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摘 要 对海南万宁新中农场7-33-97橡胶幼树上发生的回枯病进行病原菌鉴定、致病性及生物学特性测定。结果表明：橡胶幼树回枯病病原菌为可可毛色二孢[Lasiodiplodia theobromae （Pat.）Criff.et Maubl.]。生物学特性测定结果显示，病菌最适生长条件为温度30 ℃，pH值为4，碳源为葡萄糖，氮源为大豆蛋白胨；且不同光照条件对菌丝生长影响不明显。
关键词 橡胶树；可可毛色二孢；回枯病；生物学特性
中图分类号 S794.1 文献标识码 A
Identification and Biological Characteristics of Pathogen Causing Diebark on Rubber Trees
HU Wenjun1， LI Zengping1*， WU Ruhui1， DING Jingyu1， ZHANG Yu1， LAN Zhinan2
1 Institute of Tropical Agriculture and Forestry， HainanUniversity， Haikou， Hainan 570228， China
2 Hainan Rubber Industry Group Co.， Ltd.， Xinzhong Branches， Wanning， Hainan 571536， China
Abstract Pathogen identification， pathogenicity and biological characteristics were carried out on dieback occurring on young rubber trees of 7-33-97 in Xinzhong Farm， Wanning， Hainan were reported in this study. The results of morphological characteristics of the pathogen and identification of molecular biology techniques showed that the pathogen was Lasiodiplodia theobromae （Pat.） Criff.et Maub. The results of biological characteristics test showed that 30 ℃， pH 4， glucose as carbon source and soybean peptone as nitrogen source were the optimum conditions for the pathogen growth. Different light conditions had little effect on the growth rate of the pathogen hypha.
Key words rubber trees； Lasiodiplodia theobromae； dieback； biological characteristics
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.06.016
2017年7月，在海南万宁新中农场2～4年生的7-33-97橡胶幼树上发生较为严重的一种新病害，发病面积约为266.6 hm2，發病率为1.9%～50%，枯死率为0.4%～40%，发病幼树自顶端枝条开始向下回枯，枝干流胶，最后整株枯死，枯死幼树的木质部发生蓝变，取名为橡胶树回枯病。国内外已报道的引起林木枝干流胶、回枯和木质部蓝变的病原菌有多种，如Ang Boon Beng[1]首次报道了在马来西亚由可可球二孢菌（Botrydiplodia theobromae Pat.）引起的可可突发性回枯病；肖倩莼等[2-3]报道色二孢菌（Diplodia natalensis）和炭疽菌（Colletotrichum gloesporiodes）可引起芒果树的回枯病和流胶病；赵桂华等[4]从橡胶木中分离到引起木材蓝变的真菌主要为Lasiodiplodia theobromae和Ceratocystis spp.；Encinas等[5]从白杨和橡胶树中分离到引起木材蓝变的真菌Lasiodiplodia theobromae；Cardoso等[6]首次报道了在巴西由Lasiodiplodia theobromae引起的腰果枝条回枯病；赵桂华[7]报道了引起马尾松木材蓝变的2种长喙壳属真菌，分别为松生长喙壳（Ceratocystis pinicola）和木生长喙壳（C. lignicola）；郑晓慧等[8]报道甘薯长喙壳（Ceratocystis fimbriata）可引起四川省攀西地区的石榴枯萎病，病树木质部变色，叶片变黄和萎蔫，后期全部凋落，枝条枯萎后整树枯死。由于引起树木枝枯、流胶、木质部变色的病原菌较为复杂，本研究对发现的橡胶树回枯病这一新病害进行病原鉴定和生物学特性测定，以期为生产防治提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试样本 采自海南万宁新中农场和琼中加钗农场2～4年生的7-33-97和PR107发病橡胶幼树茎干和枝条，将发病的茎干和枝条锯下，装入封口袋中带回实验室备用。
