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【摘要】目的：提高头痛宁胶囊的质量控制标准。方法：采用显微鉴别方法对天麻进行定性鉴别；用高效液相色谱法对土茯苓落新妇苷为指标进行定量检测。色谱条件：用C18柱，以乙腈-01%冰醋酸（15∶85）为流动相，流速10mL/min，检测波长为291nm。结果：显微鉴别可鉴定制剂中的天麻；含量测定中落新妇苷的平均回收率为10014%，RSD为18%。结论：显微鉴别特征性好，易于鉴别；HPLC法简便快捷、重现性好，能有效的控制头痛宁胶囊的质量。
【关键词】 头痛宁胶囊；定性定量；天麻；落新妇苷；显微鉴别；高效液相色谱法
【中图分类号】R2841【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2017）07-0018-03
The Research of Microscopical Identification and Content Determination （HPLC method） for Toutongning Capsule
WANG YingchaoLIAO MinJIANG LianWANG Haining
Guizhou Institute for Food and Drug Control，Guiyang 550004，China
Abstract：Objective To improve the quality control standard of Toutongning Capsule. Methods Adopting microscopic identification to make a qualitative identification of Gastrodiae Rhizoma.Using HPLC to determine Astilbin of Smilacis Glabrae Rhizoma.C18 column was used with a mobile phase of acetonitrile-01%glacial acetic acid.The flow rate was 10 mL·min-1.The detection wavelength was at 291nm.Results Gastrodiae Rhizoma could be detected by microscopic identification.The average recovery of Astilbin was 10014% with RSD of 18%Conclusion Microscopic identification characteristic is good， easy to identify.The HPLC method is simple， good reproducibility， and can effectively control the quality of Toutongning Capsule.
Keywords：Toutongning Capsule；Qualitative and Quantitative；Gastrodiae Rhizoma；Astilbin；Microscopic identification；HPLC
头痛宁胶囊的现行标准为国家药品标准WS-11211（ZD-1211）-2002，处方由土茯苓、天麻、制何首乌、当归、防风、全蝎等组成，具有熄风涤痰、逐瘀止痛的功效，临床用于偏头痛，紧张性头痛属痰瘀阻络症。方中天麻息风止痉，平抑肝阳，祛风通络[1]，广泛用于头痛眩晕的治疗，为方中主药之一。方中天麻为生药粉投料，且天麻的显微特征明显，采用显微鉴别操作简便，结果可靠。土茯苓也为方中主药之一，现代研究表明[2]，土茯苓含多种化学成分，有糖类、有机酸类、苯丙素类、黄酮和黄酮苷类、甾醇类、皂苷类及挥发油等，具有解毒利湿、凉血解毒、祛风止痛的功效。其中落新妇苷为其主要化学成分，与土茯苓临床疗效一致，本研究采用HPLC法对制剂中落新妇苷进行含量测定，能保证更有效地对头痛宁胶囊进行质量控制。
1儀器与材料
11仪器BX51显微镜（奥林巴斯）；安捷伦1260高效液相色谱仪；KQ-500DB型数控超声波提取仪（昆山市超声仪器有限公司）。
12材料头痛宁胶囊（陕西步长制药有限公司）；落新妇苷对照品（批号：111798-201303，含量以924%计，中国药品生物制品检定院）。甲醇（色谱纯，美国天地有限公司）、乙腈（色谱纯，美国天地有限公司）、冰醋酸（分析纯，天津市富宇精细化工有限公司）、水（纯化水、UPW-50N型超净水器制备超纯水），其余试剂均为分析纯。
2显微鉴别
取本品，置显微镜下观察：草酸钙针晶成束或散在，可见螺纹导管、网纹导管和环纹导管（天麻[1]）。见图1。
3含量测定的方法与结果
31测定波长的选择精密称取适量落新妇苷对照品溶于60%甲醇溶液，在200～400nm波长范围内进行紫外扫描波长，落新妇苷在291nm处有最大吸收，以此为检测波长可获得较高的灵敏度和良好的选择性，故选择291nm为检测波长[1]。
32色谱条件Agilent C18色谱柱（5μm，46mm×250mm），流动相：乙腈-01%冰醋酸（15∶85），柱温35℃，流速10 mL/min，检测波长291nm，进样量10μL。
33供试品溶液的制备取本品10粒内容物，混匀，研细，取约10g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60%甲醇溶液25mL，密塞，称定重量，超声处理（功率250W，频率35kHz）30min，放冷，用60%甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。同法制备缺土茯苓的阴性样品溶液。 34对照品溶液的制备取落新妇苷对照品适量，精密称定，加60%甲醇制成每1mL含50μg的溶液，作为对照品溶液。
35方法学验证
351线性关系考察按上述色谱条件，精密吸取落新妇苷对照品（492769μg/mL）1、2、6、10、14、18、20μL[JP]依次注入液相色谱仪，测定峰面积。以对照品进样量X为横坐标，峰面积Y为纵坐标，进行线性回归计算，得出线性回归方程为：[JP2]Y=21585 X-14116，R=09999，表明落新妇苷在004928～09855μg的范围内具有良好的线性关系。
352回收率试验取已测定含量的头痛宁胶囊（批号：140506）（平均含量16523mg/g）05g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入落新妇苷对照品溶液（003555mg/mL）25mL，按供试品溶液制备方法制备样品溶液，并按上述色谱条件测定落新妇苷的含量，计算回收率，落新妇苷平均回收率10014%，RSD=18%，表明本方法准确度较好.
