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摘 要：该文以甲醇作为唯一碳源，从甲醇驯化的土壤中分离到一株甲醇降解菌，对其形态特征及培养条件进行了研究。结果表明，该菌菌落为乳白色，菌体为短杆状，革兰氏阴性，其生长最佳条件为：氮源（NH4）2SO4，pH值7.5，温度30℃，甲醇浓度为1.5%。
关键词：甲醇降解菌；筛选；培养
中图分类号 X703 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2015）23-26-02
1引言
甲醇作为一类重要的有机化工原料，是制造各种药品、染料、农药、喷漆等的原料，同时也是一种重要的污染物，广泛存在于石油化工、有机合成及塑料等生产废水中。随着工业的迅猛发展，工厂所排放的废气、废水中的甲醇含量明显增多，危害着人类健康[1-2]。由于甲醇的生物可降解性很强，其生物处理方法有着较为广阔的应用前景，不仅能在治理污染的同时节约能源，还能在代谢后转化出抗菌素、氨基酸、蛋白质等有用的代谢产物，产生多重效益[3-4]。
2 材料与方法
2.1 甲醇降解微生物的筛选
2.1.1 培养基的配制 称取2g（NH4）2SO4，0.5gMgSO4，0.5gK2HPO4，0.01gCoCl2，0.01gMnSO4，0.01gCuSO4，0.01g FeSO4，溶于1 000mLH2O中，即为实验基础培养基。再加入18g琼脂，于121℃灭菌20min，待其冷却至50℃，加入15mLCH3OH，摇匀后倒平板，即为实验筛选培养基。
2.1.2 菌种筛选 将甲醇驯化土壤采取倍倍稀释法，制取不同浓度菌悬液，取0.1mL不同稀释倍数菌悬液分别涂布于筛选培养基上于32℃恒温培养观察；对菌落形态拍照，并对其进行革兰氏染色观察。将纯化菌种接种斜面。
2.2 甲醇降解微生物培养条件优化
2.2.1 制备菌体悬浮液 将纯化菌种斜面加入10mL无菌水，并用移液枪吹吸均匀，即为该实验菌悬液。
2.2.2 不同氮源下培养 吸取1mL菌悬液，加入体积为100mL含有以甲醇（1%）为碳源，分别含有0.2%（w/v）硝酸钾、硫酸铵、尿素、蛋白胨为氮源无菌培养基，于32℃、160r下培养观察，并拍照记录。
2.2.3 不同培养温度下培养 吸取1mL菌悬液，分别加入含有优化氮源的100mL无菌液体培养基，优化转速下，分别置于22℃、24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃温度下，于160r下培养5d，取培养液在OD600nm测其吸光度。
2.2.4 不同pH下培养 吸取1mL菌悬液，分别加入含有优化氮源的100mL无菌液体培养基，将pH分别调整为5.5、6、0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，于28℃、160r/min培养5d，取培养液在OD600nm测其吸光度。
2.2.5 不同甲醇浓度条件下培养 吸取1mL菌悬液，分别加入到含有0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.5%、2.0%、3.0%（V/V）甲醇的100mL选择培养基中，置摇床160r下中培养5d，取培养液测OD600nm。
3 结果与分析
3.1 菌落的形态特征 在以甲醇为唯一碳源的培养基上，37℃培养7d，可以观察到甲醇降解菌的菌落如图1所示，菌落呈微白色，表面光滑。经革兰氏染色后菌体呈红色，短杆状。因此鉴定该菌株为革兰氏阴性菌。
注：图A为菌落的形态特征，图B为显微观察拍照。
3.2 不同氮源对甲醇降解菌生长的影响 氮源是合成菌体蛋白质、核酸等含氮物质的重要组成成分；由于微生物多样性，微生物在不同的氮源培养基中生长状况是有差别的[25]。从图2可以看出，该菌株以蛋白胨为氮源的生长状况最好，硫酸铵为氮源的生长状况次之，在硝酸钾中不生长。
注：氮源分别为硫酸铵、尿素、蛋白胨、硝酸钾。
3.3 温度对甲醇降解菌生长的影响 从图3可以看出，隨着当温度较低时基本不生长，当温度达到28℃微生物生长活跃，当温度为30℃时，微生物生长最好；之后随后随温度的升高，微生物生长变慢，该菌最适生长温度为30℃。
图5 甲醇含量对菌株生长的影响
4 讨论与结论
多数甲醇降解菌菌落红色，属于甲基杆菌类[5-6]，该菌为革兰氏阴性短杆菌，菌落白色，不属于甲基杆菌类。该菌对蛋白胨利用最好，有机氮源通常会降低微生物对有害炭氮源的利用[7-8]，因而选择硫酸铵作为该菌处理甲醇最佳氮源。合适的温度和pH有利于菌体的生长代谢，过高或过低都会影响菌体的生长，从而影响甲醇降解。甲醇浓度较低时，生长所需能源碳源均不足，生长缓慢，甲醇浓度过高对菌体造成毒害，生长不利。由本次研究可知：该实验菌株在处理甲醇废水选择条件为氮源硫酸铵，温度30℃、pH7.5，甲醇浓度为1.5%。
参考文献
[1]宋志文，陈冠雄，马放，等.微生物固定化处理甲醇废水的实验研究[J].微生物学杂志，2000，20（4）：30-31.