1.1.2 培养基 PDA培养基、PD液体培养基、Czapek培养基和木屑培养基，其中PDA培养基和Czapek培养基配方参考方中达[9]的《植病研究方法》，木屑培养基参考高秀兵等[10]的方法。
1.1.3 试剂 主要有通用引物ITS1和ITS4，特异性引物Bt2a/Bt2b[11]、EF1-728F/EF1-986R[12]和Bth-S/Bth-A[13]，OMEGA Fungal DNA Kit等。 1.1.4 接种苗木 供致病性测定的苗木为海南大学教学基地内种植的2年生7-33-97橡胶树袋装苗，2年生和4年生的橡胶实生苗，市场购买的番薯块茎和芒果果实。
1.2 方法
1.2.1 菌株分离 采用组织分离法和单孢分离法纯化出菌株备用。组织分离法是将病茎表面喷上70%的酒精进行表面消毒，使用已消毒的砍刀沿发病处将病茎劈开，在超净工作台上用灭菌后的手术刀从发病茎干中心处切取约6 mm大小的变色木质部组织块，放入含有利福平的PDA平板培养基上，于28 ℃培养1 d后，从组织块上长出的菌落边缘挑取5 mm×5 mm的菌丝块，接种至空白的PDA培养基中纯化，置于28 ℃的恒温培养箱中培养备用。单孢分离法是用灭菌接种环从病茎表皮上长出的黑色孢子堆上挑取少量分生孢子，置于1 mL灭菌水中混匀后进行梯度稀释成不同浓度的孢子悬浮液，然后用灭菌的玻璃涂棒分别粘取不同稀释度的孢子悬浮液，涂布在PDA平板培养基表面，于28 ℃恒温培养1 d，最后挑取单孢菌落进行纯化备用。
1.2.2 致病性测定 （1）菌丝块接种：选取5株龄期为2年生的7-33-97健康橡胶树袋装苗，2株进行划伤接种，2株无伤接种，1株接空白PDA培养基作对照。先在待接种植株的上部茎干表面喷70%酒精进行表面消毒，待酒精风干后，用灭菌手术刀在消毒的植株茎干表面间隔5 cm左右刮出长约1 cm的2个伤口，用灭菌接种环挑取分离纯化的菌丝块，菌丝面朝下接种在伤口上，盖上湿棉花后用塑料带包裹保湿，无伤接种则不制造伤口，其余与创伤接种相同。接种后每2 d一次，定期观察发病情况并拍照记录。
以同样的方法利用菌丝块接种3株2年生的橡胶树实生苗基部茎干，1株接空白PDA培养基作对照，包裹保湿且定期观察。
将2个番薯块茎表面喷70%酒精进行消毒后，对半切开，间隔2 cm，一半接3块菌丝块，一半接空白PDA培养基作对照，用湿棉花保湿且定期观察。
将2个芒果表面喷70%酒精消毒后，间隔2 cm用灭菌束针刺破4处表皮，中央最顶端接空白PDA培养基作对照，两侧3处伤口接菌丝块，用湿棉花保湿且每天观察。
（2）病组织接种：选2株4年生橡胶苗，在基部老化茎干表面喷70%酒精消毒后，间隔5 cm左右钻3个直径0.8 cm的小洞，深入木质部，接入从病株茎干上削下的变色病木组织，1株接健康木质组织作对照，保湿包裹且定期观察。
1.2.3 子实体诱导 挑取分离纯化的菌丝块接种到灭菌的木屑培养基中，28 ℃恒温培养进行子实体诱导[10]。
1.2.4 病原菌鉴定 （1）形态观察：在病组织上挑取病原菌子实体制片，在显微镜下观察；使用Imagine Pro Plus 6.0软件测量分生孢子器直径和分生孢子的大小，根据陆家云[14]《植物病原真菌学》、戚佩坤[15]《广东果树真菌病害志》、胡美姣等[16]参考资料进行种类鉴定。
（2）分子生物学测定：参考彭军等[17]的方法。在75 mL的PD培养基中放入5块直径为5 mm的菌饼，置于振荡培养箱中培养2 d后取出；将摇出的菌丝球移至离心管内，放入冰箱中冷冻后进行研磨，用OMEGA Fungal DNA Kit进行DNA提取；将所提取的DNA用通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）/ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），特异性引物Bt2a（5′-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3′）/Bt2b：（5′-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3′）、EF1-728F（5′-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3′）/EF1-986R（5′-TACTTGAAGGAACCCTTACC-3′）和Bth-S（5′-TCTCCCACCCTTTGTGAAC-3′）/Bth-A（5′-AAAAGTTCAGAAGGTTCGT C-3′）分別进行PCR扩增；对扩增产物进行电泳，结果获得500～750 bp的明亮条带，切胶回收进行电泳验证后，将胶回收的产物送至华大基因测序，所得测序结果在NCBI网站进行比对分析。
1.2.5 生物学特性测定 选取单孢纯化后菌龄相同的培养菌落，在其边缘用打孔器打取直径为5 mm的菌饼，将菌饼用接种环分别挑接到不同种类的培养基中进行相关测定。除不同碳、氮源测定时使用更换等质量的不同碳、氮源的Czapek培养基外，其余测定都使用PDA培养基，除不同温度条件测定外，不同光照条件的测定在30 ℃进行培养，其余处理测定的培养温度均为28 ℃，每组处理均设3次重复。待最优条件下菌丝生长到近培养皿边缘时，用十字交叉法测量菌落直径。其中不同测定的设置为：
（1）光照：设置连续光照、光暗交替和连续黑暗3组处理。
（2）温度：设置培养温度为10、15、20、25、28、30、32、34、37、40 ℃共10组处理。
