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【摘要】 目的：探讨丙酮酸激酶M2（PKM2）在膀胱尿路上皮癌中的表达及其意义。方法：应用免疫组化SP法，分别检测50例膀胱尿路上皮细胞癌组织及15例正常膀胱组织中PKM2的表达，并结合临床资料进行分析。结果：PKM2在膀胱尿路上皮癌组织及正常膀胱组织中的阳性表达率分别为94.0%（47/50）和13.3%（1/15），比较差异有统计学意义（P<0.05）。随着膀胱尿路上皮癌病理分级及临床分期的增高，PKM2的表达增高，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：PKM2在膀胱尿路上皮癌组织表达明显高于非癌组织，表明其在膀胱尿路上皮癌的发生发展中起重要作用，与膀胱尿路上皮癌的分期、转移有关。
【关键词】 能量代谢； 膀胱尿路上皮癌； 丙酮酸激酶M2； 免疫组化
【Abstract】 Objective：To study the expression and significance of PKM2 in bladder urothelial carcinoma. Method：The expression of PKM2 was detected by immunohistochemistry in tissue sections from 50 cases of bladder urothelial carcinoma and 15 cases of normal bladder mucosa，and their correlation with clinical data features were analyzed.Result：The PKM2 expression rate in bladder urothelial carcinoma and normal bladder tissues were 94.0% and 13.3%，the difference was statistically significant （P<0.05）.With the increase of pathological grade and clinical stage in bladder urothelial carcinoma，the expression of PKM2 was increased，the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion：The expression of PKM2 was higher in the bladder urothelial carcinoma than those in the noncancerous bladder tissue，which indicates that it may play an important role during the development of bladder urothelial carcinoma.And relationship to bladder urothelial carcinoma pathological grade，clinical stage and metastasis.
【Key words】 Energy metabolism； Bladder urothelial carcinoma； Pyruvate kinase M2； Immunohistochemical stain
First-author’s address：The First Clinical Medical College of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.11.004
膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，其中以尿路上皮癌（TCC）最为常见。膀胱尿路上皮癌多见于中老年人，近年发病率有上升趋势，其主要治疗手段以手术为主，但术后复发率高[1]。有文献[2]报道，低中级别病患在经尿道膀胱肿瘤电切术后
1年复发率为20%～40%，高级别的尿路上皮癌术后1～2年复发率可高达90%左右。目前，膀胱癌的诊断、术后复发的监测主要依赖于膀胱镜及尿脱落细胞学检查，膀胱镜检查为诊断膀胱癌的金标准，但为侵入性操作有一定的创伤性，后者虽然特异性高且无创，但敏感性差，容易产生假阴性[3]。因此寻找敏感性及特异性均高的膀胱癌肿瘤标记物作为膀胱肿瘤早期诊断、监测及预后评估受到越来越多外界的关注。
