【摘 要】
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目的探讨矮小同源盒基因亚型2(short stature homobox 2,Shox2)外源基因对犬骨髓间充质干细胞(canine mesenchymal stem cells,c MSCs)体外诱导分化的影响。方法分离培养犬骨
【机 构】
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第三军医大学西南医院心血管内科重庆市介入心脏病学研究所,
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目的探讨矮小同源盒基因亚型2(short stature homobox 2,Shox2)外源基因对犬骨髓间充质干细胞(canine mesenchymal stem cells,c MSCs)体外诱导分化的影响。方法分离培养犬骨髓间充质干细胞,用包装好的两种慢病毒载体p Lentis-m Shox2-RFP及p Lentis-RFP分别转染第3代c MSCs,收集转染阳性的c MSCs与乳鼠心肌细胞(rat ventricular myocytes,NRVMs)共培养。实验分4组:A组(RFP-c MSCs组)、B组(RFP-c MSCs+NRVMs共培养组)、C组(Shox2-RFP-c MSCs组)、D组(Shox2-RFPc MSCs+NRVMs共培养组)。共培养诱导分化5 d后,利用嘌呤霉素对c MSCs进行纯化,运用全细胞膜片钳检测诱导出内向电流的动力学特征,运用实时荧光定量PCR、Western blot检测HCN4、Tbx3、Cx45/43、Nkx2.5等标志性基因mRNA和蛋白的表达情况,并行免疫荧光检测。结果 Western blot及RTPCR检测结果显示,D组细胞Shox2、HCN4、Tbx3、Cx45窦房结细胞特异性基因的表达较A、B、C组明显增高(P<0.05),B组细胞Cx43及Nkx2.5较C、D组细胞明显增高(P<0.05);免疫荧光结果显示,在Shox2基因调控作用下,c MSCs有HCN4通道生成;膜片钳检测结果显示,C、D组细胞产生了具有明显时间-电压依赖性的内向电流,且对细胞外Cs+敏感,符合起搏离子流If的动力学特征;而A、B组未检测出此电流。结论经m Shox2基因修饰的c MSCs通过体外诱导,产生了起搏离子流If并高表达窦房结标志性基因,成功向具有一定自主搏动能力的窦房结样细胞分化。
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