（3）pH：设置pH为2、3、4、5、6、7、8、9、10和11共10组处理。
（4）碳源：设置碳源为缺碳、麦芽糖、蔗糖、D-果糖、肌醇、可溶性淀粉、葡萄糖和D-山梨醇共8组处理。
（5）氮源：设置氮源为缺氮、氯化铵、硫酸铵、大豆蛋白胨、硝酸铵、硝酸钠、硝酸钙、L-天冬酰胺共8组处理。
1.3 数据处理
使用统计分析软件SAS对试验数据进行差异显著性分析。
2 结果与分析
2.1 橡胶树回枯病症状
于2017年7～8月间，在海南省万宁新中农场、琼中加钗农场的部分胶园中的橡胶幼树发生回枯病，此病主要危害2～4年生的7-33-97和PR107橡胶幼树。新中农场7-33-97品系的发病面积约为266.6 hm2，发病率为1.9%～50%，枯死率为0.4%～40%。加钗农场PR107品系发病面积约为66.6 hm2，枯死率最高达5.8%。发病幼树先从树冠顶端枝条开始，小枝叶片变黄，落叶干枯，内部组织变褐，继而蔓延到主干，沿主干向下扩展，有的病株茎干皮层组织呈纵向条带状坏死，所有病株木质部均发生蓝变，横切基部主杆可见木质部有沿主干中央向外呈扇形或放射状扩展的蓝色病变，发病后期整株幼树枯死，部分病树茎干表面伴随有流胶现象，砍下的病茎在室内放置20 d后，病菌表皮长出黑褐色子座和分生孢子器，并产生大量黑色分生孢子（图1）。 2.2 致病性测定
4～10 d后，伤口接种分离菌和病组织的橡胶苗嫩茎和老化茎均被侵染，无伤接菌的则未被侵染，对照则无明显变化。菌丝块接种的橡胶苗嫩茎4 d后伤口变黑扩大，木质部变软下折，病健交界处有褐色水渍状坏死带，上部叶片仍保持绿色，9 d后，接种病原菌的橡胶苗嫩茎病部组织变干，表面生出大量小黑点（分生孢子器），上部叶片全部变黄后脱落。而菌丝块接种的橡胶苗老化茎10 d后伤口才变成黑褐色，扩展稍慢。病组织接种的橡胶苗老化茎干组织变褐。菌丝块接种4 d后，番薯块茎病部组织蓝变，芒果病部呈现黑褐色病斑。切取接菌后发病的植物病部组织进行再分离，重新分离获得形态相同的菌株，表明用于接种的分离菌为致病菌（图2）。
A：地上部枝条回枯，茎干枯死；B：茎干流胶；C：茎干表皮呈纵向条带状坏死；D：小枝干枯，内部组织变褐；E、F：茎干木质部蓝变；G：20 d后在病茎表皮上长出黑色分生孢子堆。
A： The symptom of dieback on branches of rubber trees； B： The gum flowed out from the stem of the rubber tree； C： Stem epidermis was a longitudinal strip necrosis； D： Branchlets dieback and internal tissue browned； E & F： The blue change of xylem in trunk； G： Twenty days later black conidia piles were grown on the epidermis of diseased stems.
2.3 病原菌鑒定
2.3.1 形态观察 病原菌在PDA培养基中，菌落呈圆形、白色、辐射生长、絮状，老化后变为蓝黑色至黑色，边缘整齐（图3-A）。在木屑培养基中长有黑色且致密菌丝层，约10 d后变黑，表面诱导后长出黑褐色子座，其内长有黑色的分生孢子器（图3-B、C）。病原菌的分生孢子器呈近球形、黑色，大小为（165.98～335.13） μm×（249.30～342.96） μm，平均为252.80 μm×295.52 μm；分生孢子两型，初期为单胞无色，后期为双胞褐色，褐色双胞孢子表面有纵脊，分生孢子大小为（19.66～27.89） μm×（10.23～15.96） μm，平均为24.15 μm×13.01 μm（图3-D、E）。
A：菌丝块接种橡胶树嫩茎组织变褐；B：菌丝块接种橡胶树老化茎组织变褐；C：病组织接种橡胶老化茎组织变褐；D：橡胶树嫩茎发病后下折；E：接种9 d后的回枯症状；F：接种9 d后枯死茎干上长出的病菌分生孢子器；G：菌丝块接种4 d后的番薯块茎组织蓝变；H：菌丝块接种4 d后的芒果表面呈现黑褐色病斑。
A： Myceliums inoculated rubber tree tender stem tissue browning； B： Myceliums inoculated rubber tree older stem tissue browning； C： Diseased tissue inoculated rubber tree tender stem tissue browning； D： Rubber tree tender stem break after the diseased； E：The symptoms of dieback on rubber tree after 9 days of inoculation； F： Pycnidia of pathogen grow on stems of rubber tree after 9 days of inoculation； G： The tuber tissue of sweet potato turned blue after four days of inoculation； H： The surface of the mango inoculated for 4 days showed dark brown spot.
