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【摘要】 目的 研究甲基化抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）对人肾癌A498细胞增殖及γ-连环蛋白（γ-catenin）表达的影响。方法 使用不同浓度（10-7、10-6、10-5 mol/L）的特异性DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR处理A498肾癌细胞株。MTT检测5-Aza-CdR对肾癌细胞株A498抑制作用。细胞免疫化学检测5-Aza-CdR处理A498肾癌细胞株后γ-catenin表达的变化。结果 5-Aza-CdR能明显抑制肾癌细胞的增殖，且与药物浓度及作用时间有关。药物处理后γ-连环蛋白表达增加。结论 γ-catenin蛋白表达受甲基化的抑制，提示5-Aza-CdR可使γ-catenin基因去甲基化而抑制A498肾癌细胞株增殖。
【关键词】 5-氮杂-2-脱氧胞苷； 肾癌A498细胞株； γ-连环蛋白； 免疫组化
Expression of γ-catenin protein and its methylation regulation in human renal carcinoma line A498 TAO Mei-man，GUO Tao,SUN Hao.The affiliated hospital of jiangsu university,Zhenjiang 212001,China
【Abstract】 Objective To investigate the effect of methylation inhibitor 5-Aza-2-deoxycytidine on the growth of human renal cancer cell line A498 andγ-catenin expression.Methods Human renal carcinoma A498 cells were treated with different concentrations of 5-Aza-CdR（10-7,10-6,10-5 mol/L） respecttively.Then the growth rate of the cells was detected by MTT assay.The immuneocytochemistry was used to detectγ-catenin levels in the cell line before and after treatment with 5-Aza-CdR.Results 5-Aza-CdR can inhibit the growth of A498 cells，γ-catenin expression levels in A498 cells were increased after 5-Aza-CdR treatment.Conclusion γ-catenin expression levels were inhibited by methylation, 5-Aza-CdR can inhibit the growth of A498 cells by inducing demethylation in the promoter region ofγ-catenin gene.
【Key words】 5-Aza-2-deoxycytidine； A498 cell lines； γ-catenin； Immunocytochemistry
肾细胞癌是人泌尿系统最常发生的恶性肿瘤，其发病率在我国泌尿生殖系统恶性肿瘤排在第二位，仅次于膀胱癌，占全身恶性肿瘤的3%［1］。肾细胞癌的发生、发展与多种因素有关,抑癌基因失活是关键因素之一。研究表明,抑癌基因失活的主要方式有基因的缺失、突变和启动子区域的过甲基化等［2］。γ-catenin是一种多功能蛋白质。近年研究显示，γ-catenin蛋白在多种肿瘤中表达减少。国外有研究证实，在肾癌组织及细胞其表达明显下调［3］,启动子区域CpG岛的过甲基化可能是其失活的主要方式,国内尚无相关的报道。笔者采用5-氮-2-脱氧胞苷对肾癌细胞株进行处理,检测γ-catenin蛋白表达,进一步研究肾癌细胞中γ-catenin蛋白表达下降是否与基因甲基化有关，探索增加或恢复肾癌细胞中γ-catenin蛋白正常表达的可能机制。
1 材料与方法
1.1 材料 人肾癌细胞株A498购于上海细胞生物所，胎牛血清（杭州四季青）；DMEM培养基、胰酶、DAB显色试剂盒及SABC试剂盒（sigma公司）；5-Aza-CdR（sigma公司），用PBS充分溶解后保存于-70 ℃冰箱备用；兔抗人γ-连环蛋白多克隆抗体、MTT及二甲亚枫（sigma公司）。
1.2 方法