丙酮酸激酶（PK）是细胞糖酵解反应的关键酶，也是肿瘤细胞糖代谢异常的关键酶，丙酮酸激酶M2（PKM2）是丙酮酸激酶（PK）的同工酶之一，其在肿瘤细胞能量代谢过程中发挥着主导作用[4]。目前研究证实，丙酮酸激酶M2（PKM2）水平的增高见于多种恶性肿瘤，已有研究证实，在胃癌、乳腺癌、宫颈癌、肺癌、食管癌、结肠癌等多种肿瘤患者的血浆、胸腔积液以及结肠癌患者的粪便中均检测到PKM2含量的上升，是一种具有较好应用前景的肿瘤标记物[5]。本研究探讨PKM2在膀胱尿路上皮癌中的表达及其与临床病理特征间的关系。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选取2012年1月-2014年12月本院50例膀胱尿路上皮癌患者的癌组织手术切除标本，排除术前曾行放化疗的患者，术后病理证实均为膀胱尿路上皮癌。其中男35例，女15例，年龄24～84岁，平均61岁。按1997年UICC修订的膀胱癌TNM病理分期标准归类，（1）分化类型：高分化19例，中分化14例，低分化17例；（2）临床TNM分期：Ta～T1期者（非肌层浸润性膀胱癌）33例，T2～T4期者（肌层浸润性膀胱癌）17例。另取15例正常膀胱组织黏膜作对照组。
1.2 试剂 兔抗人PKM2单克隆抗体及SP免疫组化试剂盒均购自博士德公司，一抗以1∶100稀释使用，步骤按说明书。DAB显色剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司。其他试剂取自山西医科大学第一临床医学院病理教研室。 1.3 免疫组织化学染色方法 标本经4%甲醛固定，常规石蜡包埋，先行HE染色确定，选取无出血、无坏死区域，4 μm厚度组织连续切片，常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，水化后在含1% H2O2的甲醇中浸泡10 min以阻断内源酶，枸橼酸盐微波高压抗原修复，自然冷却至室温，磷酸盐缓冲液（PBS）洗过后加入用0.01 mol/L PBS稀释至1∶100的一抗——抗M2-PK抗体，室温下孵化60 min，二抗及过氧化物酶标记的链霉素亲和素抗体于37 ℃温箱孵育30 min，PBS液洗涤3次，DAB底物显色，苏木素复染核，梯度酒精脱水，树脂胶封片，显微镜下观察。用PBS液代替一抗作阴性对照。
1.4 结果判定 免疫组化染色PKM2主要表达于细胞胞浆，阳性着色为棕黄色颗粒状，染色愈浓代表阳性表达愈强。由2名病理科医师采用双盲法阅片的方式来评估免疫组化的结果。结果评定：根据阳性染色区域所占总区域的百分比分别计分：
0分（0），1分（1%～25%），2分（26%～50%），
3分（51%～75%）和4分（76%～100%）。根据染色的程度不同分别计分：0分（阴性，无染色），1分（弱阳性，浅黄色），2分（中等阳性，棕黄色）和3分（强阳性，棕褐色）。两者分值相加为最终分值（0～7分不等）：≤1分为阴性（-），2～3分为弱阳性（+），4～5分为中等阳性（++），6～7分为强阳性（+++）。进行统计分析时将（-）和（+）计为阴性，将（++）和（+++）计为阳性。
1.5 统计学处理 所有资料均采用SPSS 19.0统计学软件进行分析，计数资料的比较采用 字2检验或四格表矫正 字2检验，以及Fisher’s精确概率法检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 PKM2在膀胱尿路上皮癌组织及正常膀胱黏膜组织中的表达 免疫组化染色PKM2主要表达于细胞胞浆（图1），棕黄色颗粒状为阳性着色。PKM2在膀胱尿路上皮癌组织及正常膀胱组织中的阳性表达率分别为94.0%（47/50）和13.3%（1/15）。膀胱尿路上皮癌组织中PKM2阳性表达率明显高于正常组织，差异有统计学意义（P<0.05）。
2.2 PKM2的表达与患者临床病理因素的关系 50例膀胱尿路上皮癌患者中，男性组中PKM2阳性表达率为57.7%（20/35），女性组中PKM2阳性表达率为88.0%（8/15），两组比较差异无统计学意义（ 字2=0.13，P>0.05）；65岁以下组中的PKM2阳性表达率为62.0%（16/26），65岁以上组中PKM2阳性表达率为50.0%（12/24），两组比较差异无统计学意义（ 字2=0.67，P>0.05）；组织学分级为Grade I中PKM2阳性表达率为35.2%（6/17），Grade Ⅱ～Ⅲ中阳性表达率为66.7%（22/33），两组比较差异有统计学意义（ 字2=4.48，P<0.05）；临床分期为Ta～T1期组中PKM2阳性表达率为42.4%（14/33），临床分T2～T4期期组中PKM2阳性表达率为82.4%（14/17），两组比较差异有统计学意义（ 字2=7.26，P<0.05）。
3 讨论
