论文部分内容阅读
摘 要 由糖基转移酶催化产生的次生代谢物质对植物抵御和适应环境的变化起着重要作用。为探讨青花菜在酸雨胁迫下糖基转移酶的表达变化，对青花菜β-1，4-木糖基转移酶IRX9H基因的cDNA序列全长进行克隆，并对其进行生物信息学和表达分析。结果表明：青花菜β-1，4-木糖基转移酶IRX9H基因的cDNA全长为1 550 bp，开放阅读框为1 155 bp，编码384个氨基酸，推测分子式为C1964H3044N558O567S11，分子量为43 897.8，没有信号肽。系统进化树分析结果表明，该青花菜基因与拟南芥聚类关系最近。利用实时荧光定量PCR研究模拟酸雨胁迫下β-1， 4-木糖基转移酶IRX9H基因的表达量，结果显示该基因的表达量在模拟酸雨胁迫初期显著增大，随着时间的延长，又开始下降，这表明其在青花菜抗酸雨胁迫中发挥了作用。
关键词 青花菜；β-1， 4-木糖基转移酶IRX9H基因；分子克隆；模拟酸雨；表达
中图分类号 S635.3 文献标识码 A
Cloning of β-1， 4 - xylosyltransferase IRX9H in Broccoli
（Brassica oleracea var. italica） and Its Expression
in Broccoli Under Simulated Acid Rain Stress
GAO Shichao， ZHONG Fenglin*， LIN Yizhang， ZHAO Ruili， LIN Junfang， YE Liping
College of Horticulture， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China
Abstract Secondary metabolites catalyzed by glycosyltransferase played an important role in resisting and adapting to environmental changes for plants. The full-length cDNA of β-1，4-xylosyltransferase IRX9H was cloned in order to explore its expression in broccoli under acid rain stress， which was analyzed by bioinformatics method and real-time PCR. The results showed that the full-length DNA was 1 550 bp and the opening reading frame（ORF）was 1 155 bp. The ORF encoded 384 amino acids， a deduced formula of C1964H3044N558O567S11 with molecular weight 43 897.8， but no signal peptide. Phylogenetic tree analysis revealed that the gene of broccoli had closer relationship with that from Arabidopsis. The analysis by real-time PCR suggested that the expression of β-1，4-xylosyltransferase IRX9H genes in broccoli under simulated acid rain stress increased significantly at first，and then declined due to longer duration of simulated acid rain stress， which was involved in signalling pathways in response to the acid rain stress.
Key words Brassica oleracea；β-1，4-xylosyltransferase IRX9H；Molecular cloning；Simulated acid rain； Expression
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.04.020
青花菜（Brassica oleracea var. italica）又名青花椰菜、意大利花菜、意大利芥蓝、木立花椰菜、绿花菜、茎椰菜、西兰花，属于十字花科芸薹属一、二年生草本植物。甘蓝种中以绿花球为产品的一个变种，以主茎及侧枝顶端形成的绿色花球为产品，其营养丰富，色、香、味具佳，具有抗氧化、抗病毒、助消化和抗衰老等作用[1-5]，是国际市场十分畅销的一种名特蔬菜。近年来，东亚地区己经成为继欧洲和北美之后的第三大酸雨区，且受影响面积有快速增加的趋势，致使酸雨己经成为中国最重要的环境问题之一[6]。已有大量研究结果表明，酸雨会破坏蔬菜的正常生长发育，从而降低蔬菜产量[7-11]。
糖基转移酶是一类普遍存在于动物、植物、真菌等生物体内能够通过合成糖苷键将糖基连接到特定受体的酶[12]。目前此本科类可被分为90多个不同家族，其中，GT家族1的研究报道较多，该家族酶类的糖基化修饰在植物代谢过程中具有重要地位，多数情况下糖基化是植物合成皂苷、黄酮化合物、甾体生物碱、氰醇等次生代谢物质的最后一步反应[13-15]，而合成的次生代谢物质对植物抵御和适应环境的变化起着重要作用[16]。糖基化产物也是细胞壁结构的组分，可用于免疫反应、细胞间信号传递和蛋白质糖基化，这些生物学功能使糖基转移酶日渐受到人们的重视[17]。β-1， 4-木糖基转移酶IRX9H（β-1，4-xylosyltransferase IRX9H）是糖基转移酶家族GT家族1中的成员，以UDP-木糖（UDP-Xyl）作为专一性的糖供体[13]，而GT家族1中所含成员多与植物的次级代谢相关，可以推测β-1， 4-木糖基转移酶可能参与了植物在逆境胁迫下的抗性机制。 迄今为止，国内外从分子机制研究青花菜抗逆性的报道较少，仅蒋明等[3， 18]、彭礼琼等[19]研究了霜霉病侵染下查尔酮合成酶、抗坏血酸过氧化物酶的作用机制。本研究从青花菜叶片中克隆得到β-1，4-木糖基转移酶IRX9H基因，并对该基因进行生物信息学和表达分析，以期探究其在酸雨胁迫下的表达变化，为进一步研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
本试验材料为卓越青花菜种子，由福建立信种苗有限公司提供。选取饱满度一致的种子，浸种催芽后，点播于100穴的育苗盘内，待植株长至2片叶子、高约5 cm时，选取长势良好、一致的青花菜植株，移栽于含有混合营养基质的营养钵内，培育青花菜。
1.2 方法
1.2.1 青花菜RNA的提取和逆转录 待青花菜幼苗长到4～5叶期，选取生长良好的植株，取其叶片为材料。采用Trizol法提取青花菜叶片的总RNA，Trizol试剂由Invitrogen公司提供，其提取方法参考其说明书。采用逆转录试剂盒SuperscriptTMⅢ First-Strand cDNA Synthesis System for RT-PCR合成3′端cDNA，其中需用引物AP代替试剂盒引物。采用Clontech公司的SMARTTM RACE cDNA Amplication Kit 的试剂盒合成5′端cDNA。
1.2.2 β-1，4-木糖基转移酶IRX9H基因的克隆
