对虾白斑病毒1197基因的表达和产物纯化的研究

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  摘 要:目的 对对虾白斑病毒1197基因的表达和产物纯化进行研究。方法 对对虾白斑病毒的早晚期基因1197基因的表达和产物纯化进行研究,构建PGEX—3Xll97表达质粒,以及在大肠杆菌DE3中表达PGEX—3Xll97,对表达物进行纯化。使用FPLC的方法对融合蛋白进行纯化,并对表达产物进行复性处理。结果 将对虾白斑病毒1197基因与PGEX—3X载体进行连接,并鉴定PCR和酶切。在大肠杆菌DE3中,PGEX—3Xll97得到了表达和产物纯化的融合蛋白。结论 本研究对对虾白斑病毒1197基因的表达和产物进行了纯化,得到了1197基因表达的融合蛋白。
  关键词:产物纯化;对虾白斑病毒;1197基因
  上个世纪末以来,我国养殖对虾的死亡现象就时有发生,给对虾养殖户带来了巨大的损失。在研究中发现,能够在体外对对虾白斑病毒的早晚期基因1197进行切割。本文主要是对1197基因进行原核表达,并对其表达的产物进行纯化,从而进一步的研究1197基因表达产物的功能。
  一、材料与方法
  1. 材料
  使用本实验室的对虾白斑病毒1197基因,在E61质粒中进行构建。使用TaKaRa公司生产的BamHI和EcoRI内切酶,Phaonacia公司生产的PGEX—3X,本组保存的菌株E.coliDE3、E.eoliDH5a、以及其他的分析纯试剂。
  2.方法
  (1)构建PGEX—3Xll97表达质粒
  使用E61质粒作为模板,以1197基因读框3’及5’端顺序为依据,将下游引物和上游引物合成,并将其在50μLPCR反应混合液中对其进行94℃5min的变性,并对其进行30循环扩增。用1.0%琼脂糖凝胶电泳对产物进行鉴定。用BamHI和EcoRI双酶切PGEX—3X,并使用低熔点胶回收法来对产物进行转化、常规连接和纯化。经过转化得到了含有DE3钙细胞的菌株,并对其含有1197基因的重组表达质粒进行鉴定。
  (2)在大肠杆菌DE3中表达PGEX—3X1197
  将含有PGEX—3X1197质粒的大肠杆菌DE3单菌落培养出来,将其加入300mL的LB培养瓶,比例为1:100。
  (3)纯化表达产物
  对纯化融合蛋白使用谷胱甘肽亲和层析柱分离,并收集样品。对融合蛋白使用FPLC的方法进行纯化。对包涵体进行处理,使用300mL的菌液进行破菌,并进行10分钟的离心,在3mL裂解缓冲液中进行沉淀悬浮。
  对纯化融合蛋白使用FPLC进行分离,并适当浓缩包涵体样品,使用A缓冲液进行透析,用微孔滤膜过滤样品,并进行2mL的上样。设计合适的NaCI浓度梯度,并对离子交换柱进行洗脱,对样品进行收集。
  (4)对表达产物的进行复性处理
  主要是在27mL溶解缓冲液溶液中缓慢的加入经过处理的包涵体,依次透析PBS、2mol/L尿素、4mol/L尿素、6mol/L尿素。离心所得到的样品,然后使用谷胱甘肽S—转移酶亲和层对上清液进行分离纯化。
  二、结果
  1.鉴定与构建表达质粒PGEX—3X1197
  以已知的对虾白斑病毒1197的基因序列3’端及5’端为基础,将下游引物P2和上游引物P1合成出来,在对其进行扩增,将对虾白斑病毒1197基因得出来,并将其与载体PGEX—3X进行连接,进行PCR鉴定和酶切鉴定。
  2. 纯化大肠杆菌DE3中PGEX—3X1197的产物
  可以将PGEX—3X的表达质粒进行编码,然后将含有外源读框的DNA片段插入,将连接外源基因产物的融合蛋白表达出来,并使用GST亲和柱进行纯化。然而由于包涵体包涵了该基因的产物,难以进行纯化。
  用8M尿素处理包涵体,在融合蛋白在透析后的上清中含量较高,进而对其进行进一步的透析,仍然没有得到纯化的融合蛋白。对包涵体进行处理,并用FPLC阴离子交换层析法对上清样品进行分析,得到了4个小峰。根据对小峰的鉴定,得到了融合蛋白。
  三、讨论
  从上世纪末开始,我国出现了对虾白斑病毒,主要症状是虾体的头胸甲部位出现白斑,给我国的沿海对虾养殖业造成了巨大的损失。当前的研究表明,在5‘端非编码区,1197基因具有AAGGTT早期基因启动子元件、GTGT结构域、TATA box。因此本文认为这是一个病毒蛋白的调控因子,其能够参与病毒复制。在本次研究中,载体使用了pGEx—3x表达,并对构建表达质粒进行克隆,对大肠杆菌中的pGEX3X—1197进行表达和诱导。
  经过研究发现,在大肠杆菌的包含体重,该基因产物语其他基因产物有所不同,尽管裂解包含体之后能够获得较高表达量的产物,但是却具有较大的纯化难度。要使用去垢剂来裂解包含体、分离蛋白质,例如盐酸胍和尿素、SDS等。这也导致了表达产物的变性率较高,难以进行纯化分离。
  本次试验使用的方法是蛋白质复性方法,在尿素中进行从高浓度到低浓度的透析,但是效果仍然不理想。这是由于GST的亲和层析柱难以进行结合。最后,本实验使用了透析包涵体、盐酸胍和尿素处理,并在离析中使用了FPLC阴离子,从而实现了对该基因表达的融合蛋白的成功纯化,此时NaCI梯度浓度为30%。至于该蛋白质的功能是否会受到尿素引起的变性作用的影响,还需要进行进一步的考证。
  参考文献:
  [1] 姚翠鸾, 王志勇, 相建海.甲壳动物精氨酸激酶的结构与功能[J]. 中国生物化学与分子生物学报, 2008, 27(3):23–28.
  [2] 姚翠鸾, 冀培丰, 孔鹏, 等.凡纳滨对虾精氨酸激酶的多克隆抗体制备及组织特异性表达分析[J].水产学报,2009, 33(1): 1026–1030.
  [3]李蓓蓓,张帆,薛强,等.新城疫病毒胶体金免疫層析试纸条的制备[J].中国畜牧兽医,2009,36(9):122-125.
  [4]郝振明,赵鑫,吴孝槐.超分枝滚环扩增技术结合试纸法检测食品中多种转基因组分 [J].食品科学,2010,31(6):263-266.
  [5]彭姣,王洪强,李登峰,等.HRCA技术检测中华鳖虹彩病毒[J].微生物学通报,2013,40(2):341-349.
  [6]兰萍,宋晓玲,张辉.免疫增强剂在对虾生产中的研究与应用现状[J].动物医学进展,2008,29(10):65-68.
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