2.3.2 分子生物学技术鉴定结果 经测序，病原菌rDNA-ITS序列为506 bp（NCBI登录号为MF952885），Bth、Bt2和EF1序列分别为391 bp（NCBI登录号为MG271758）、432 bp（NCBI登录号为MG000590）和290 bp（NCBI登录号为MG000591）（图4）。与NCBI登录号为KY432690.1、MF114110.1、KP698094.1、FJ150695等可可毛色二孢[Lasiodiplodia theobromae （Pat.） Criff. et Maubl.]序列的相似度为99%，结合形态学特征观察及分子生物学技术鉴定结果，将引起橡胶幼树回枯病的病原菌鉴定为可可毛色二孢菌[Lasiodiplodia theobromae （Pat.） Criff. et Maubl.]。
2.4 生物学特性测定
2.4.1 不同温度对病原菌菌丝生长的影响 在所设置的10组不同温度处理中，病原菌在15～40 ℃的条件下均能生长，适宜生长的温度为28～34 ℃，最适生长温度为30 ℃，40 ℃时生长较慢，在10 ℃时则不生长（图5）。
2.4.2 不同光照对病原菌菌丝生长的影响 在不同的光照处理中，病原菌的菌落生长势基本一致，表明不同的光照条件对菌丝的生长无明显影响（图6）。
2.4.3 不同pH值对病原菌菌丝生长的影响 病原菌在pH 2～10条件下均可生长，适宜生长的pH值为4～6，最适pH值为4，表明病菌喜欢偏酸的环境（图7）。 M： Marker； 1： EF1； 2： Bt2； 3： Bth； 4： rDNA-ITS.
不同大写字母表示0.01水平上的差异极显著，不同小写字母表示0.05水平上的差异显著。下同。
Different capital letters mean extremely significant different at 0.01 level， Different small letters mean significant different at 0.05 level. The same as below.
2.4.4 不同碳、氮源对病原菌菌丝生长的影响 不同碳源对菌丝生长的影响：病原菌的菌丝在以葡萄糖为碳源的培养基中直径最大，为最适碳源，其次为可溶性淀粉，在D-果糖中长势缓慢，菌落直径小于缺碳处理（图8）。
不同氮源对菌丝生长的影响：病原菌菌丝在以大豆蛋白胨为氮源的培养基中直径最大，长势最好，为最适氮源，其次为L-天冬酰胺，以氯化铵、硫酸铵和硝酸铵为氮源的培养基中长势缓慢，菌落直径小于缺氮处理（图9）。
3 讨论
可可毛色二孢菌[Lasiodiplodia theobromae （Pat.） Criff. et Maubl.]也称可可球二孢菌（Botrydiplodia theobromae Pat.）[15，18]，可侵染菠蘿、番木瓜、柚子、木菠萝、芒果、香蕉、柑桔、番石榴、无花果、腰果、可可、山竹、桑树、麻风树、桉树、沉香、木薯等植物的果实、叶片、枝干或根，引起焦腐、蒂腐、溃疡、枝枯、流胶、回枯和根腐等症状[1， 6， 15-16， 18-35]，2012年Nghia报道在越南的橡胶上分离到Botryodiplodia theobromae，Lasiodiplodia theobromae可侵染橡胶木、杨木、松木等引起木材蓝变[5， 36-40]。目前在中国尚未见由可可球二孢引起橡胶回枯病的相关报道。橡胶树回枯病的主要症状为小枝受害后先干枯，蔓延到茎干后由上到下回枯，木质部组织发生蓝变，茎干上有时伴随流胶，与胡美姣等[16]报道的芒果树回枯病、Frrari等[23]报道的柑桔回枯病、Ang Boon Beng[1]和Mbenoun等[27]报道的可可突发性回枯病等症状相类似。本研究对引起海南橡胶幼树回枯病的病原菌进行形态鉴定及分子生物学分析，鉴定其为可可毛色二孢菌[Lasiodiplodia theobromae （Pat.） Criff. et Maub]，这是国内发现此菌可引起橡胶树枝干病害。在病原菌的分子鉴定中利用了4组引物进行PCR扩增，其中3组特异性引物的运用进一步增强了病原菌分子鉴定的准确性。
病原菌人工接种可侵染番薯块茎引起组织蓝变，也能侵染芒果果实呈现黑褐色病斑。利用木屑培养基可诱导产生子实体。该病原菌最适生长温度为30 ℃，与前人的研究结果基本一致[16， 41]。病原菌最适生长pH值为4，与黄思良等[41]研究所得出的可可球二孢最适pH为5.0～5.5相比更偏酸性；最适碳源为葡萄糖，最适氮源为大豆蛋白胨，这与胡美姣
等[16]研究报道的芒果上的可可球二孢对碳、氮源选择不严格的结果不尽相同；且病原菌在不同光照条件的菌丝生长速度基本一致，这也与刘媛等[42]和杨波等[28]研究的可可球二孢菌喜光不同，是否由于寄主不同存在小种差异有待进一步研究。调查中发现，海南橡胶幼树回枯病主要发生在3～7月高温、干旱、少雨的季节，且胶园地面植被少或覆盖少、阳光易曝晒的时间长、胶树抗性弱时发病严重；研究发现病原菌易从枝条上的伤口侵入，嫩茎被侵染后发病迅速，易枯死，对橡胶幼树存在较大危害性，在生产防治中应给予高度重视并加强监测和防控。
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关键词 橡胶树；可可毛色二孢；回枯病；生物学特性
中图分类号 S794.1 文献标识码 A
Identification and Biological Characteristics of Pathogen Causing Diebark on Rubber Trees
HU Wenjun1， LI Zengping1*， WU Ruhui1， DING Jingyu1， ZHANG Yu1， LAN Zhinan2
1 Institute of Tropical Agriculture and Forestry， HainanUniversity， Haikou， Hainan 570228， China
2 Hainan Rubber Industry Group Co.， Ltd.， Xinzhong Branches， Wanning， Hainan 571536， China
Abstract Pathogen identification， pathogenicity and biological characteristics were carried out on dieback occurring on young rubber trees of 7-33-97 in Xinzhong Farm， Wanning， Hainan were reported in this study. The results of morphological characteristics of the pathogen and identification of molecular biology techniques showed that the pathogen was Lasiodiplodia theobromae （Pat.） Criff.et Maub. The results of biological characteristics test showed that 30 ℃， pH 4， glucose as carbon source and soybean peptone as nitrogen source were the optimum conditions for the pathogen growth. Different light conditions had little effect on the growth rate of the pathogen hypha.