实验室利用cDNA-AFLP技术分析青花菜在模拟酸雨胁迫下表达谱的变化，获得了与拟南芥β-1， 4-木糖基转移酶IRX9H（NM_102525.2）基因同源性较高的TDF差异片段，大小为236 bp。
3′RACE：以合成的3′端cDNA为模板，上游引物为B3-175和B3-111，下游引物为通用引物AUAP（表1），反应体系为：cDNA 1 μL、上游引物（10 μmol/μL）1μL、下游引物（10 μmol/μL）1 μL、2×MasterMix 12.5 μL、ddH2O 9.5 μL，共25 μL的体系。PCR扩增程序为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，引物退火温度30 s，72 ℃ 30 s，共30个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。3′RACE采2轮反应，第一轮反应体系以B3-175和AUAP为引物，退火温度为55.8 ℃，PCR扩增结束后，产物稀释100倍作为第二轮扩增模板，引物为B3-111和AUAP，退火温度为53.2 ℃。对目的片段的回收、连接、转化、验证与测序参照陈琼娥[20]的方法。
5′RACE：以合成的5′端cDNA为模板，下游引物为B5-48和B5-195，上游引物为通用引物UPM和NUP（表1）。5′RACE采用两轮反应，第一轮反应体系以B5-48和UPM为引物，退火温度为58.9 ℃，延伸时间为1 min 20 s，PCR扩增结束后，产物稀释100倍作为第二轮扩增模板，引物为B5-195和NUP，退火温度为52.4 ℃，延伸时间为1 min 20 s，其他的反应体系和程序同3′RACE。对目的片段的回收、连接、转化、验证与测序参照陈琼娥[20]的方法。
利用DNAMAN 6.0软件把克隆得到3′端片段、5′端片段和原来的差异片段序列进行拼接。
1.2.3 开放阅读框验证 通过NCBI网站的“ORF Finder”工具查找拼接后基因全长的起始密码子和终止密码子，做上标记，在其附近设计开放阅读框的上下游引物B-F和B-R（表1）。退火温度为57.4 ℃，延伸时间为1 min 20 s，其他的反应体系和程序同3′RACE，扩增后对目的片段进行回收与测序。
1.2.4 β-1，4-木糖基转移酶IRX9H基因的生物信息学分析 应用NCBI的“blastn”、“blastp”等工具对该基因进行同源性分析，利用DNAMAN6.0软件进行序列比对，采用Smart服务器分析保守域和功能位点，利用Protparam在线分析工具对该基因编码蛋白的理化性质推测分析，利用SignaIP 4.1工具对该基因的信号肽进行预测分析，利用软件MEGA5.2绘制系统进化树。
1.2.5 模拟酸雨胁迫下的β-1，4-木糖基转移酶IRX9H基因的表达分析 根据中国福建地区主要以SO42-为主的特点，用分析纯H2SO4和NH4NO3配制成SO42-和NO3-的当量比为4.19的模拟酸雨母液，母液pH值为1.0，取适量母液用蒸馏水稀释，配置pH2.0的模拟酸雨，用pHS-2C酸度计调节pH值。待青花菜幼苗长至4～5叶期，选取生长良好的青花菜，用配置好的pH2.0的模拟酸雨喷洒，叶片滴液时停止喷洒，每天处理1次，共处理9 d，每个处理重复3次。分别取0、3、6、9 d的叶片提取总RNA，用逆转录试剂盒SuperscriptTMⅢ First-Strand cDNA Synthesis System for RT-PCR进行逆转录，用AP代替试剂盒引物。荧光定量PCR仪为BioRad icycler iQ，上游引物为B-FN，下游引物为B-RN（表1）。反应体系和程序按照TaKaRa公司的SYBRR Premix Ex TaqTM（Tli RnaseH PIus）试剂盒的说明书，PCR扩增程序为：预变性94 ℃ 20 s；94 ℃变性10 s，58 ℃退火20 s，40个循环。试验以18S为内参基因，重复3次，采用2-ΔΔCt法计算不同时间IRX9H基因的相对表达量。
2 结果与分析
2.1 β-1，4-木糖基转移酶IRX9H基因的克隆
通过3RACE扩增，得到了358 bp左右的片段（图1-A）。测序结果经过blastn比对，与拟南芥β-1，4-木糖基转移IRX9H的mRNA相似度为83%，说明3′RACE 获得的片段与通过cDNA-AFLP技术获得的差异片段属于同一基因。 通过5′RACE扩增，得到了1 186 bp左右的片段（图1-B）。测序结果经过blastn比对，与拟南芥β-1，4-木糖基转移IRX9H的mRNA相似度为85%，说明5′RACE 获得的片段与通过cDNA-AFLP技术获得的部分差异片段属于同一基因。
将TDF片段、3′RACE和5′RACE获得的序列利用DNAMAN 6.0软件进行拼接，得到一条1 550 bp的全长cDNA序列，包含1个1 155 bp的ORF阅读框，编码的蛋白质含有384个氨基酸（图2）。由于该基因与拟南芥的β-1，4-木糖基转移酶IRX9H（NM_102525.2）基因同源性为91%，因此，该基因命名为青花菜β-1，4-木糖基转移酶IRX9H基因，GenBank登录号为：KF715851。
2.2 开放阅读框结果分析
用1%的琼脂糖凝胶电泳检测开放阅读框PCR产物，可得到1条1 100 bp左右的片段（图1-C），对该条带进行回收与测序，所得的序列和编码的氨基酸见图2中1～1 155部分序列。
2.3 β-1，4-木糖基转移酶IRX9H基因的生物信息学分析
利用DNAMAN 6.0软件将β-1，4-木糖基转移酶IRX9H基因编码的氨基酸序列与其他植物进行同源性比较，发现该基因与拟南芥-UDP（Arabidopsis thaliana-UDP）、琴叶拟南芥（Arabidopsis lyrata）、芥菜（Capsella rubella）和拟南芥-IRX9H（thaliala-IRX9H）的相似性分别为88%、82%、82%和82%（图3）。
琴叶拟南芥： Arabidopsis lyrata（GenBank： XP_002893477.1）； 芥菜： Capsella rubella（GenBank： EOA37898.1）； 拟南芥-IRX9H： Arabidopsis thaliala-IRX9H（GenBank： NP_973922.1）； 拟南芥-UDP： Arabidopsis thaliala-UDP（GenBank： AAM64331.1）。
由NCBI中“blastp”工具在线分析结果可知，该蛋白序列含有Beta1， 3-glucuronyltransferase I（GlcAT-I）的部分区域，位于氨基酸序列的140～350处具有“DXD”模体，这一区域参与蛋白多糖合成的初始步骤。
在Smart服务器分析保守域和功能位点，发现该氨基酸序列在23～50处有1个长度为28个氨基酸的低复杂度区域，E-value值为116 000；在14～74处发现1个Cation_ATPase_N区域，E-value值为116 000，该保守N-末端区域发现植物机体借助于P型ATP酶进行阳离子转运，包括运输H+、Na+、Ca2+、Na+/K+、H+/K+等；在98～213处存在SEA保守域，E-value值为2 170，推测其具有调节或绑定碳水化合物侧链的功能；在162～251处存在Bro-N 域，E-value值为99 400，这属于一个家族，包括杆状病毒BRO和ALI模体蛋白的N-末端，BRO蛋白的功能目前是未知的；在187～254处存在1个BLUF 域，E-value值为101 000， BLUF域已被证明与FAD结合在阿帕蛋白，阿帕蛋白参与光合作用系统的蓝光响应机制；在187～366处存在TIR域，E-value值为1 490，该域在昆虫和哺乳动物的抗真菌免疫反应中发挥了关键作用，同时含有该域的植物蛋白参与了宿主防御机制。