1.2.1 分组方法 将浓度分别为10-7、10-6、10-5 mol/L 5-Aza-CdR处理过的人肾癌细胞株A498分为三组，未经5-Aza-CdR处理过的A498作为对照组。
1.2.2 细胞培养 人肾癌细胞株A498用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养（37 ℃，5% CO2 饱和湿度），隔日换液，细胞长满培养瓶壁的80%～90%后，按照1：3传代，取对数生长期的细胞进行试验。
1.2.3 MTT法测细胞增殖活性 对数生长期细胞以每孔5000个细胞密度接种于五块96孔板中,过夜贴壁后,加入不同浓度的5-Aza-CdR,每孔180 μl,每组设5个复孔,并设不加药的对照孔和不接种细胞的调零孔。药物和培养液每24 h更换1次,每天取出1板,加入5 g/L的MTT溶液20 μl,37 ℃、5%CO2培养箱中继续培养4 h后弃去上清,每孔加入150 μl DMSO,振荡10 min充分溶解结晶,置酶联免疫检测仪上测定波长490 nm下的光密度值，细胞生存率以平均光密度（D）值分析，以D值为纵坐标，以时间（d）为横坐标，绘制生长曲线图。
1.2.4 细胞免疫化学法检测γ-catenin表达 采用细胞爬片法，按试剂盒说明采用ABC三步法。参照Bames等［4］方法进行半定量评分（分A、B两项）：A项，按切片中细胞显色深浅计分,0分为细胞无显色，1分为显浅黄色，2分为显黄色，3分为显棕黄色；B项，按显色细胞的比例评分,1分为1%～30%，2分为31%～75%，3分为76%～100%。两项指标结合积分：阴性（-）积分为0分；阳性（+）积分为1～4分；强阳性（++）积分为5～6分。每组计数5个视野，每个视野计数200个细胞。
1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0软件包进行统计学分析，正态数据组间两两比较采用LSD-t检验，非正态数据组间两两比较采用Nemenyi法检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 不同浓度5-Aza-CdR抑制A498细胞增殖的结果 MTT检测发现5-Aza-CdR能抑制人肾癌细胞株A498增殖(图1)，且与时间和药物浓度有关。
2.2 细胞免疫组化结果 10-7、10-6、10-5 mol/L组间采用Kruskal-Wallis H 检验，差异有统计学意义（H=228.92,P<0.01）。进一步采用Nemenyi法两两比较，10-7 mol/L和10-6 mol/L组5-Aza-CdR比较，差异有统计学意义（χ2 =252.16，P<0.01）；10-7 mol/L和10-5 mol/L组5-Aza-CdR比较，差异有统计学意义（χ2 =396.48，P<0.01）；10-6 mol/L和10-5 mol/L组5-Aza-CdR比较，差异有统计学意义（χ2=12.87，P<0.01）。表明经甲基化抑制剂处理后γ-catenin表达增加，见表1。
3 讨论
γ-catenin是一种多功能蛋白质，分子量约为83 kD，基因定位于17q21上，参与由E-cadherin介导的细胞间黏附与信号传导两大功能。研究显示，γ-catenin在非小细胞癌、乳腺癌［5,6］等多种肿瘤中表达减少，与肿瘤的发生、发展密切相关，但其在肿瘤中表达下降的机制尚不清楚。研究表明，抑癌基因的失活和表达降低与其启动子区域的高甲基化状态有关［7，8］，而DNA甲基转移酶的表达水平升高和活性增加被认为是引起抑癌基因启动子区域发生发生高甲基化的主要原因之一［9］。5-Aza-CdR是DNA甲基转移酶1(DNMT1)的抑制剂，体外实验证明其可抑制多种肿瘤细胞的生长。肾癌中γ-catenin表达减少可能与其基因甲基化有关［3］，国内尚无相关研究。
本实验用5-Aza-CdR处理人肾癌细胞A498后，从MTT法检测的细胞生长曲线可以看出细胞增殖受到不同程度的抑制。免疫组化显示，A498细胞经5-Aza-CdR处理后γ-catenin蛋白表达增加，且与5-Aza-CdR浓度有关，细胞生长缓慢，恶性程度下降，说明γ-catenin蛋白具有抑制肾癌细胞生长的作用。同时γ-catenin蛋白表达受甲基化的抑制，5-Aza-CdR可使γ-catenin基因去甲基化恢复γ-catenin蛋白表达，这说明肾细胞癌中γ-catenin基因可能存在过度甲基化，而其过甲基化就是引起γ-catenin蛋白在肾癌细胞株中表达下降甚至缺失的主要机制，这需要更深入的研究。目前，5-Aza-CdR在国外已有用于治疗白血病的尝试［10］。
γ-catenin蛋白在肾癌细胞株中表达明显下降，5-Aza-CdR能恢复其表达。进一步对γ-catenin基因甲基化的研究为肾细胞癌治疗的一个新靶点。
参 考 文 献
［1］ 宋勇波，杨嗣星，赵战魁，等.VEGF和PCNA在肾细胞癌中的表达及意义［J］.现代泌尿生殖肿瘤杂志，2009，1（6）：360-363.