Key words rubber trees； Lasiodiplodia theobromae； dieback； biological characteristics
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.06.016
2017年7月，在海南万宁新中农场2～4年生的7-33-97橡胶幼树上发生较为严重的一种新病害，发病面积约为266.6 hm2，發病率为1.9%～50%，枯死率为0.4%～40%，发病幼树自顶端枝条开始向下回枯，枝干流胶，最后整株枯死，枯死幼树的木质部发生蓝变，取名为橡胶树回枯病。国内外已报道的引起林木枝干流胶、回枯和木质部蓝变的病原菌有多种，如Ang Boon Beng[1]首次报道了在马来西亚由可可球二孢菌（Botrydiplodia theobromae Pat.）引起的可可突发性回枯病；肖倩莼等[2-3]报道色二孢菌（Diplodia natalensis）和炭疽菌（Colletotrichum gloesporiodes）可引起芒果树的回枯病和流胶病；赵桂华等[4]从橡胶木中分离到引起木材蓝变的真菌主要为Lasiodiplodia theobromae和Ceratocystis spp.；Encinas等[5]从白杨和橡胶树中分离到引起木材蓝变的真菌Lasiodiplodia theobromae；Cardoso等[6]首次报道了在巴西由Lasiodiplodia theobromae引起的腰果枝条回枯病；赵桂华[7]报道了引起马尾松木材蓝变的2种长喙壳属真菌，分别为松生长喙壳（Ceratocystis pinicola）和木生长喙壳（C. lignicola）；郑晓慧等[8]报道甘薯长喙壳（Ceratocystis fimbriata）可引起四川省攀西地区的石榴枯萎病，病树木质部变色，叶片变黄和萎蔫，后期全部凋落，枝条枯萎后整树枯死。由于引起树木枝枯、流胶、木质部变色的病原菌较为复杂，本研究对发现的橡胶树回枯病这一新病害进行病原鉴定和生物学特性测定，以期为生产防治提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试样本 采自海南万宁新中农场和琼中加钗农场2～4年生的7-33-97和PR107发病橡胶幼树茎干和枝条，将发病的茎干和枝条锯下，装入封口袋中带回实验室备用。
1.1.2 培养基 PDA培养基、PD液体培养基、Czapek培养基和木屑培养基，其中PDA培养基和Czapek培养基配方参考方中达[9]的《植病研究方法》，木屑培养基参考高秀兵等[10]的方法。
1.1.3 试剂 主要有通用引物ITS1和ITS4，特异性引物Bt2a/Bt2b[11]、EF1-728F/EF1-986R[12]和Bth-S/Bth-A[13]，OMEGA Fungal DNA Kit等。 1.1.4 接种苗木 供致病性测定的苗木为海南大学教学基地内种植的2年生7-33-97橡胶树袋装苗，2年生和4年生的橡胶实生苗，市场购买的番薯块茎和芒果果实。
1.2 方法
1.2.1 菌株分离 采用组织分离法和单孢分离法纯化出菌株备用。组织分离法是将病茎表面喷上70%的酒精进行表面消毒，使用已消毒的砍刀沿发病处将病茎劈开，在超净工作台上用灭菌后的手术刀从发病茎干中心处切取约6 mm大小的变色木质部组织块，放入含有利福平的PDA平板培养基上，于28 ℃培养1 d后，从组织块上长出的菌落边缘挑取5 mm×5 mm的菌丝块，接种至空白的PDA培养基中纯化，置于28 ℃的恒温培养箱中培养备用。单孢分离法是用灭菌接种环从病茎表皮上长出的黑色孢子堆上挑取少量分生孢子，置于1 mL灭菌水中混匀后进行梯度稀释成不同浓度的孢子悬浮液，然后用灭菌的玻璃涂棒分别粘取不同稀释度的孢子悬浮液，涂布在PDA平板培养基表面，于28 ℃恒温培养1 d，最后挑取单孢菌落进行纯化备用。
1.2.2 致病性测定 （1）菌丝块接种：选取5株龄期为2年生的7-33-97健康橡胶树袋装苗，2株进行划伤接种，2株无伤接种，1株接空白PDA培养基作对照。先在待接种植株的上部茎干表面喷70%酒精进行表面消毒，待酒精风干后，用灭菌手术刀在消毒的植株茎干表面间隔5 cm左右刮出长约1 cm的2个伤口，用灭菌接种环挑取分离纯化的菌丝块，菌丝面朝下接种在伤口上，盖上湿棉花后用塑料带包裹保湿，无伤接种则不制造伤口，其余与创伤接种相同。接种后每2 d一次，定期观察发病情况并拍照记录。