利用Protparam在线分析工具对该基因编码蛋白的理化性质推测分析，该蛋白包含384个氨基酸，分子量为43 897.8，等电点为9.08，判断为碱性蛋白，分子式为C1964H3044N558O567S11，原子总数为6 144。不稳定系数为63.46，说明该蛋白不稳定。脂肪指数为75.86，亲水性评估值为-0.484，为亲水性蛋白。该蛋白由22种氨基酸组成，其中丝氨酸含量最高，为8.6%。带负电氨基酸总和为44，带正电氨基酸总和为50。
利用SignaIP 4.1工具对该基因的信号肽进行预测分析，没有发现信号肽。
利用MEGA 5.2软件对基因编码蛋白作进化分析。将该基因序列编码的氨基酸序列在NCBI上的blastp搜索，结果发现青花菜的β-1，4-木糖基转移酶IRX9H蛋白与黄瓜（Cucumis sativus）、 草莓（Fragaria vesca）、 葡萄（Vitis vinifera）、 大豆（Glycine max）、 鹰嘴豆（Cicer arietinum）、 番茄（Solanum lycopersicum）和拟南芥（Arabidopsis thaliana）等植物具有同源性。利用MEGA 5.2软件通过Neighbor-Joining（NJ）法构建氨基酸序列的进化树（图4），经过1 000次Boot-strap计算，青花菜与拟南芥的的β-1，4-木糖基转移酶IRX9H基因聚类关系最近。从进化树上看，相同科的植物聚为一类，如大豆、鹰嘴豆2个豆科植物聚为一类，青花菜与拟南芥十字花科植物聚为一类，进化聚类值为100。说明植物β-1，4-木糖基转移酶IRX9H蛋白在同一科属之间具有很高的同源性，推测其在进化上相当保守。
2.4 模拟酸雨胁迫下的β-1，4-木糖基转移酶IRX9H基因的表达分析
利用实时荧光定量PCR技术对青花菜在模拟酸雨胁迫不同时期β-1，4-木糖基转移酶IRX9H基因的表达量进行检测分析。结果表明，在未胁迫时，该基因在青花菜中的表达量较低；胁迫3 d后，该基因表达量大幅度上升，比未胁迫时的对照增加了13倍；而后在胁迫6 d后，该基因表现出下调趋势，但其表达量仍高于对照，为对照的5.64倍；在胁迫9 d后，该基因的表达量低于对照，为对照的65%（图5）。在模拟酸雨胁迫后，该基因表达量迅速上升，之后下降，推测该基因在青花菜的抗酸雨胁迫中发挥了调控作用。 3 讨论与结论
植物在受到逆境胁迫时，可通过自身诱导产生调节物质，起到一定的防御作用。植物糖基转移酶是一类与糖脂、多糖、糖蛋白、核酸、植物次生产物等生物分子的代谢密切相关的酶[21-22]，广泛存在于植物细胞中，主要通过产生糖苷键将供体糖分子或相关基团转移到特异的受体上[23]。糖基转移酶作用有调节激素含量平衡、增加植物对逆性环境的抵抗能力、参与植物次级代谢调节、参与植物脱毒反应、参与植物信号转导[24-25]。对拟南芥基因组序列进行搜索，可找到99个相关的可能的糖基转移酶基因[26]，并已鉴定出这些酶所修饰的次级代谢产物有脱落酸、吲哚乙酸、细胞分裂素等[27]。据此推测，植物受到逆境胁迫时，β-1，4-木糖基转移酶IRX9H基因会影响植物次级代谢物质的生成、信号的传导、调节激素含量等，进而提高自身的逆境生存能力。
基因的功能域对于揭示基因在植物体内的作用具有重要意义。克隆获得β-1，4-木糖基转移酶IRX9H基因含有多个功能域：GlcAT-I部分区域，具有“DXD”模体，参与蛋白多糖合成的初始步骤，“DXD”模体是GT-A超家族的一个重要特征，对酶的催化活性起着不可或缺的作用，主要是通过二价金属阳离子（Mn+）配位作用使“DXD”模体与NDP一糖供体的磷酸基相连[28]；Cation_ATPase_N区域，ATP酶催化ATP水解释放能量，推动质子进行跨膜运输；SEA域是一个与O-糖基化相关的保守域，存在于集聚蛋白、肠激酶、紫色球海胆精蛋白、基底膜蛋白多糖等多种结构体内，这些蛋白功能多样，但共同点是都存在于糖基化的环境内，这个保守域可能调节或协助相邻的碳水化合物结合；BRO-N域功能目前是未知的；TIR域，定点突变和缺失分析结果表明，TIR结构域是Toll和IL-1R活动所必需的部分，已有研究揭示了与该域相关的三个高度保守的区域的功能，盒1（FDAFISY）、盒2（GYKLC-RD-PG）、盒3（一个被氨基酸残基包围的保守W域），其中盒1和盒2参与了结合蛋白的信号传导，而盒3主要涉及附近受体结合作用，这可能是通过与细胞骨架的相互作用而实现的，此外，该域还参与了植物的防御机制。从上述该基因序列各域的功能分析结果可知，该基因在植物体内参与了多糖合成、能量代谢、碳水化合物的结合、光合作用系统的蓝光响应机制、信号传导、宿主防御机制，对植物的生长发育具有重要作用，但具体的作用机制尚不明确，需进一步研究。
青花菜受模拟酸雨胁迫时，叶片最先表现出来。黄辉等[29]深入报道了酸雨对植物生理生态的影响机制：酸雨对植物的影响是先通过叶片的角质层和气孔破坏叶片的内部结构，酸雨中的H+置换叶片中的Mg2+，使得叶绿素的合成受阻，而叶绿素对光能的吸收、传递及光化学反应具有重要影响，因次，抑制了叶片的光合作用；叶片的气孔与植物的蒸腾作用和呼吸作用密切相关，酸雨破坏气孔，造成气孔关闭，进而降低蒸腾速率和呼吸速率，抑制植物正常生长；当酸雨落到叶片上，会加速其中的的K、Ca、Mn、Zn和Mg等金属元素淋溶，促进N、A1及Cu的富集，这种影响导致植物体内元素失衡，影响正常的物质代谢和生理生化过程，降低植株的活力和抗性，最终使叶片褪绿变淡，最后变黄、枯死。本研究利用实时荧光定量PCR技术，对青花菜β-1， 4-木糖基转移酶IRX9H基因在模拟酸雨胁迫不同时间的表达量进行分析，结果表明，随着酸雨处理时间的延长，青花菜β-1，4-木糖基转移酶IRX9H基因的表达量呈现先上升后下降的趋势，在胁迫处理3 d后表达量最高，9 d后最低，并低于对照。这说明当酸雨胁迫时，青花菜β-1，4-木糖基转移酶IRX9H基因被诱导，表达水平迅速增高。一段时间后，表达量又开始下降，其原因可能为：一是，随着模拟酸雨危害程度的加深，诱导该基因的环境恶化，pH值降低，细胞结构被破坏，使得表达量降低；二是，该基因表达后诱导下游的抗性相关基因表达，使得青花菜对模拟酸雨胁迫产生适应，不再诱导β-1，4-木糖基转移酶IRX9H基因的表达[30]；三是，该基因诱导的下游表达基因大量表达后，对自身产生抑制作用，两者存在拮抗关系，导致β-1，4-木糖基转移酶IRX9H基因表达量下降。
本研究从青花菜中克隆到了β-1，4-木糖基转移酶IRX9H基因的cDNA全长，长度为1 550 bp，开放阅读框为1 155 bp，编码384个氨基酸，经同源性比对分析，该基因与拟南芥的β-1，4-木糖基转移酶IRX9H（NM_102525.2）基因同源性为91%，二者都含有“DXD”模体。生物信息学分析结果表明，该序列编码的氨基酸序列中含有GlcAT-I、Cation_ATPase_N区域、SEA保守域、Bro-N域、BLUF域、TIR域多个功能区域，分子式为C1964H3044N558O567S11，分子量为43 897.8，有1个跨膜螺旋区域，没有信号肽。氨基酸序列进化树分析结果显示，青花菜与拟南芥关系最为接近，处于同一分支上。利用实时荧光定量PCR技术对其在模拟酸雨胁迫下的表达进行分析，推测其可能受逆境胁迫诱导，在植物的抗逆性反应中起着非常重要的作用，此结果为下一步研究其在抗酸雨胁迫中的功能奠定了基础。
参考文献
[1] 王 蓉， 何 磊. 西兰花中的抗癌成分及其活性的初步研究[J]. 食品科学， 2009， 30（7）： 243-245.