[2]左雅慧，蒋德群.一株高效处理甲醇废水细菌的研究[J].微生物学杂志，2002，22（2）：58-59.
[3]林伯荃，汪景帮，党平，等.甲醇细菌的研究[J].微生物学通报，1983，10（6）：248-251.
[4]朱相远，刘宝顺，董建忠.嗜甲醇酵母的研究[J].微生物学通报，1986，13（3）：110-113.
[5]李宝庆，鹿秀云，李社增，等.甲醇降解菌的筛选、鉴定及其特性研究[J].农业环境科学学报2007，26（增刊）：410-413.
[6]Owen Jenkins，David Byrom，Dorothy Jones.Methylophilus：a New Genus of Methanol-Utilizing Bacteria，Interational Journal of Systematic Bacteriology，1987：446-448.
[7]Melike Balk，Jan Weijma，Alfons JM Stams.Therm otoga lettingaesp.nov.，a novel thermophilic，methanol-degrading bacterium isolated from a thermophilic anaerobic reactor[J].International Journalof of Systematic and Evolutionary M -icrobiology，2002，52：1361-1368.
[8]Wander W Sprenger，Martine C van Belzen，Jorg Rosenberg，etal.Methanom-icrococcus blatticola gen.nov.，sp.nov.，a methanol-and ethylamine-reducing methanogen from the hindgut of the cockroach Perip laneta Americana[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2000，50：1989-1999.
（责编：张宏民）
关键词：甲醇降解菌；筛选；培养
中图分类号 X703 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2015）23-26-02
1引言
甲醇作为一类重要的有机化工原料，是制造各种药品、染料、农药、喷漆等的原料，同时也是一种重要的污染物，广泛存在于石油化工、有机合成及塑料等生产废水中。随着工业的迅猛发展，工厂所排放的废气、废水中的甲醇含量明显增多，危害着人类健康[1-2]。由于甲醇的生物可降解性很强，其生物处理方法有着较为广阔的应用前景，不仅能在治理污染的同时节约能源，还能在代谢后转化出抗菌素、氨基酸、蛋白质等有用的代谢产物，产生多重效益[3-4]。
2 材料与方法
2.1 甲醇降解微生物的筛选
2.1.1 培养基的配制 称取2g（NH4）2SO4，0.5gMgSO4，0.5gK2HPO4，0.01gCoCl2，0.01gMnSO4，0.01gCuSO4，0.01g FeSO4，溶于1 000mLH2O中，即为实验基础培养基。再加入18g琼脂，于121℃灭菌20min，待其冷却至50℃，加入15mLCH3OH，摇匀后倒平板，即为实验筛选培养基。
2.1.2 菌种筛选 将甲醇驯化土壤采取倍倍稀释法，制取不同浓度菌悬液，取0.1mL不同稀释倍数菌悬液分别涂布于筛选培养基上于32℃恒温培养观察；对菌落形态拍照，并对其进行革兰氏染色观察。将纯化菌种接种斜面。
2.2 甲醇降解微生物培养条件优化
2.2.1 制备菌体悬浮液 将纯化菌种斜面加入10mL无菌水，并用移液枪吹吸均匀，即为该实验菌悬液。
2.2.2 不同氮源下培养 吸取1mL菌悬液，加入体积为100mL含有以甲醇（1%）为碳源，分别含有0.2%（w/v）硝酸钾、硫酸铵、尿素、蛋白胨为氮源无菌培养基，于32℃、160r下培养观察，并拍照记录。
2.2.3 不同培养温度下培养 吸取1mL菌悬液，分别加入含有优化氮源的100mL无菌液体培养基，优化转速下，分别置于22℃、24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃温度下，于160r下培养5d，取培养液在OD600nm测其吸光度。