353重复性取同一批号头痛宁胶囊样品（批号：140506），按供试品溶液制备方法制备6份，分别进样，记录色谱图，计算结果，落新妇苷含量测定的平均值为16523mg/g，RSD为10%，表明本方法重复性较好。
354精密度精密吸取同一落新妇苷对照品溶液（492769μg/mL）10μL，连续进样6次，落新妇苷峰面积测定的平均值为1079，RSD为095%，表明本方法精密度较好。
355专属性取头痛宁胶囊样品（批号：140506）及缺土茯苓的阴性样品按供试品溶液制备方法制备样品溶液及阴性样品溶液，按上述色谱条件，分别取对照品溶液、样品溶液、阴性样品溶液注入液相色谱仪，样品溶液色谱在与对照品溶液色谱相应位置有相应的色谱峰，且阴性无干扰，表明本方法专属性较好，见图2。
356稳定性试验取供试品溶液在0、4、9、12、17、24h分别进样10μL，记录色谱峰面积，落新妇苷平均峰面积为1475，RSD为088%，表明供试品溶液在24h内稳定性较好。
36样品测定按拟定的色谱条件，分别测定3批样品.
4讨论
本试实验在原标准的基础上增加了1个显微鉴别和1个含量测定，能较好的控制产品质量。
本试验考察了不同浓度的甲醇和乙醇为提取溶剂进行超声及回流提取对比研究，结果表明，本法选择60%甲醇超声提取30min效果最好。
本试验考察了不同溶剂系统甲醇-01%冰醋酸溶液[2]、乙腈-水-磷酸[3]、乙腈-01%冰醋酸为流动相，结果表明，流动相为乙腈-01%冰醋酸（15∶85）时，供试品中落新妇苷与其他杂质峰能有效分离，峰形对称。
本试验考察了不同品牌色谱柱对比研究，结果表明不同品牌十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱对含量测定无影响。
参考文献
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].北京：中国医药科技出版社，2015.
[2]王建平，张海燕，傅旭春.土茯苓的化学成分和药理作用研究进展[J].海峡药学，2013，25（1）：42-44.
[3]陈幸，李彬，黎萬寿，等.HPLC法测定土茯苓中落新妇苷的含量[J].药物分析杂志，2004，24（4）：437-439.
（收稿日期：2017-01-23编辑：程鹏飞）
【关键词】 头痛宁胶囊；定性定量；天麻；落新妇苷；显微鉴别；高效液相色谱法
【中图分类号】R2841【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2017）07-0018-03
The Research of Microscopical Identification and Content Determination （HPLC method） for Toutongning Capsule
WANG YingchaoLIAO MinJIANG LianWANG Haining
Guizhou Institute for Food and Drug Control，Guiyang 550004，China
Abstract：Objective To improve the quality control standard of Toutongning Capsule. Methods Adopting microscopic identification to make a qualitative identification of Gastrodiae Rhizoma.Using HPLC to determine Astilbin of Smilacis Glabrae Rhizoma.C18 column was used with a mobile phase of acetonitrile-01%glacial acetic acid.The flow rate was 10 mL·min-1.The detection wavelength was at 291nm.Results Gastrodiae Rhizoma could be detected by microscopic identification.The average recovery of Astilbin was 10014% with RSD of 18%Conclusion Microscopic identification characteristic is good， easy to identify.The HPLC method is simple， good reproducibility， and can effectively control the quality of Toutongning Capsule.