以同样的方法利用菌丝块接种3株2年生的橡胶树实生苗基部茎干，1株接空白PDA培养基作对照，包裹保湿且定期观察。
将2个番薯块茎表面喷70%酒精进行消毒后，对半切开，间隔2 cm，一半接3块菌丝块，一半接空白PDA培养基作对照，用湿棉花保湿且定期观察。
将2个芒果表面喷70%酒精消毒后，间隔2 cm用灭菌束针刺破4处表皮，中央最顶端接空白PDA培养基作对照，两侧3处伤口接菌丝块，用湿棉花保湿且每天观察。
（2）病组织接种：选2株4年生橡胶苗，在基部老化茎干表面喷70%酒精消毒后，间隔5 cm左右钻3个直径0.8 cm的小洞，深入木质部，接入从病株茎干上削下的变色病木组织，1株接健康木质组织作对照，保湿包裹且定期观察。
1.2.3 子实体诱导 挑取分离纯化的菌丝块接种到灭菌的木屑培养基中，28 ℃恒温培养进行子实体诱导[10]。
1.2.4 病原菌鉴定 （1）形态观察：在病组织上挑取病原菌子实体制片，在显微镜下观察；使用Imagine Pro Plus 6.0软件测量分生孢子器直径和分生孢子的大小，根据陆家云[14]《植物病原真菌学》、戚佩坤[15]《广东果树真菌病害志》、胡美姣等[16]参考资料进行种类鉴定。
（2）分子生物学测定：参考彭军等[17]的方法。在75 mL的PD培养基中放入5块直径为5 mm的菌饼，置于振荡培养箱中培养2 d后取出；将摇出的菌丝球移至离心管内，放入冰箱中冷冻后进行研磨，用OMEGA Fungal DNA Kit进行DNA提取；将所提取的DNA用通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）/ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），特异性引物Bt2a（5′-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3′）/Bt2b：（5′-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3′）、EF1-728F（5′-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3′）/EF1-986R（5′-TACTTGAAGGAACCCTTACC-3′）和Bth-S（5′-TCTCCCACCCTTTGTGAAC-3′）/Bth-A（5′-AAAAGTTCAGAAGGTTCGT C-3′）分別进行PCR扩增；对扩增产物进行电泳，结果获得500～750 bp的明亮条带，切胶回收进行电泳验证后，将胶回收的产物送至华大基因测序，所得测序结果在NCBI网站进行比对分析。
1.2.5 生物学特性测定 选取单孢纯化后菌龄相同的培养菌落，在其边缘用打孔器打取直径为5 mm的菌饼，将菌饼用接种环分别挑接到不同种类的培养基中进行相关测定。除不同碳、氮源测定时使用更换等质量的不同碳、氮源的Czapek培养基外，其余测定都使用PDA培养基，除不同温度条件测定外，不同光照条件的测定在30 ℃进行培养，其余处理测定的培养温度均为28 ℃，每组处理均设3次重复。待最优条件下菌丝生长到近培养皿边缘时，用十字交叉法测量菌落直径。其中不同测定的设置为：
（1）光照：设置连续光照、光暗交替和连续黑暗3组处理。
（2）温度：设置培养温度为10、15、20、25、28、30、32、34、37、40 ℃共10组处理。
（3）pH：设置pH为2、3、4、5、6、7、8、9、10和11共10组处理。
（4）碳源：设置碳源为缺碳、麦芽糖、蔗糖、D-果糖、肌醇、可溶性淀粉、葡萄糖和D-山梨醇共8组处理。
（5）氮源：设置氮源为缺氮、氯化铵、硫酸铵、大豆蛋白胨、硝酸铵、硝酸钠、硝酸钙、L-天冬酰胺共8组处理。
1.3 数据处理
使用统计分析软件SAS对试验数据进行差异显著性分析。
2 结果与分析
2.1 橡胶树回枯病症状
于2017年7～8月间，在海南省万宁新中农场、琼中加钗农场的部分胶园中的橡胶幼树发生回枯病，此病主要危害2～4年生的7-33-97和PR107橡胶幼树。新中农场7-33-97品系的发病面积约为266.6 hm2，发病率为1.9%～50%，枯死率为0.4%～40%。加钗农场PR107品系发病面积约为66.6 hm2，枯死率最高达5.8%。发病幼树先从树冠顶端枝条开始，小枝叶片变黄，落叶干枯，内部组织变褐，继而蔓延到主干，沿主干向下扩展，有的病株茎干皮层组织呈纵向条带状坏死，所有病株木质部均发生蓝变，横切基部主杆可见木质部有沿主干中央向外呈扇形或放射状扩展的蓝色病变，发病后期整株幼树枯死，部分病树茎干表面伴随有流胶现象，砍下的病茎在室内放置20 d后，病菌表皮长出黑褐色子座和分生孢子器，并产生大量黑色分生孢子（图1）。 2.2 致病性测定