［2］ Tamura G.Alterration of tumor suppressor and tumor-related genes in the development and progression of gastric cancer［J］. World J Gastroenterol,2006,12(2):192-198.
［3］ Breault J E,Shiina H,Igawa M,et al.Methylation of the γ-catenin Gene is association with poor prognosis of renal cell carcinoma［J］.Clinical Cancer Research,2005,11(2Pt1):557-564.
［4］ Bames DM，Dublin EA，Fisher CJ，et al.Immunohistochemical detection of P53 protein in mammary carcinoma:an important new independent indicator prognosis［J］.Hum Pathol,1993,24(5):469-476.
［5］ 王丽华,蒋军广.γ-catenin在非小细胞肺癌组织中的表达及临床生物学意义［J］.中国老年学杂志，2007,2(27):266-267.
［6］ Sarrio D,Moreno G,Hardisson D,et al.Epigenetic and genetic alterationns of APC and CDH1 genes in lobular breast cancer:relationships with abnormal E-cadherin and catenin expression and microsatellite instability［J］.Int J Cancer,2003,106(2):208-215.
［7］ Szyf M.Methylation and demethylation as targets for anticancer therapy［J］.Biochemistry(MOSC),2005,70(5):533-549.
［8］ Ito M,Ito G,Kondo M,et al.Frequent inactivation of RASSF1A,BLU,and SEMA3B on 3p21.3 by promoter hypermethylation and allele loss in non-small cell lung cancer［J］.Cancer Lett，2005,225(1):131-139.
［9］ Hermann A,Gowher H,Jeltsch A.Biochemistry and biology of mammalian DNA methyltr-ansferases［J］.Cell Mol Life Sci,2004,61(19/20):2571-2587.
［10］ Wijermans P,Lubbert M,Verhoef G,et al.Low-dose 5-aza-2′-deoxycytidine,a DNA hype-rmethylating agent for the treatment of high-risk myelodysplastic syndrome:a multicenter phaseⅡstudy in elderly patients［J］.Clin Oncol,2002,18(5):956-962.
（收稿日期：2011-11-08）
（本文编辑：车艳）
【关键词】 5-氮杂-2-脱氧胞苷； 肾癌A498细胞株； γ-连环蛋白； 免疫组化
Expression of γ-catenin protein and its methylation regulation in human renal carcinoma line A498 TAO Mei-man，GUO Tao,SUN Hao.The affiliated hospital of jiangsu university,Zhenjiang 212001,China
【Abstract】 Objective To investigate the effect of methylation inhibitor 5-Aza-2-deoxycytidine on the growth of human renal cancer cell line A498 andγ-catenin expression.Methods Human renal carcinoma A498 cells were treated with different concentrations of 5-Aza-CdR（10-7,10-6,10-5 mol/L） respecttively.Then the growth rate of the cells was detected by MTT assay.The immuneocytochemistry was used to detectγ-catenin levels in the cell line before and after treatment with 5-Aza-CdR.Results 5-Aza-CdR can inhibit the growth of A498 cells，γ-catenin expression levels in A498 cells were increased after 5-Aza-CdR treatment.Conclusion γ-catenin expression levels were inhibited by methylation, 5-Aza-CdR can inhibit the growth of A498 cells by inducing demethylation in the promoter region ofγ-catenin gene.
