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【摘要】：水产品营养丰富，因而受到越来越多人的喜爱。但是因为微生物的污染所引发的食源性疾病的危害也越来越大。传统的水产品微生物检测样品制备方法复杂，花费时间较长，容易出现污染。本文探究了一种新的样品制备方法—用拍打式均质器制备样品，经过多次试验，该方法简单高效，适合所有样品，对微生物没有损伤，匀质过程全密封，不会污染样品，而且每个袋子匀质一个样品，也不会造成交叉污染。此外，匀浆器袋子透明，可以随时观察匀浆情况，避免了多次开启可能造成的污染。
【关键词】：水产品 微生物 检测 样品制备 新方法
引言
水产品中含有的微生物通常包括下面几类：1、水产品本身原有的细菌，这类细菌在水中广泛分布，像冷源性细菌肉毒杆菌（Clostridium Botulinum），还有嗜热型致病菌像霍乱弧菌（Listeria monocytosens）等;2、人为污染的细菌，它们主要分布于人和动物肠道内以及被人或动物粪便污染的水环境中 ，比较常见的有沙门氏菌（Salmonellussp.）和大肠杆菌（Escherichia.）除此以外，还包括一类病毒，它们主要以双壳软体动物为寄居对象，像甲型肝炎病毒（Hepatitis-typeA，HAV）非甲非乙肝炎（Non-A and Non-B）病毒等。
以上这些微生物所引起的食源性疾病是影响食品安全的主要因素之一。目前对水产品微生物检测主要是针对一般的污染，像大肠杆菌、菌落总数，还有致病菌，如沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等。传统的微生物检测主要以分离培养、生化试验和血清学试验进行判断，操作复杂，而且劳动量大，监测周期长，关键是特异性也不高，一般很难达到新鲜水产品贮藏时间短并且需要快速准确检测的要求[1]。
市面上销售的水产品需要经过质检部门对其可能含有的微生物进行检测，确保其安全后才可以流入市场。固体样品在微生物检测前要经过处理才能进行后续分析。据数字统计，样品前处理所用的时间可以占到整个检测时间的60%以上，并且不恰当的样品前处理常常会影响后期的数据统计分析。因此，提高样品前处理的效率并且控制检测过程中的交叉污染对整个水产品微生物检测具有重要意义。
传统的微生物检测样品制备方法包括稀释和匀质两个步骤，手工稀释通常是取待检测样品25mg（或25ml）放入装有225ml的稀释液的灭菌玻璃瓶内或灭菌乳钵内，还需要225ml的稀释液量筒，整个过程很容易污染，且操作量大，容易失误。均质通常也是将样品直接处于刀头式匀质容器中，很容易交叉污染。此外剪切力作用于样品，生物活性遭到破坏。每处理一个样品就需要清洗一次刀头或者整个罐体，必要时还需要高温高压灭菌，操作繁琐，耗费大量时间[2]。
1、 材料与方法
1.1 材料来源与种类 待检测水产品样品采集于本市集贸市场、超市以及酒店，主要包括生食和鲜冻水产品共计29份样品。
1.2 实验器械与试剂 重量稀释器和拍打匀浆机（Interscience，法国）
1.3 方法
1.3.1 待测样品为冷冻产品。在18-27℃温度下最多存放3h，不能超过24h，应尽快制样进行检验;待测样品为干或硬的产品。在均质器中均质最多不要超过2.5min，并且对于某些干硬或者异质产品，为了避免温度过高，在均质前要将样品切碎或者磨碎，但均质时间不宜超过1min，以免温度过高破坏样品生物学活性;待测样品酸性样品，最重要的是在酸性样品的制备过程中要调整pH值到中性;待测样品为高脂类食品（脂肪含量在20%以上）。应该根据脂肪含量，在稀释液中加入（1-10）g/聚山梨醇酯80（或者吐温80），目的是促进悬浮过程中的乳化作用。
1.3.2 自动稀释
（1）用无菌样品袋采集样品，每个袋子采集一种样品，避免交叉污染。