[2] 孙 勃， 许映君， 徐铁锋，等. 青花菜不同器官生物活性物质和营养成分的研究[J]. 园艺学报， 2010， 37（1）： 59-64.
[3] 蒋 明， 苗立祥， 钱宝英， 等. 青花菜BoCHS2基因的克隆， 表达和反义载体的构建[J]. 核农学报， 2011， 25（3）： 443-447.
[4] Plumb G W， Price K R， Modes M J， et al. Antioxidant properties of the major polyphenolic compounds in broccoli[J]. Free Radical Research， 1997， 27（4）： 429-435. [5] Leja M， Mareczek A， Starzyńska A， et al. Antioxidant ability of broccoli flower buds during short-term storage[J]. Food Chemistry， 2001， 72（2）： 219-222.
[6] 杨开宁. 模拟酸雨对叶菜类蔬菜影响评价模型研究[D]. 长春：吉林大学， 2011.
[7] 廖咏梅， 王 琼. 模拟酸雨对辣椒3种生长指标的影响[J]. 西华师范大学学报（自然科学版）， 2005， 26（2）： 200-203.
[8] 王双明. 模拟酸雨胁迫对菠菜中草酸积累及营养品质的影响[J]. 核农学报， 2012， 26（4）： 717-721.
[9] 曹春信， 周 琴， 韩亮亮，等. 模拟酸雨对油菜花期生理特性和产量的影响[J]. 应用生态学报， 2010， 21（8）： 2 057-2 062.
[10] 王寿超. 模拟不同类型酸雨对小白菜生长，生理及营养品质的影响研究[D]. 长春： 吉林大学， 2012.
[11] 许泽宏， 罗华锋， 王仕潭，等. 模拟酸雨对空心菜营养元素吸收的影响[J]. 宜宾学院学报， 2007， 6（1）： 69-72.
[12] 于寒松， 张继星， 马兰青， 等. 利用CODEHOP方法克隆高山红景天葡萄糖基转移酶基因cDNA片段[J]. 吉林农业大学学报，2008， 30（2）： 150-153.
[13] Bowles D， Isayenkova J， Lim E-K， et al. Glycosyltransferases：managers of small molecules[J]. Current Opinion in Plant Biology， 2005， 8（3）： 254-263.
[14] Jones P， Vogt T. Glycosyltransferases in secondary plant metabolism：tranquilizers and stimulant controllers[J]. Planta，2001， 213（2）： 164-174.
[15] Vogt T， Jones P. Glycosyltransferases in plant natural product synthesis：characterization of a supergene family[J]. Trends in Plant Science， 2000， 5（9）： 380-386.
[16] Lorenc-Kukula K， Kostyń K， Lukaszewicz M， et al. Glucosyltransferase， the gene arrangement and enzyme function[J]. Cel Mol Biol， 2004， 9（5）： 935-946.
[17] 于 洋， 曹飞飞， 陈小龙. 糖基转移酶的性质，作用机制及其在抗生素中的应用[J]. 中国抗生素杂志， 2013， 38（2）： 90-97.
[18] 蒋 明，张志仙，袁菱婧. 青花菜抗坏血酸过氧化物酶基因BOAPX2的克隆与表达分析[J]. 植物病理学报， 2012， 42（4）：374-380.
[19] 彭礼琼， 蒋 明， 郭志平，等. 青花菜查尔酮合成酶基因BoCHS的克隆，表达及序列分析[J]. 湖北农业科学， 2010， 49（8）： 1 796-1 800.
[20] 陈琼娥. 草莓果实cDNA-AFLP技术体系构建及UFGT基因克隆[D]. 福州： 福建农林大学， 2012.
[21] Gachon C M， Langlois-Meurinne M， Saindrenan P. Plant secondary metabolism glycosyltransferases： the emerging functional analysis[J]. Trends in Plant Science， 2005， 10（11）：542-549.
[22] Charnock S J， Henrissat B， Davies G J. Three-dimensional structures of UDP-sugar glycosyltransferases illuminate the biosynthesis of plant polysaccharides[J]. Plant Physiology， 2001， 125（2）： 527-531.
[23] Coutinho P M， Deleury E， Davies G J， et al. An evolving hierarchical family classification for glycosyltransferases[J]. Journal of Molecular Biology， 2003， 328（2）： 307-317.
[24] 王艳文. 杨树糖基转移酶与木质素合成关系的转基因研究[D]. 济南： 山东大学， 2012.
[25] 宋学洲. 葫芦巴中一个新的糖基转移酶的研究[D]. 长春： 吉林农业大学， 2012.
[26] Li Y， Baldauf S， Lim E-K， et al. Phylogenetic analysis of the UDP-glycosyltransferase multigene family of Arabidopsis thaliana[J]. Journal of Biological Chemistry， 2001， 276（6）： 4 338-4 343.
[27] Hou B， Lim E K， Higgins G S， et al. N-glucosylation of cytokinins by glycosyltransferases of Arabidopsis thaliana[J]. Journal of Biological Chemistry， 2004， 279（46）： 47 822-47 832.