【Key words】 5-Aza-2-deoxycytidine； A498 cell lines； γ-catenin； Immunocytochemistry
肾细胞癌是人泌尿系统最常发生的恶性肿瘤，其发病率在我国泌尿生殖系统恶性肿瘤排在第二位，仅次于膀胱癌，占全身恶性肿瘤的3%［1］。肾细胞癌的发生、发展与多种因素有关,抑癌基因失活是关键因素之一。研究表明,抑癌基因失活的主要方式有基因的缺失、突变和启动子区域的过甲基化等［2］。γ-catenin是一种多功能蛋白质。近年研究显示，γ-catenin蛋白在多种肿瘤中表达减少。国外有研究证实，在肾癌组织及细胞其表达明显下调［3］,启动子区域CpG岛的过甲基化可能是其失活的主要方式,国内尚无相关的报道。笔者采用5-氮-2-脱氧胞苷对肾癌细胞株进行处理,检测γ-catenin蛋白表达,进一步研究肾癌细胞中γ-catenin蛋白表达下降是否与基因甲基化有关，探索增加或恢复肾癌细胞中γ-catenin蛋白正常表达的可能机制。
1 材料与方法
1.1 材料 人肾癌细胞株A498购于上海细胞生物所，胎牛血清（杭州四季青）；DMEM培养基、胰酶、DAB显色试剂盒及SABC试剂盒（sigma公司）；5-Aza-CdR（sigma公司），用PBS充分溶解后保存于-70 ℃冰箱备用；兔抗人γ-连环蛋白多克隆抗体、MTT及二甲亚枫（sigma公司）。
1.2 方法
1.2.1 分组方法 将浓度分别为10-7、10-6、10-5 mol/L 5-Aza-CdR处理过的人肾癌细胞株A498分为三组，未经5-Aza-CdR处理过的A498作为对照组。
1.2.2 细胞培养 人肾癌细胞株A498用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养（37 ℃，5% CO2 饱和湿度），隔日换液，细胞长满培养瓶壁的80%～90%后，按照1：3传代，取对数生长期的细胞进行试验。
1.2.3 MTT法测细胞增殖活性 对数生长期细胞以每孔5000个细胞密度接种于五块96孔板中,过夜贴壁后,加入不同浓度的5-Aza-CdR,每孔180 μl,每组设5个复孔,并设不加药的对照孔和不接种细胞的调零孔。药物和培养液每24 h更换1次,每天取出1板,加入5 g/L的MTT溶液20 μl,37 ℃、5%CO2培养箱中继续培养4 h后弃去上清,每孔加入150 μl DMSO,振荡10 min充分溶解结晶,置酶联免疫检测仪上测定波长490 nm下的光密度值，细胞生存率以平均光密度（D）值分析，以D值为纵坐标，以时间（d）为横坐标，绘制生长曲线图。
1.2.4 细胞免疫化学法检测γ-catenin表达 采用细胞爬片法，按试剂盒说明采用ABC三步法。参照Bames等［4］方法进行半定量评分（分A、B两项）：A项，按切片中细胞显色深浅计分,0分为细胞无显色，1分为显浅黄色，2分为显黄色，3分为显棕黄色；B项，按显色细胞的比例评分,1分为1%～30%，2分为31%～75%，3分为76%～100%。两项指标结合积分：阴性（-）积分为0分；阳性（+）积分为1～4分；强阳性（++）积分为5～6分。每组计数5个视野，每个视野计数200个细胞。
1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0软件包进行统计学分析，正态数据组间两两比较采用LSD-t检验，非正态数据组间两两比较采用Nemenyi法检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 不同浓度5-Aza-CdR抑制A498细胞增殖的结果 MTT检测发现5-Aza-CdR能抑制人肾癌细胞株A498增殖(图1)，且与时间和药物浓度有关。
2.2 细胞免疫组化结果 10-7、10-6、10-5 mol/L组间采用Kruskal-Wallis H 检验，差异有统计学意义（H=228.92,P<0.01）。进一步采用Nemenyi法两两比较，10-7 mol/L和10-6 mol/L组5-Aza-CdR比较，差异有统计学意义（χ2 =252.16，P<0.01）；10-7 mol/L和10-5 mol/L组5-Aza-CdR比较，差异有统计学意义（χ2 =396.48，P<0.01）；10-6 mol/L和10-5 mol/L组5-Aza-CdR比较，差异有统计学意义（χ2=12.87，P<0.01）。表明经甲基化抑制剂处理后γ-catenin表达增加，见表1。
3 讨论
γ-catenin是一种多功能蛋白质，分子量约为83 kD，基因定位于17q21上，参与由E-cadherin介导的细胞间黏附与信号传导两大功能。研究显示，γ-catenin在非小细胞癌、乳腺癌［5,6］等多种肿瘤中表达减少，与肿瘤的发生、发展密切相关，但其在肿瘤中表达下降的机制尚不清楚。研究表明，抑癌基因的失活和表达降低与其启动子区域的高甲基化状态有关［7，8］，而DNA甲基转移酶的表达水平升高和活性增加被认为是引起抑癌基因启动子区域发生发生高甲基化的主要原因之一［9］。5-Aza-CdR是DNA甲基转移酶1(DNMT1)的抑制剂，体外实验证明其可抑制多种肿瘤细胞的生长。肾癌中γ-catenin表达减少可能与其基因甲基化有关［3］，国内尚无相关研究。