2.2.4 不同pH下培养 吸取1mL菌悬液，分别加入含有优化氮源的100mL无菌液体培养基，将pH分别调整为5.5、6、0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，于28℃、160r/min培养5d，取培养液在OD600nm测其吸光度。
2.2.5 不同甲醇浓度条件下培养 吸取1mL菌悬液，分别加入到含有0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.5%、2.0%、3.0%（V/V）甲醇的100mL选择培养基中，置摇床160r下中培养5d，取培养液测OD600nm。
3 结果与分析
3.1 菌落的形态特征 在以甲醇为唯一碳源的培养基上，37℃培养7d，可以观察到甲醇降解菌的菌落如图1所示，菌落呈微白色，表面光滑。经革兰氏染色后菌体呈红色，短杆状。因此鉴定该菌株为革兰氏阴性菌。
注：图A为菌落的形态特征，图B为显微观察拍照。
3.2 不同氮源对甲醇降解菌生长的影响 氮源是合成菌体蛋白质、核酸等含氮物质的重要组成成分；由于微生物多样性，微生物在不同的氮源培养基中生长状况是有差别的[25]。从图2可以看出，该菌株以蛋白胨为氮源的生长状况最好，硫酸铵为氮源的生长状况次之，在硝酸钾中不生长。
注：氮源分别为硫酸铵、尿素、蛋白胨、硝酸钾。
3.3 温度对甲醇降解菌生长的影响 从图3可以看出，隨着当温度较低时基本不生长，当温度达到28℃微生物生长活跃，当温度为30℃时，微生物生长最好；之后随后随温度的升高，微生物生长变慢，该菌最适生长温度为30℃。
图5 甲醇含量对菌株生长的影响
4 讨论与结论
多数甲醇降解菌菌落红色，属于甲基杆菌类[5-6]，该菌为革兰氏阴性短杆菌，菌落白色，不属于甲基杆菌类。该菌对蛋白胨利用最好，有机氮源通常会降低微生物对有害炭氮源的利用[7-8]，因而选择硫酸铵作为该菌处理甲醇最佳氮源。合适的温度和pH有利于菌体的生长代谢，过高或过低都会影响菌体的生长，从而影响甲醇降解。甲醇浓度较低时，生长所需能源碳源均不足，生长缓慢，甲醇浓度过高对菌体造成毒害，生长不利。由本次研究可知：该实验菌株在处理甲醇废水选择条件为氮源硫酸铵，温度30℃、pH7.5，甲醇浓度为1.5%。
参考文献
[1]宋志文，陈冠雄，马放，等.微生物固定化处理甲醇废水的实验研究[J].微生物学杂志，2000，20（4）：30-31.
[2]左雅慧，蒋德群.一株高效处理甲醇废水细菌的研究[J].微生物学杂志，2002，22（2）：58-59.
[3]林伯荃，汪景帮，党平，等.甲醇细菌的研究[J].微生物学通报，1983，10（6）：248-251.
[4]朱相远，刘宝顺，董建忠.嗜甲醇酵母的研究[J].微生物学通报，1986，13（3）：110-113.
[5]李宝庆，鹿秀云，李社增，等.甲醇降解菌的筛选、鉴定及其特性研究[J].农业环境科学学报2007，26（增刊）：410-413.
[6]Owen Jenkins，David Byrom，Dorothy Jones.Methylophilus：a New Genus of Methanol-Utilizing Bacteria，Interational Journal of Systematic Bacteriology，1987：446-448.
[7]Melike Balk，Jan Weijma，Alfons JM Stams.Therm otoga lettingaesp.nov.，a novel thermophilic，methanol-degrading bacterium isolated from a thermophilic anaerobic reactor[J].International Journalof of Systematic and Evolutionary M -icrobiology，2002，52：1361-1368.
[8]Wander W Sprenger，Martine C van Belzen，Jorg Rosenberg，etal.Methanom-icrococcus blatticola gen.nov.，sp.nov.，a methanol-and ethylamine-reducing methanogen from the hindgut of the cockroach Perip laneta Americana[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2000，50：1989-1999.
（责编：张宏民）