[28] 丁向明， 吴士良， 陈惠黎. 糖基转移酶的结构生物学[J]. 生命的化学， 2003， 23（5）： 369-371.
[29] 黄 辉， 黄朝法. 酸雨对植物生理生态特性的影响研究进展[J]. 林业勘察设计， 2008， 1（1）： 46-49.
[30] 杨 帆， 丁 菲， 杜天真. 盐胁迫下构树DREB转录因子基因表达的实时荧光定量PCR分析[J]. 林业科学， 2010， 4（1）：146-150.
关键词 青花菜；β-1， 4-木糖基转移酶IRX9H基因；分子克隆；模拟酸雨；表达
中图分类号 S635.3 文献标识码 A
Cloning of β-1， 4 - xylosyltransferase IRX9H in Broccoli
（Brassica oleracea var. italica） and Its Expression
in Broccoli Under Simulated Acid Rain Stress
GAO Shichao， ZHONG Fenglin*， LIN Yizhang， ZHAO Ruili， LIN Junfang， YE Liping
College of Horticulture， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China
Abstract Secondary metabolites catalyzed by glycosyltransferase played an important role in resisting and adapting to environmental changes for plants. The full-length cDNA of β-1，4-xylosyltransferase IRX9H was cloned in order to explore its expression in broccoli under acid rain stress， which was analyzed by bioinformatics method and real-time PCR. The results showed that the full-length DNA was 1 550 bp and the opening reading frame（ORF）was 1 155 bp. The ORF encoded 384 amino acids， a deduced formula of C1964H3044N558O567S11 with molecular weight 43 897.8， but no signal peptide. Phylogenetic tree analysis revealed that the gene of broccoli had closer relationship with that from Arabidopsis. The analysis by real-time PCR suggested that the expression of β-1，4-xylosyltransferase IRX9H genes in broccoli under simulated acid rain stress increased significantly at first，and then declined due to longer duration of simulated acid rain stress， which was involved in signalling pathways in response to the acid rain stress.
Key words Brassica oleracea；β-1，4-xylosyltransferase IRX9H；Molecular cloning；Simulated acid rain； Expression
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.04.020
青花菜（Brassica oleracea var. italica）又名青花椰菜、意大利花菜、意大利芥蓝、木立花椰菜、绿花菜、茎椰菜、西兰花，属于十字花科芸薹属一、二年生草本植物。甘蓝种中以绿花球为产品的一个变种，以主茎及侧枝顶端形成的绿色花球为产品，其营养丰富，色、香、味具佳，具有抗氧化、抗病毒、助消化和抗衰老等作用[1-5]，是国际市场十分畅销的一种名特蔬菜。近年来，东亚地区己经成为继欧洲和北美之后的第三大酸雨区，且受影响面积有快速增加的趋势，致使酸雨己经成为中国最重要的环境问题之一[6]。已有大量研究结果表明，酸雨会破坏蔬菜的正常生长发育，从而降低蔬菜产量[7-11]。
糖基转移酶是一类普遍存在于动物、植物、真菌等生物体内能够通过合成糖苷键将糖基连接到特定受体的酶[12]。目前此本科类可被分为90多个不同家族，其中，GT家族1的研究报道较多，该家族酶类的糖基化修饰在植物代谢过程中具有重要地位，多数情况下糖基化是植物合成皂苷、黄酮化合物、甾体生物碱、氰醇等次生代谢物质的最后一步反应[13-15]，而合成的次生代谢物质对植物抵御和适应环境的变化起着重要作用[16]。糖基化产物也是细胞壁结构的组分，可用于免疫反应、细胞间信号传递和蛋白质糖基化，这些生物学功能使糖基转移酶日渐受到人们的重视[17]。β-1， 4-木糖基转移酶IRX9H（β-1，4-xylosyltransferase IRX9H）是糖基转移酶家族GT家族1中的成员，以UDP-木糖（UDP-Xyl）作为专一性的糖供体[13]，而GT家族1中所含成员多与植物的次级代谢相关，可以推测β-1， 4-木糖基转移酶可能参与了植物在逆境胁迫下的抗性机制。 迄今为止，国内外从分子机制研究青花菜抗逆性的报道较少，仅蒋明等[3， 18]、彭礼琼等[19]研究了霜霉病侵染下查尔酮合成酶、抗坏血酸过氧化物酶的作用机制。本研究从青花菜叶片中克隆得到β-1，4-木糖基转移酶IRX9H基因，并对该基因进行生物信息学和表达分析，以期探究其在酸雨胁迫下的表达变化，为进一步研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
本试验材料为卓越青花菜种子，由福建立信种苗有限公司提供。选取饱满度一致的种子，浸种催芽后，点播于100穴的育苗盘内，待植株长至2片叶子、高约5 cm时，选取长势良好、一致的青花菜植株，移栽于含有混合营养基质的营养钵内，培育青花菜。
1.2 方法
1.2.1 青花菜RNA的提取和逆转录 待青花菜幼苗长到4～5叶期，选取生长良好的植株，取其叶片为材料。采用Trizol法提取青花菜叶片的总RNA，Trizol试剂由Invitrogen公司提供，其提取方法参考其说明书。采用逆转录试剂盒SuperscriptTMⅢ First-Strand cDNA Synthesis System for RT-PCR合成3′端cDNA，其中需用引物AP代替试剂盒引物。采用Clontech公司的SMARTTM RACE cDNA Amplication Kit 的试剂盒合成5′端cDNA。
1.2.2 β-1，4-木糖基转移酶IRX9H基因的克隆
实验室利用cDNA-AFLP技术分析青花菜在模拟酸雨胁迫下表达谱的变化，获得了与拟南芥β-1， 4-木糖基转移酶IRX9H（NM_102525.2）基因同源性较高的TDF差异片段，大小为236 bp。