Keywords：Toutongning Capsule；Qualitative and Quantitative；Gastrodiae Rhizoma；Astilbin；Microscopic identification；HPLC
头痛宁胶囊的现行标准为国家药品标准WS-11211（ZD-1211）-2002，处方由土茯苓、天麻、制何首乌、当归、防风、全蝎等组成，具有熄风涤痰、逐瘀止痛的功效，临床用于偏头痛，紧张性头痛属痰瘀阻络症。方中天麻息风止痉，平抑肝阳，祛风通络[1]，广泛用于头痛眩晕的治疗，为方中主药之一。方中天麻为生药粉投料，且天麻的显微特征明显，采用显微鉴别操作简便，结果可靠。土茯苓也为方中主药之一，现代研究表明[2]，土茯苓含多种化学成分，有糖类、有机酸类、苯丙素类、黄酮和黄酮苷类、甾醇类、皂苷类及挥发油等，具有解毒利湿、凉血解毒、祛风止痛的功效。其中落新妇苷为其主要化学成分，与土茯苓临床疗效一致，本研究采用HPLC法对制剂中落新妇苷进行含量测定，能保证更有效地对头痛宁胶囊进行质量控制。
1儀器与材料
11仪器BX51显微镜（奥林巴斯）；安捷伦1260高效液相色谱仪；KQ-500DB型数控超声波提取仪（昆山市超声仪器有限公司）。
12材料头痛宁胶囊（陕西步长制药有限公司）；落新妇苷对照品（批号：111798-201303，含量以924%计，中国药品生物制品检定院）。甲醇（色谱纯，美国天地有限公司）、乙腈（色谱纯，美国天地有限公司）、冰醋酸（分析纯，天津市富宇精细化工有限公司）、水（纯化水、UPW-50N型超净水器制备超纯水），其余试剂均为分析纯。
2显微鉴别
取本品，置显微镜下观察：草酸钙针晶成束或散在，可见螺纹导管、网纹导管和环纹导管（天麻[1]）。见图1。
3含量测定的方法与结果
31测定波长的选择精密称取适量落新妇苷对照品溶于60%甲醇溶液，在200～400nm波长范围内进行紫外扫描波长，落新妇苷在291nm处有最大吸收，以此为检测波长可获得较高的灵敏度和良好的选择性，故选择291nm为检测波长[1]。
32色谱条件Agilent C18色谱柱（5μm，46mm×250mm），流动相：乙腈-01%冰醋酸（15∶85），柱温35℃，流速10 mL/min，检测波长291nm，进样量10μL。
33供试品溶液的制备取本品10粒内容物，混匀，研细，取约10g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60%甲醇溶液25mL，密塞，称定重量，超声处理（功率250W，频率35kHz）30min，放冷，用60%甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。同法制备缺土茯苓的阴性样品溶液。 34对照品溶液的制备取落新妇苷对照品适量，精密称定，加60%甲醇制成每1mL含50μg的溶液，作为对照品溶液。
35方法学验证
351线性关系考察按上述色谱条件，精密吸取落新妇苷对照品（492769μg/mL）1、2、6、10、14、18、20μL[JP]依次注入液相色谱仪，测定峰面积。以对照品进样量X为横坐标，峰面积Y为纵坐标，进行线性回归计算，得出线性回归方程为：[JP2]Y=21585 X-14116，R=09999，表明落新妇苷在004928～09855μg的范围内具有良好的线性关系。
352回收率试验取已测定含量的头痛宁胶囊（批号：140506）（平均含量16523mg/g）05g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入落新妇苷对照品溶液（003555mg/mL）25mL，按供试品溶液制备方法制备样品溶液，并按上述色谱条件测定落新妇苷的含量，计算回收率，落新妇苷平均回收率10014%，RSD=18%，表明本方法准确度较好.
353重复性取同一批号头痛宁胶囊样品（批号：140506），按供试品溶液制备方法制备6份，分别进样，记录色谱图，计算结果，落新妇苷含量测定的平均值为16523mg/g，RSD为10%，表明本方法重复性较好。
354精密度精密吸取同一落新妇苷对照品溶液（492769μg/mL）10μL，连续进样6次，落新妇苷峰面积测定的平均值为1079，RSD为095%，表明本方法精密度较好。
355专属性取头痛宁胶囊样品（批号：140506）及缺土茯苓的阴性样品按供试品溶液制备方法制备样品溶液及阴性样品溶液，按上述色谱条件，分别取对照品溶液、样品溶液、阴性样品溶液注入液相色谱仪，样品溶液色谱在与对照品溶液色谱相应位置有相应的色谱峰，且阴性无干扰，表明本方法专属性较好，见图2。
356稳定性试验取供试品溶液在0、4、9、12、17、24h分别进样10μL，记录色谱峰面积，落新妇苷平均峰面积为1475，RSD为088%，表明供试品溶液在24h内稳定性较好。
36样品测定按拟定的色谱条件，分别测定3批样品.
4讨论
本试实验在原标准的基础上增加了1个显微鉴别和1个含量测定，能较好的控制产品质量。
本试验考察了不同浓度的甲醇和乙醇为提取溶剂进行超声及回流提取对比研究，结果表明，本法选择60%甲醇超声提取30min效果最好。
本试验考察了不同溶剂系统甲醇-01%冰醋酸溶液[2]、乙腈-水-磷酸[3]、乙腈-01%冰醋酸为流动相，结果表明，流动相为乙腈-01%冰醋酸（15∶85）时，供试品中落新妇苷与其他杂质峰能有效分离，峰形对称。
本试验考察了不同品牌色谱柱对比研究，结果表明不同品牌十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱对含量测定无影响。
参考文献
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].北京：中国医药科技出版社，2015.
[2]王建平，张海燕，傅旭春.土茯苓的化学成分和药理作用研究进展[J].海峡药学，2013，25（1）：42-44.
[3]陈幸，李彬，黎萬寿，等.HPLC法测定土茯苓中落新妇苷的含量[J].药物分析杂志，2004，24（4）：437-439.
（收稿日期：2017-01-23编辑：程鹏飞）