4～10 d后，伤口接种分离菌和病组织的橡胶苗嫩茎和老化茎均被侵染，无伤接菌的则未被侵染，对照则无明显变化。菌丝块接种的橡胶苗嫩茎4 d后伤口变黑扩大，木质部变软下折，病健交界处有褐色水渍状坏死带，上部叶片仍保持绿色，9 d后，接种病原菌的橡胶苗嫩茎病部组织变干，表面生出大量小黑点（分生孢子器），上部叶片全部变黄后脱落。而菌丝块接种的橡胶苗老化茎10 d后伤口才变成黑褐色，扩展稍慢。病组织接种的橡胶苗老化茎干组织变褐。菌丝块接种4 d后，番薯块茎病部组织蓝变，芒果病部呈现黑褐色病斑。切取接菌后发病的植物病部组织进行再分离，重新分离获得形态相同的菌株，表明用于接种的分离菌为致病菌（图2）。
A：地上部枝条回枯，茎干枯死；B：茎干流胶；C：茎干表皮呈纵向条带状坏死；D：小枝干枯，内部组织变褐；E、F：茎干木质部蓝变；G：20 d后在病茎表皮上长出黑色分生孢子堆。
A： The symptom of dieback on branches of rubber trees； B： The gum flowed out from the stem of the rubber tree； C： Stem epidermis was a longitudinal strip necrosis； D： Branchlets dieback and internal tissue browned； E & F： The blue change of xylem in trunk； G： Twenty days later black conidia piles were grown on the epidermis of diseased stems.
2.3 病原菌鑒定
2.3.1 形态观察 病原菌在PDA培养基中，菌落呈圆形、白色、辐射生长、絮状，老化后变为蓝黑色至黑色，边缘整齐（图3-A）。在木屑培养基中长有黑色且致密菌丝层，约10 d后变黑，表面诱导后长出黑褐色子座，其内长有黑色的分生孢子器（图3-B、C）。病原菌的分生孢子器呈近球形、黑色，大小为（165.98～335.13） μm×（249.30～342.96） μm，平均为252.80 μm×295.52 μm；分生孢子两型，初期为单胞无色，后期为双胞褐色，褐色双胞孢子表面有纵脊，分生孢子大小为（19.66～27.89） μm×（10.23～15.96） μm，平均为24.15 μm×13.01 μm（图3-D、E）。
A：菌丝块接种橡胶树嫩茎组织变褐；B：菌丝块接种橡胶树老化茎组织变褐；C：病组织接种橡胶老化茎组织变褐；D：橡胶树嫩茎发病后下折；E：接种9 d后的回枯症状；F：接种9 d后枯死茎干上长出的病菌分生孢子器；G：菌丝块接种4 d后的番薯块茎组织蓝变；H：菌丝块接种4 d后的芒果表面呈现黑褐色病斑。
A： Myceliums inoculated rubber tree tender stem tissue browning； B： Myceliums inoculated rubber tree older stem tissue browning； C： Diseased tissue inoculated rubber tree tender stem tissue browning； D： Rubber tree tender stem break after the diseased； E：The symptoms of dieback on rubber tree after 9 days of inoculation； F： Pycnidia of pathogen grow on stems of rubber tree after 9 days of inoculation； G： The tuber tissue of sweet potato turned blue after four days of inoculation； H： The surface of the mango inoculated for 4 days showed dark brown spot.