3′RACE：以合成的3′端cDNA为模板，上游引物为B3-175和B3-111，下游引物为通用引物AUAP（表1），反应体系为：cDNA 1 μL、上游引物（10 μmol/μL）1μL、下游引物（10 μmol/μL）1 μL、2×MasterMix 12.5 μL、ddH2O 9.5 μL，共25 μL的体系。PCR扩增程序为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，引物退火温度30 s，72 ℃ 30 s，共30个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。3′RACE采2轮反应，第一轮反应体系以B3-175和AUAP为引物，退火温度为55.8 ℃，PCR扩增结束后，产物稀释100倍作为第二轮扩增模板，引物为B3-111和AUAP，退火温度为53.2 ℃。对目的片段的回收、连接、转化、验证与测序参照陈琼娥[20]的方法。
5′RACE：以合成的5′端cDNA为模板，下游引物为B5-48和B5-195，上游引物为通用引物UPM和NUP（表1）。5′RACE采用两轮反应，第一轮反应体系以B5-48和UPM为引物，退火温度为58.9 ℃，延伸时间为1 min 20 s，PCR扩增结束后，产物稀释100倍作为第二轮扩增模板，引物为B5-195和NUP，退火温度为52.4 ℃，延伸时间为1 min 20 s，其他的反应体系和程序同3′RACE。对目的片段的回收、连接、转化、验证与测序参照陈琼娥[20]的方法。
利用DNAMAN 6.0软件把克隆得到3′端片段、5′端片段和原来的差异片段序列进行拼接。
1.2.3 开放阅读框验证 通过NCBI网站的“ORF Finder”工具查找拼接后基因全长的起始密码子和终止密码子，做上标记，在其附近设计开放阅读框的上下游引物B-F和B-R（表1）。退火温度为57.4 ℃，延伸时间为1 min 20 s，其他的反应体系和程序同3′RACE，扩增后对目的片段进行回收与测序。
1.2.4 β-1，4-木糖基转移酶IRX9H基因的生物信息学分析 应用NCBI的“blastn”、“blastp”等工具对该基因进行同源性分析，利用DNAMAN6.0软件进行序列比对，采用Smart服务器分析保守域和功能位点，利用Protparam在线分析工具对该基因编码蛋白的理化性质推测分析，利用SignaIP 4.1工具对该基因的信号肽进行预测分析，利用软件MEGA5.2绘制系统进化树。
1.2.5 模拟酸雨胁迫下的β-1，4-木糖基转移酶IRX9H基因的表达分析 根据中国福建地区主要以SO42-为主的特点，用分析纯H2SO4和NH4NO3配制成SO42-和NO3-的当量比为4.19的模拟酸雨母液，母液pH值为1.0，取适量母液用蒸馏水稀释，配置pH2.0的模拟酸雨，用pHS-2C酸度计调节pH值。待青花菜幼苗长至4～5叶期，选取生长良好的青花菜，用配置好的pH2.0的模拟酸雨喷洒，叶片滴液时停止喷洒，每天处理1次，共处理9 d，每个处理重复3次。分别取0、3、6、9 d的叶片提取总RNA，用逆转录试剂盒SuperscriptTMⅢ First-Strand cDNA Synthesis System for RT-PCR进行逆转录，用AP代替试剂盒引物。荧光定量PCR仪为BioRad icycler iQ，上游引物为B-FN，下游引物为B-RN（表1）。反应体系和程序按照TaKaRa公司的SYBRR Premix Ex TaqTM（Tli RnaseH PIus）试剂盒的说明书，PCR扩增程序为：预变性94 ℃ 20 s；94 ℃变性10 s，58 ℃退火20 s，40个循环。试验以18S为内参基因，重复3次，采用2-ΔΔCt法计算不同时间IRX9H基因的相对表达量。
2 结果与分析
2.1 β-1，4-木糖基转移酶IRX9H基因的克隆
通过3RACE扩增，得到了358 bp左右的片段（图1-A）。测序结果经过blastn比对，与拟南芥β-1，4-木糖基转移IRX9H的mRNA相似度为83%，说明3′RACE 获得的片段与通过cDNA-AFLP技术获得的差异片段属于同一基因。 通过5′RACE扩增，得到了1 186 bp左右的片段（图1-B）。测序结果经过blastn比对，与拟南芥β-1，4-木糖基转移IRX9H的mRNA相似度为85%，说明5′RACE 获得的片段与通过cDNA-AFLP技术获得的部分差异片段属于同一基因。
将TDF片段、3′RACE和5′RACE获得的序列利用DNAMAN 6.0软件进行拼接，得到一条1 550 bp的全长cDNA序列，包含1个1 155 bp的ORF阅读框，编码的蛋白质含有384个氨基酸（图2）。由于该基因与拟南芥的β-1，4-木糖基转移酶IRX9H（NM_102525.2）基因同源性为91%，因此，该基因命名为青花菜β-1，4-木糖基转移酶IRX9H基因，GenBank登录号为：KF715851。
2.2 开放阅读框结果分析
用1%的琼脂糖凝胶电泳检测开放阅读框PCR产物，可得到1条1 100 bp左右的片段（图1-C），对该条带进行回收与测序，所得的序列和编码的氨基酸见图2中1～1 155部分序列。
2.3 β-1，4-木糖基转移酶IRX9H基因的生物信息学分析
利用DNAMAN 6.0软件将β-1，4-木糖基转移酶IRX9H基因编码的氨基酸序列与其他植物进行同源性比较，发现该基因与拟南芥-UDP（Arabidopsis thaliana-UDP）、琴叶拟南芥（Arabidopsis lyrata）、芥菜（Capsella rubella）和拟南芥-IRX9H（thaliala-IRX9H）的相似性分别为88%、82%、82%和82%（图3）。
琴叶拟南芥： Arabidopsis lyrata（GenBank： XP_002893477.1）； 芥菜： Capsella rubella（GenBank： EOA37898.1）； 拟南芥-IRX9H： Arabidopsis thaliala-IRX9H（GenBank： NP_973922.1）； 拟南芥-UDP： Arabidopsis thaliala-UDP（GenBank： AAM64331.1）。
由NCBI中“blastp”工具在线分析结果可知，该蛋白序列含有Beta1， 3-glucuronyltransferase I（GlcAT-I）的部分区域，位于氨基酸序列的140～350处具有“DXD”模体，这一区域参与蛋白多糖合成的初始步骤。
在Smart服务器分析保守域和功能位点，发现该氨基酸序列在23～50处有1个长度为28个氨基酸的低复杂度区域，E-value值为116 000；在14～74处发现1个Cation_ATPase_N区域，E-value值为116 000，该保守N-末端区域发现植物机体借助于P型ATP酶进行阳离子转运，包括运输H+、Na+、Ca2+、Na+/K+、H+/K+等；在98～213处存在SEA保守域，E-value值为2 170，推测其具有调节或绑定碳水化合物侧链的功能；在162～251处存在Bro-N 域，E-value值为99 400，这属于一个家族，包括杆状病毒BRO和ALI模体蛋白的N-末端，BRO蛋白的功能目前是未知的；在187～254处存在1个BLUF 域，E-value值为101 000， BLUF域已被证明与FAD结合在阿帕蛋白，阿帕蛋白参与光合作用系统的蓝光响应机制；在187～366处存在TIR域，E-value值为1 490，该域在昆虫和哺乳动物的抗真菌免疫反应中发挥了关键作用，同时含有该域的植物蛋白参与了宿主防御机制。