（2）把开袋器Bagopen放在重量稀释器上，这样可以避免用水开袋造成的污染。
（3）在重量稀释器BabyGravimat上设定好稀释倍数，一般设为10.放上均质袋，重量设为零，加入样品，按下go键，开始自动稀释，如果稀释过程中稀释液用完可以中途停止加液再继续;每个操作都会有提示，所以不会有错误操作。重量稀释倍数可以在1-99之间自由设定，实现自动重量稀释和定量分注。
1.3.3 拍打匀浆
（1）上述稀释好的样品置于拍打均质机400VW中，设定好拍打时间和速度，时间10-360秒运行，速度6-9次。设定好后，按下右侧的把手，均质开始。
（2）批量处理样品时，可以将处理好的样品用Bagclip封口后放入样品存放架Bagrack中，用于后续的分析。
（3）如果袋子有液体泄漏，均质器底部的滴水盘可以接住，防止污染实验室的桌面。
（4）用过一段时间后，需要清洗均质机，这时可以将前窗口完全向后抬起，拔下拍打桨叶，彻底清洗干净[3]。
2 、结果与分析
该方法与水产品微生物检测样品制备的传统方法相比有很多优点，见表一。
拍打式均质器制备样品与传统方法制备优点比较
传统方法
快速方法
稀释
手工操作法
自动重量稀释法
取检样25g或是25ml，放于装有225ml稀释液的灭菌玻璃瓶内或是灭菌乳钵内
设定稀释倍数为10，稀释液自动加入到装有样品的无菌袋中，准确率达到98%以上
玻璃瓶内或是乳钵灭菌处理，225ml稀释量筒
无菌带无需再处理，加样自动进行
手动操作
自动进行
样品量很大，消耗大量时间，容易出现操作失误
快速，节省时间60%时间，不会出现操作失误
均质
刀头式
拍打式
样品直接处于刀头式均质器中，容易产生交叉污染
样品处于无菌均质袋中
剪切力作用于样品，生物活性较差
怕大力作用于样品，生物活性较高
没处理一次样品就需要清洁一次刀头或者整个罐体，必要时还需要高温高压灭菌以避免交叉污染，操作非常繁琐，且耗费大量时间
操作完成后均质袋可直接丢弃，不需要后期繁琐的处理，更换样品只需要更换均质袋就可以，不会产生交叉污染，操作非常方便。
参考文献：
【关键词】：水产品 微生物 检测 样品制备 新方法
引言
水产品中含有的微生物通常包括下面几类：1、水产品本身原有的细菌，这类细菌在水中广泛分布，像冷源性细菌肉毒杆菌（Clostridium Botulinum），还有嗜热型致病菌像霍乱弧菌（Listeria monocytosens）等;2、人为污染的细菌，它们主要分布于人和动物肠道内以及被人或动物粪便污染的水环境中 ，比较常见的有沙门氏菌（Salmonellussp.）和大肠杆菌（Escherichia.）除此以外，还包括一类病毒，它们主要以双壳软体动物为寄居对象，像甲型肝炎病毒（Hepatitis-typeA，HAV）非甲非乙肝炎（Non-A and Non-B）病毒等。
以上这些微生物所引起的食源性疾病是影响食品安全的主要因素之一。目前对水产品微生物检测主要是针对一般的污染，像大肠杆菌、菌落总数，还有致病菌，如沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等。传统的微生物检测主要以分离培养、生化试验和血清学试验进行判断，操作复杂，而且劳动量大，监测周期长，关键是特异性也不高，一般很难达到新鲜水产品贮藏时间短并且需要快速准确检测的要求[1]。
市面上销售的水产品需要经过质检部门对其可能含有的微生物进行检测，确保其安全后才可以流入市场。固体样品在微生物检测前要经过处理才能进行后续分析。据数字统计，样品前处理所用的时间可以占到整个检测时间的60%以上，并且不恰当的样品前处理常常会影响后期的数据统计分析。因此，提高样品前处理的效率并且控制检测过程中的交叉污染对整个水产品微生物检测具有重要意义。