2.3.2 分子生物学技术鉴定结果 经测序，病原菌rDNA-ITS序列为506 bp（NCBI登录号为MF952885），Bth、Bt2和EF1序列分别为391 bp（NCBI登录号为MG271758）、432 bp（NCBI登录号为MG000590）和290 bp（NCBI登录号为MG000591）（图4）。与NCBI登录号为KY432690.1、MF114110.1、KP698094.1、FJ150695等可可毛色二孢[Lasiodiplodia theobromae （Pat.） Criff. et Maubl.]序列的相似度为99%，结合形态学特征观察及分子生物学技术鉴定结果，将引起橡胶幼树回枯病的病原菌鉴定为可可毛色二孢菌[Lasiodiplodia theobromae （Pat.） Criff. et Maubl.]。
2.4 生物学特性测定
2.4.1 不同温度对病原菌菌丝生长的影响 在所设置的10组不同温度处理中，病原菌在15～40 ℃的条件下均能生长，适宜生长的温度为28～34 ℃，最适生长温度为30 ℃，40 ℃时生长较慢，在10 ℃时则不生长（图5）。
2.4.2 不同光照对病原菌菌丝生长的影响 在不同的光照处理中，病原菌的菌落生长势基本一致，表明不同的光照条件对菌丝的生长无明显影响（图6）。
2.4.3 不同pH值对病原菌菌丝生长的影响 病原菌在pH 2～10条件下均可生长，适宜生长的pH值为4～6，最适pH值为4，表明病菌喜欢偏酸的环境（图7）。 M： Marker； 1： EF1； 2： Bt2； 3： Bth； 4： rDNA-ITS.
不同大写字母表示0.01水平上的差异极显著，不同小写字母表示0.05水平上的差异显著。下同。
Different capital letters mean extremely significant different at 0.01 level， Different small letters mean significant different at 0.05 level. The same as below.
2.4.4 不同碳、氮源对病原菌菌丝生长的影响 不同碳源对菌丝生长的影响：病原菌的菌丝在以葡萄糖为碳源的培养基中直径最大，为最适碳源，其次为可溶性淀粉，在D-果糖中长势缓慢，菌落直径小于缺碳处理（图8）。
不同氮源对菌丝生长的影响：病原菌菌丝在以大豆蛋白胨为氮源的培养基中直径最大，长势最好，为最适氮源，其次为L-天冬酰胺，以氯化铵、硫酸铵和硝酸铵为氮源的培养基中长势缓慢，菌落直径小于缺氮处理（图9）。
3 讨论
可可毛色二孢菌[Lasiodiplodia theobromae （Pat.） Criff. et Maubl.]也称可可球二孢菌（Botrydiplodia theobromae Pat.）[15，18]，可侵染菠蘿、番木瓜、柚子、木菠萝、芒果、香蕉、柑桔、番石榴、无花果、腰果、可可、山竹、桑树、麻风树、桉树、沉香、木薯等植物的果实、叶片、枝干或根，引起焦腐、蒂腐、溃疡、枝枯、流胶、回枯和根腐等症状[1， 6， 15-16， 18-35]，2012年Nghia报道在越南的橡胶上分离到Botryodiplodia theobromae，Lasiodiplodia theobromae可侵染橡胶木、杨木、松木等引起木材蓝变[5， 36-40]。目前在中国尚未见由可可球二孢引起橡胶回枯病的相关报道。橡胶树回枯病的主要症状为小枝受害后先干枯，蔓延到茎干后由上到下回枯，木质部组织发生蓝变，茎干上有时伴随流胶，与胡美姣等[16]报道的芒果树回枯病、Frrari等[23]报道的柑桔回枯病、Ang Boon Beng[1]和Mbenoun等[27]报道的可可突发性回枯病等症状相类似。本研究对引起海南橡胶幼树回枯病的病原菌进行形态鉴定及分子生物学分析，鉴定其为可可毛色二孢菌[Lasiodiplodia theobromae （Pat.） Criff. et Maub]，这是国内发现此菌可引起橡胶树枝干病害。在病原菌的分子鉴定中利用了4组引物进行PCR扩增，其中3组特异性引物的运用进一步增强了病原菌分子鉴定的准确性。
病原菌人工接种可侵染番薯块茎引起组织蓝变，也能侵染芒果果实呈现黑褐色病斑。利用木屑培养基可诱导产生子实体。该病原菌最适生长温度为30 ℃，与前人的研究结果基本一致[16， 41]。病原菌最适生长pH值为4，与黄思良等[41]研究所得出的可可球二孢最适pH为5.0～5.5相比更偏酸性；最适碳源为葡萄糖，最适氮源为大豆蛋白胨，这与胡美姣
等[16]研究报道的芒果上的可可球二孢对碳、氮源选择不严格的结果不尽相同；且病原菌在不同光照条件的菌丝生长速度基本一致，这也与刘媛等[42]和杨波等[28]研究的可可球二孢菌喜光不同，是否由于寄主不同存在小种差异有待进一步研究。调查中发现，海南橡胶幼树回枯病主要发生在3～7月高温、干旱、少雨的季节，且胶园地面植被少或覆盖少、阳光易曝晒的时间长、胶树抗性弱时发病严重；研究发现病原菌易从枝条上的伤口侵入，嫩茎被侵染后发病迅速，易枯死，对橡胶幼树存在较大危害性，在生产防治中应给予高度重视并加强监测和防控。
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