利用Protparam在线分析工具对该基因编码蛋白的理化性质推测分析，该蛋白包含384个氨基酸，分子量为43 897.8，等电点为9.08，判断为碱性蛋白，分子式为C1964H3044N558O567S11，原子总数为6 144。不稳定系数为63.46，说明该蛋白不稳定。脂肪指数为75.86，亲水性评估值为-0.484，为亲水性蛋白。该蛋白由22种氨基酸组成，其中丝氨酸含量最高，为8.6%。带负电氨基酸总和为44，带正电氨基酸总和为50。
利用SignaIP 4.1工具对该基因的信号肽进行预测分析，没有发现信号肽。
利用MEGA 5.2软件对基因编码蛋白作进化分析。将该基因序列编码的氨基酸序列在NCBI上的blastp搜索，结果发现青花菜的β-1，4-木糖基转移酶IRX9H蛋白与黄瓜（Cucumis sativus）、 草莓（Fragaria vesca）、 葡萄（Vitis vinifera）、 大豆（Glycine max）、 鹰嘴豆（Cicer arietinum）、 番茄（Solanum lycopersicum）和拟南芥（Arabidopsis thaliana）等植物具有同源性。利用MEGA 5.2软件通过Neighbor-Joining（NJ）法构建氨基酸序列的进化树（图4），经过1 000次Boot-strap计算，青花菜与拟南芥的的β-1，4-木糖基转移酶IRX9H基因聚类关系最近。从进化树上看，相同科的植物聚为一类，如大豆、鹰嘴豆2个豆科植物聚为一类，青花菜与拟南芥十字花科植物聚为一类，进化聚类值为100。说明植物β-1，4-木糖基转移酶IRX9H蛋白在同一科属之间具有很高的同源性，推测其在进化上相当保守。
2.4 模拟酸雨胁迫下的β-1，4-木糖基转移酶IRX9H基因的表达分析
利用实时荧光定量PCR技术对青花菜在模拟酸雨胁迫不同时期β-1，4-木糖基转移酶IRX9H基因的表达量进行检测分析。结果表明，在未胁迫时，该基因在青花菜中的表达量较低；胁迫3 d后，该基因表达量大幅度上升，比未胁迫时的对照增加了13倍；而后在胁迫6 d后，该基因表现出下调趋势，但其表达量仍高于对照，为对照的5.64倍；在胁迫9 d后，该基因的表达量低于对照，为对照的65%（图5）。在模拟酸雨胁迫后，该基因表达量迅速上升，之后下降，推测该基因在青花菜的抗酸雨胁迫中发挥了调控作用。 3 讨论与结论
植物在受到逆境胁迫时，可通过自身诱导产生调节物质，起到一定的防御作用。植物糖基转移酶是一类与糖脂、多糖、糖蛋白、核酸、植物次生产物等生物分子的代谢密切相关的酶[21-22]，广泛存在于植物细胞中，主要通过产生糖苷键将供体糖分子或相关基团转移到特异的受体上[23]。糖基转移酶作用有调节激素含量平衡、增加植物对逆性环境的抵抗能力、参与植物次级代谢调节、参与植物脱毒反应、参与植物信号转导[24-25]。对拟南芥基因组序列进行搜索，可找到99个相关的可能的糖基转移酶基因[26]，并已鉴定出这些酶所修饰的次级代谢产物有脱落酸、吲哚乙酸、细胞分裂素等[27]。据此推测，植物受到逆境胁迫时，β-1，4-木糖基转移酶IRX9H基因会影响植物次级代谢物质的生成、信号的传导、调节激素含量等，进而提高自身的逆境生存能力。
基因的功能域对于揭示基因在植物体内的作用具有重要意义。克隆获得β-1，4-木糖基转移酶IRX9H基因含有多个功能域：GlcAT-I部分区域，具有“DXD”模体，参与蛋白多糖合成的初始步骤，“DXD”模体是GT-A超家族的一个重要特征，对酶的催化活性起着不可或缺的作用，主要是通过二价金属阳离子（Mn+）配位作用使“DXD”模体与NDP一糖供体的磷酸基相连[28]；Cation_ATPase_N区域，ATP酶催化ATP水解释放能量，推动质子进行跨膜运输；SEA域是一个与O-糖基化相关的保守域，存在于集聚蛋白、肠激酶、紫色球海胆精蛋白、基底膜蛋白多糖等多种结构体内，这些蛋白功能多样，但共同点是都存在于糖基化的环境内，这个保守域可能调节或协助相邻的碳水化合物结合；BRO-N域功能目前是未知的；TIR域，定点突变和缺失分析结果表明，TIR结构域是Toll和IL-1R活动所必需的部分，已有研究揭示了与该域相关的三个高度保守的区域的功能，盒1（FDAFISY）、盒2（GYKLC-RD-PG）、盒3（一个被氨基酸残基包围的保守W域），其中盒1和盒2参与了结合蛋白的信号传导，而盒3主要涉及附近受体结合作用，这可能是通过与细胞骨架的相互作用而实现的，此外，该域还参与了植物的防御机制。从上述该基因序列各域的功能分析结果可知，该基因在植物体内参与了多糖合成、能量代谢、碳水化合物的结合、光合作用系统的蓝光响应机制、信号传导、宿主防御机制，对植物的生长发育具有重要作用，但具体的作用机制尚不明确，需进一步研究。
青花菜受模拟酸雨胁迫时，叶片最先表现出来。黄辉等[29]深入报道了酸雨对植物生理生态的影响机制：酸雨对植物的影响是先通过叶片的角质层和气孔破坏叶片的内部结构，酸雨中的H+置换叶片中的Mg2+，使得叶绿素的合成受阻，而叶绿素对光能的吸收、传递及光化学反应具有重要影响，因次，抑制了叶片的光合作用；叶片的气孔与植物的蒸腾作用和呼吸作用密切相关，酸雨破坏气孔，造成气孔关闭，进而降低蒸腾速率和呼吸速率，抑制植物正常生长；当酸雨落到叶片上，会加速其中的的K、Ca、Mn、Zn和Mg等金属元素淋溶，促进N、A1及Cu的富集，这种影响导致植物体内元素失衡，影响正常的物质代谢和生理生化过程，降低植株的活力和抗性，最终使叶片褪绿变淡，最后变黄、枯死。本研究利用实时荧光定量PCR技术，对青花菜β-1， 4-木糖基转移酶IRX9H基因在模拟酸雨胁迫不同时间的表达量进行分析，结果表明，随着酸雨处理时间的延长，青花菜β-1，4-木糖基转移酶IRX9H基因的表达量呈现先上升后下降的趋势，在胁迫处理3 d后表达量最高，9 d后最低，并低于对照。这说明当酸雨胁迫时，青花菜β-1，4-木糖基转移酶IRX9H基因被诱导，表达水平迅速增高。一段时间后，表达量又开始下降，其原因可能为：一是，随着模拟酸雨危害程度的加深，诱导该基因的环境恶化，pH值降低，细胞结构被破坏，使得表达量降低；二是，该基因表达后诱导下游的抗性相关基因表达，使得青花菜对模拟酸雨胁迫产生适应，不再诱导β-1，4-木糖基转移酶IRX9H基因的表达[30]；三是，该基因诱导的下游表达基因大量表达后，对自身产生抑制作用，两者存在拮抗关系，导致β-1，4-木糖基转移酶IRX9H基因表达量下降。
本研究从青花菜中克隆到了β-1，4-木糖基转移酶IRX9H基因的cDNA全长，长度为1 550 bp，开放阅读框为1 155 bp，编码384个氨基酸，经同源性比对分析，该基因与拟南芥的β-1，4-木糖基转移酶IRX9H（NM_102525.2）基因同源性为91%，二者都含有“DXD”模体。生物信息学分析结果表明，该序列编码的氨基酸序列中含有GlcAT-I、Cation_ATPase_N区域、SEA保守域、Bro-N域、BLUF域、TIR域多个功能区域，分子式为C1964H3044N558O567S11，分子量为43 897.8，有1个跨膜螺旋区域，没有信号肽。氨基酸序列进化树分析结果显示，青花菜与拟南芥关系最为接近，处于同一分支上。利用实时荧光定量PCR技术对其在模拟酸雨胁迫下的表达进行分析，推测其可能受逆境胁迫诱导，在植物的抗逆性反应中起着非常重要的作用，此结果为下一步研究其在抗酸雨胁迫中的功能奠定了基础。
参考文献
[1] 王 蓉， 何 磊. 西兰花中的抗癌成分及其活性的初步研究[J]. 食品科学， 2009， 30（7）： 243-245.