传统的微生物检测样品制备方法包括稀释和匀质两个步骤，手工稀释通常是取待检测样品25mg（或25ml）放入装有225ml的稀释液的灭菌玻璃瓶内或灭菌乳钵内，还需要225ml的稀释液量筒，整个过程很容易污染，且操作量大，容易失误。均质通常也是将样品直接处于刀头式匀质容器中，很容易交叉污染。此外剪切力作用于样品，生物活性遭到破坏。每处理一个样品就需要清洗一次刀头或者整个罐体，必要时还需要高温高压灭菌，操作繁琐，耗费大量时间[2]。
1、 材料与方法
1.1 材料来源与种类 待检测水产品样品采集于本市集贸市场、超市以及酒店，主要包括生食和鲜冻水产品共计29份样品。
1.2 实验器械与试剂 重量稀释器和拍打匀浆机（Interscience，法国）
1.3 方法
1.3.1 待测样品为冷冻产品。在18-27℃温度下最多存放3h，不能超过24h，应尽快制样进行检验;待测样品为干或硬的产品。在均质器中均质最多不要超过2.5min，并且对于某些干硬或者异质产品，为了避免温度过高，在均质前要将样品切碎或者磨碎，但均质时间不宜超过1min，以免温度过高破坏样品生物学活性;待测样品酸性样品，最重要的是在酸性样品的制备过程中要调整pH值到中性;待测样品为高脂类食品（脂肪含量在20%以上）。应该根据脂肪含量，在稀释液中加入（1-10）g/聚山梨醇酯80（或者吐温80），目的是促进悬浮过程中的乳化作用。
1.3.2 自动稀释
（1）用无菌样品袋采集样品，每个袋子采集一种样品，避免交叉污染。
（2）把开袋器Bagopen放在重量稀释器上，这样可以避免用水开袋造成的污染。
（3）在重量稀释器BabyGravimat上设定好稀释倍数，一般设为10.放上均质袋，重量设为零，加入样品，按下go键，开始自动稀释，如果稀释过程中稀释液用完可以中途停止加液再继续;每个操作都会有提示，所以不会有错误操作。重量稀释倍数可以在1-99之间自由设定，实现自动重量稀释和定量分注。
1.3.3 拍打匀浆
（1）上述稀释好的样品置于拍打均质机400VW中，设定好拍打时间和速度，时间10-360秒运行，速度6-9次。设定好后，按下右侧的把手，均质开始。
（2）批量处理样品时，可以将处理好的样品用Bagclip封口后放入样品存放架Bagrack中，用于后续的分析。
（3）如果袋子有液体泄漏，均质器底部的滴水盘可以接住，防止污染实验室的桌面。
（4）用过一段时间后，需要清洗均质机，这时可以将前窗口完全向后抬起，拔下拍打桨叶，彻底清洗干净[3]。
2 、结果与分析
该方法与水产品微生物检测样品制备的传统方法相比有很多优点，见表一。
拍打式均质器制备样品与传统方法制备优点比较
传统方法
快速方法
稀释
手工操作法
自动重量稀释法
取检样25g或是25ml，放于装有225ml稀释液的灭菌玻璃瓶内或是灭菌乳钵内
设定稀释倍数为10，稀释液自动加入到装有样品的无菌袋中，准确率达到98%以上
玻璃瓶内或是乳钵灭菌处理，225ml稀释量筒
无菌带无需再处理，加样自动进行
手动操作
自动进行
样品量很大，消耗大量时间，容易出现操作失误
快速，节省时间60%时间，不会出现操作失误
均质
刀头式
拍打式
样品直接处于刀头式均质器中，容易产生交叉污染
样品处于无菌均质袋中
剪切力作用于样品，生物活性较差
怕大力作用于样品，生物活性较高
没处理一次样品就需要清洁一次刀头或者整个罐体，必要时还需要高温高压灭菌以避免交叉污染，操作非常繁琐，且耗费大量时间
操作完成后均质袋可直接丢弃，不需要后期繁琐的处理，更换样品只需要更换均质袋就可以，不会产生交叉污染，操作非常方便。
参考文献：
- 杨文鸽，孙翠玲，潘云娣，等.水产品中致病微生物的快速检测方法[J].中国食品学报，2006，6，（1）：402-406.
- 赵波，马宗欣.食品微生物检测样品的采集和制备[J].南方工业，2009，（5）：41-45
- 法国AES Chemunex 公司.超静音拍击式均质器实现高效安全均质[J].食品安全导刊，2008，（1）：65