本实验用5-Aza-CdR处理人肾癌细胞A498后，从MTT法检测的细胞生长曲线可以看出细胞增殖受到不同程度的抑制。免疫组化显示，A498细胞经5-Aza-CdR处理后γ-catenin蛋白表达增加，且与5-Aza-CdR浓度有关，细胞生长缓慢，恶性程度下降，说明γ-catenin蛋白具有抑制肾癌细胞生长的作用。同时γ-catenin蛋白表达受甲基化的抑制，5-Aza-CdR可使γ-catenin基因去甲基化恢复γ-catenin蛋白表达，这说明肾细胞癌中γ-catenin基因可能存在过度甲基化，而其过甲基化就是引起γ-catenin蛋白在肾癌细胞株中表达下降甚至缺失的主要机制，这需要更深入的研究。目前，5-Aza-CdR在国外已有用于治疗白血病的尝试［10］。
γ-catenin蛋白在肾癌细胞株中表达明显下降，5-Aza-CdR能恢复其表达。进一步对γ-catenin基因甲基化的研究为肾细胞癌治疗的一个新靶点。
参 考 文 献
［1］ 宋勇波，杨嗣星，赵战魁，等.VEGF和PCNA在肾细胞癌中的表达及意义［J］.现代泌尿生殖肿瘤杂志，2009，1（6）：360-363.
［2］ Tamura G.Alterration of tumor suppressor and tumor-related genes in the development and progression of gastric cancer［J］. World J Gastroenterol,2006,12(2):192-198.
［3］ Breault J E,Shiina H,Igawa M,et al.Methylation of the γ-catenin Gene is association with poor prognosis of renal cell carcinoma［J］.Clinical Cancer Research,2005,11(2Pt1):557-564.
［4］ Bames DM，Dublin EA，Fisher CJ，et al.Immunohistochemical detection of P53 protein in mammary carcinoma:an important new independent indicator prognosis［J］.Hum Pathol,1993,24(5):469-476.
［5］ 王丽华,蒋军广.γ-catenin在非小细胞肺癌组织中的表达及临床生物学意义［J］.中国老年学杂志，2007,2(27):266-267.
［6］ Sarrio D,Moreno G,Hardisson D,et al.Epigenetic and genetic alterationns of APC and CDH1 genes in lobular breast cancer:relationships with abnormal E-cadherin and catenin expression and microsatellite instability［J］.Int J Cancer,2003,106(2):208-215.
［7］ Szyf M.Methylation and demethylation as targets for anticancer therapy［J］.Biochemistry(MOSC),2005,70(5):533-549.
［8］ Ito M,Ito G,Kondo M,et al.Frequent inactivation of RASSF1A,BLU,and SEMA3B on 3p21.3 by promoter hypermethylation and allele loss in non-small cell lung cancer［J］.Cancer Lett，2005,225(1):131-139.
［9］ Hermann A,Gowher H,Jeltsch A.Biochemistry and biology of mammalian DNA methyltr-ansferases［J］.Cell Mol Life Sci,2004,61(19/20):2571-2587.
［10］ Wijermans P,Lubbert M,Verhoef G,et al.Low-dose 5-aza-2′-deoxycytidine,a DNA hype-rmethylating agent for the treatment of high-risk myelodysplastic syndrome:a multicenter phaseⅡstudy in elderly patients［J］.Clin Oncol,2002,18(5):956-962.
（收稿日期：2011-11-08）
（本文编辑：车艳）