15min，95℃下40s，60℃下40s，72℃下40s，共进行35个循环，最后稳定在72℃下10 min。
1.4RNA提取与RT-PCR
将5-Aza-CdR处理的细胞收集起来，然后利用TRIzol试剂提取各组中MKN-28细胞的总RNA。PCR测试的反应条件为[2]：在95℃下进行预变性， 94℃下变性40s，58℃下复性40s，72℃下延伸1分钟，总进行35个循环，72℃下最后延伸6分钟。RT-PCR的产物利用琼脂糖胶进行分离，测试重复进行3次。
1.5Western blot检测p16蛋白表达
将5-Aza-CdR处理的细胞收集起来，将总蛋白进行提取，其蛋白的含量使用酚试剂法进行测定。以β-actin为内对照，利用条带密度值与内参照的密度值进行比较，分析结果，实验重复三次[2]。
1.6统计学分析
采用SPSS 15.0 统计学软件处理数据，结果采用均数±标准差表示，多组比较采用one-way方差分析并行Student’s t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。
2结果
2.1不同浓度5-Aza-CdR下调胃癌细胞甲基化p16水平
MKN-28中p16呈现出异常甲基化状态，p16基因在0.5μmol/L 5-Aza-CdR处理的条件下甲基化条带减弱，在浓度为1.0μmol/L的时候出现非甲基化条带，仅有剩余部分呈现甲基化，随着浓度的进一步增加，非甲基化p16含量逐渐升高，最后呈现出完全去甲基化状态。
2.2不同浓度5-Aza-CdR上调胃癌细胞中p16 mRNA表达
5-Aza-CdR处理前的MKN-28中检测到的p16基因mRNA的表达较低，但是经过不同浓度的5-Aza-CdR处理以后，其中的mRNA的表达逐渐增强。以药物处理前的mRNA表达强度与对应的β-actin mRNA的表达强度的比值为基准，设为1，不同浓度药物的比值如表1。
表 1细胞株MKN-28在用药前后mRNA的表达
注：与处理前相比，p<0.05。
2.3 5-Aza-CdR作用不同时间上调p16 mRNA表达
用5-Aza-CdR处理的MKN-28中检测到的mRNA的表达情况随着时间的增长，其上调的幅度越大。以mRNA表达强度与对应的β-actin mRNA的表达强度的比值为基准，设为1，不同浓度处理不同时间以后与处理前的比值如表2。
表 2细胞株MKN-28在用药前后mRNA的表达
注：与处理前相比，p<0.05。
2.4不同浓度5-Aza-CdR促进p16蛋白表达
MKN-28在用5-Aza-CdR处理以前，经检测其中的p16蛋白仅有微弱的表达，但是在使用5-Aza-CdR处理以后，其中的p16蛋白的表达增强，并且随药物浓度的增加，其增强程度越大。以5-Aza-CdR处理前MKN-28中p16基因蛋白的表达条带强度与对应的β-actin蛋白的表达强度之比作为基准值，不同浓度下其具体的蛋白表达如表3。
表 3细胞株MKN-28在用药前后p16基因蛋白的表达
注：与处理前相比，p<0.05。
3讨论
根据国内外大量的研究资料显示[4]，遗传学以及表观遗传学共同导致了胃癌的发生，其具有多基因参与、多阶段变异累积的病理特点。目前临床医学中已经证实，DNA甲基化在胃癌的发生以及发展中有很大的影响作用。DNA甲基化是一种能够使抑癌基因失活的一种机制，并且在某些条件下。它是抑癌基因失活的唯一机制。
5-Aza-CdR是一种胞苷类似物，它可以用作去甲基化的制剂，其主要的作用机理是通过与DNA中的甲基转移酶产生共价作用的结合，使得DNA中甲基转移酶的活性受到影响而有一定程度的降低，从而会使甲基化的水平得到一定程度的降低，目前临床医学中已经将这种药物应用于白血病的治疗[3]。
故本次研究采用5-Aza-CdR作为处理药物，在胃癌细胞株MKN-28经过5-Aza-CdR处理后，随着药物浓度的逐渐升高，甲基化的程度逐渐降低，并且最终呈现出完全去甲基化的状态。另外，在胃癌细胞株MKN-28中检测到P16基因的mRNA以及p16蛋白均有微弱的表达，但是在经过5-Aza-CdR处理后，P16基因的mRNA以及p16蛋白的检测均具有显著的增强，具有统计学意义（p<0.05）。
故5-Aza-CdR具有逆转MKN-28细胞株细胞中基因甲基化修饰状态，降低甲基化水平，提高非甲基化水平，并上调其表达。对于P16基因的mRNA以及p16蛋白的检测均具有显著的增强。值得推广使用。
参考文献：
[1]刘丽乔，罗达亚，付晶晶，龚慧，万福生. 5-Aza-CdR对人结肠癌Caco-2细胞系P16基因甲基化状态及其生物学表型的影响[J]. 基础医学与临床，2011，32（02）：161-165.
[2]邱庆安，吕云福，陈一明，林友刚，伍海鹰，刘宁. 5-氮杂-2′-脱氧胞苷对胃癌AGS细胞CHFR基因去甲基化作用及意义[J]. 山东医药，2011，51（14）：6-7.
[3]阮细玲，李永继，吴琼，廖柳凤，徐恒. P21对胃癌细胞MGC-803的增殖抑制及对POLD1基因表达的调控[J]. 世界华人消化杂志，2011，19（19）：1990-1995.
[4]杨晓红，黄孝天，朱伟锋，刘卓琦，余乐涵，李华，王晟，罗达亚. CpG岛靶向siRNA诱导P16沉默的甲基化分析[J]. 基础医学与临床，2013，33（12）：1533-1537.