[2] 孙 勃， 许映君， 徐铁锋，等. 青花菜不同器官生物活性物质和营养成分的研究[J]. 园艺学报， 2010， 37（1）： 59-64.
[3] 蒋 明， 苗立祥， 钱宝英， 等. 青花菜BoCHS2基因的克隆， 表达和反义载体的构建[J]. 核农学报， 2011， 25（3）： 443-447.
[4] Plumb G W， Price K R， Modes M J， et al. Antioxidant properties of the major polyphenolic compounds in broccoli[J]. Free Radical Research， 1997， 27（4）： 429-435. [5] Leja M， Mareczek A， Starzyńska A， et al. Antioxidant ability of broccoli flower buds during short-term storage[J]. Food Chemistry， 2001， 72（2）： 219-222.
[6] 杨开宁. 模拟酸雨对叶菜类蔬菜影响评价模型研究[D]. 长春：吉林大学， 2011.
[7] 廖咏梅， 王 琼. 模拟酸雨对辣椒3种生长指标的影响[J]. 西华师范大学学报（自然科学版）， 2005， 26（2）： 200-203.
[8] 王双明. 模拟酸雨胁迫对菠菜中草酸积累及营养品质的影响[J]. 核农学报， 2012， 26（4）： 717-721.
[9] 曹春信， 周 琴， 韩亮亮，等. 模拟酸雨对油菜花期生理特性和产量的影响[J]. 应用生态学报， 2010， 21（8）： 2 057-2 062.
[10] 王寿超. 模拟不同类型酸雨对小白菜生长，生理及营养品质的影响研究[D]. 长春： 吉林大学， 2012.
[11] 许泽宏， 罗华锋， 王仕潭，等. 模拟酸雨对空心菜营养元素吸收的影响[J]. 宜宾学院学报， 2007， 6（1）： 69-72.
[12] 于寒松， 张继星， 马兰青， 等. 利用CODEHOP方法克隆高山红景天葡萄糖基转移酶基因cDNA片段[J]. 吉林农业大学学报，2008， 30（2）： 150-153.
[13] Bowles D， Isayenkova J， Lim E-K， et al. Glycosyltransferases：managers of small molecules[J]. Current Opinion in Plant Biology， 2005， 8（3）： 254-263.
[14] Jones P， Vogt T. Glycosyltransferases in secondary plant metabolism：tranquilizers and stimulant controllers[J]. Planta，2001， 213（2）： 164-174.
[15] Vogt T， Jones P. Glycosyltransferases in plant natural product synthesis：characterization of a supergene family[J]. Trends in Plant Science， 2000， 5（9）： 380-386.
[16] Lorenc-Kukula K， Kostyń K， Lukaszewicz M， et al. Glucosyltransferase， the gene arrangement and enzyme function[J]. Cel Mol Biol， 2004， 9（5）： 935-946.
[17] 于 洋， 曹飞飞， 陈小龙. 糖基转移酶的性质，作用机制及其在抗生素中的应用[J]. 中国抗生素杂志， 2013， 38（2）： 90-97.
[18] 蒋 明，张志仙，袁菱婧. 青花菜抗坏血酸过氧化物酶基因BOAPX2的克隆与表达分析[J]. 植物病理学报， 2012， 42（4）：374-380.
[19] 彭礼琼， 蒋 明， 郭志平，等. 青花菜查尔酮合成酶基因BoCHS的克隆，表达及序列分析[J]. 湖北农业科学， 2010， 49（8）： 1 796-1 800.
[20] 陈琼娥. 草莓果实cDNA-AFLP技术体系构建及UFGT基因克隆[D]. 福州： 福建农林大学， 2012.
[21] Gachon C M， Langlois-Meurinne M， Saindrenan P. Plant secondary metabolism glycosyltransferases： the emerging functional analysis[J]. Trends in Plant Science， 2005， 10（11）：542-549.
[22] Charnock S J， Henrissat B， Davies G J. Three-dimensional structures of UDP-sugar glycosyltransferases illuminate the biosynthesis of plant polysaccharides[J]. Plant Physiology， 2001， 125（2）： 527-531.
[23] Coutinho P M， Deleury E， Davies G J， et al. An evolving hierarchical family classification for glycosyltransferases[J]. Journal of Molecular Biology， 2003， 328（2）： 307-317.
[24] 王艳文. 杨树糖基转移酶与木质素合成关系的转基因研究[D]. 济南： 山东大学， 2012.
[25] 宋学洲. 葫芦巴中一个新的糖基转移酶的研究[D]. 长春： 吉林农业大学， 2012.
[26] Li Y， Baldauf S， Lim E-K， et al. Phylogenetic analysis of the UDP-glycosyltransferase multigene family of Arabidopsis thaliana[J]. Journal of Biological Chemistry， 2001， 276（6）： 4 338-4 343.
[27] Hou B， Lim E K， Higgins G S， et al. N-glucosylation of cytokinins by glycosyltransferases of Arabidopsis thaliana[J]. Journal of Biological Chemistry， 2004， 279（46）： 47 822-47 832.
[28] 丁向明， 吴士良， 陈惠黎. 糖基转移酶的结构生物学[J]. 生命的化学， 2003， 23（5）： 369-371.
[29] 黄 辉， 黄朝法. 酸雨对植物生理生态特性的影响研究进展[J]. 林业勘察设计， 2008， 1（1）： 46-49.
[30] 杨 帆， 丁 菲， 杜天真. 盐胁迫下构树DREB转录因子基因表达的实时荧光定量PCR分析[J]. 林业科学， 2010， 4（1）：146-150.