有关肿瘤代谢的研究始于1920年，德国生物化学家Warburg首次发现肿瘤细胞中存在的特殊代谢方式——肿瘤细胞转换大量的葡萄糖变为乳酸，即使在氧存在的情况下。而正常分化组织细胞只有在缺氧的情况下才会进行糖酵解反应，即消耗葡萄糖，产生乳酸，这一理论被称为Warburg效应或有氧糖酵解[6-7]。丙酮酸激酶（PK）是糖酵解中的关键酶，也是肿瘤细胞糖代谢异常的关键酶，丙酮酸激酶催化其底物磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）去磷酸化生成丙酮酸及ATP。PK主要有4种同工酶，由于组织的不同代谢功能，不同的丙酮酸激酶同工酶在它们的动力学特征及调控机制上有很大的不同。PKM-L主要在糖异生表达活跃的组织中表达，如肝、肾和肠，PKM-L的表达受营养调控，在富含碳水化合物的饮食当中增强；PKM-R被发现在红细胞中表达，它和PKM-L的动力学特征和调控机制上非常相似；PKM1表达于需要提供大量能量及耗氧量大的组织中，如肌肉和脑；PKM2被表达于某些分化组织当中，如脂肪组织、肺、视网膜、胰岛等，并且是所有具有高比率核酸合成的细胞的特征同工酶，即所有增殖的细胞，如胚胎细胞、成体干细胞，尤其是肿瘤细胞[8-9]。在胚胎发育过程中，PKM2同工酶逐渐被相应的组织特异性同工酶所替代，相反，在肿瘤发生发展过程中，PKM2的表达逐渐上升，并取代组织中原有的同工酶类型，如L-PK在肝脏或M1-PK在大脑的消失和M2-PK同工酶开始表达[10]。PEP的亲和力和M2-PK同工酶的酶活性依赖于酶的四级结构并通过代谢中间体和原癌基因进行调节[6-7]。
PKM2有四聚体及二聚体两种不同的构象，并且在癌细胞当中PKM2四聚体与二聚体可以相互转换。PKM2两种构象的动力学特征表明，四聚体形式的特征在于它对它的底物PEP有很高的亲和力，而二聚体形式对PEP的亲和力则很低，在生理状态下的PEP浓度只有四聚体形式是高活性的，而二聚体几乎不活动[11]。PKM2四聚体对PEP的高亲和力以及它和其他糖酵解酶类紧密的空间邻近关系，使得它能高度有效的将葡萄糖转化为乳酸。但在肿瘤细胞中PKM2被发现主要以几乎无活性的二聚体形式存在[12]。因此，有推测表明当PKM2在肿瘤细胞当中以二聚体形式存在时，高PKM2表达导致葡萄糖代谢主要用于生物大分子的合成，而不是用于氧化代谢能源的产生，这促进了癌细胞的增殖和肿瘤的生长[13]。近年来研究表明，PKM2翻译后修饰（包括脯氨酸羟基化、赖氨酸乙酰化、酪氨酸磷酸化、半胱氨酸氧化和泛素化）在癌症的代谢及细胞的发展当中起到至关重要的作用[14-18]。
PKM2二聚体又被称为肿瘤PKM2，研究发现PKM2在多种恶性肿瘤当中表达异常，部分研究表明PKM2的上升水平与肿瘤的发生、发展、分化、转移、分期及预后密切相关[5]。本研究结果显示，PKM2在TCC组织中的表达率正常膀胱组织明显增高，并随着分化程度的降低而表达增高。PKM2在临床分期T2～T4（肌层浸润性膀胱癌）组中的阳性表达率高于Ta～T1（非肌层浸润性膀胱癌）组，有研究表明，PKM2可促进肿瘤细胞的生长，而敲低PKM2可抑制肿瘤细胞的成瘤能力和生长速率[19]。 综上，笔者推测PKM2的表达可能对膀胱尿路上皮癌的发生、发展和转移有促进作用。PKM2可能作为膀胱癌恶性程度的肿瘤标记物。因本次实验未涉及到其他肿瘤标记物，尚不能说明在膀胱癌中PKM2有最佳的敏感性，有待进一步研究观察，在膀胱尿路上皮癌中PKM2是否有必要与其他肿瘤标记物联合检测，以提高其敏感性及特异性。
参考文献
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[2] Sylvester R J，van der Meijden A P，Ooster linck W，et al.Predicting recurrence and progress ion in individual patients with stage Ta-T1 bladder cancer using EORTC risk tables：A combined analysis of 2596 patients from seven EORTC trials[J].Eur Urol，2006，49（3）：466-477.
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（收稿日期：2015-10-29） （本文编辑：蔡元元）
【关键词】 能量代谢； 膀胱尿路上皮癌； 丙酮酸激酶M2； 免疫组化
【Abstract】 Objective：To study the expression and significance of PKM2 in bladder urothelial carcinoma. Method：The expression of PKM2 was detected by immunohistochemistry in tissue sections from 50 cases of bladder urothelial carcinoma and 15 cases of normal bladder mucosa，and their correlation with clinical data features were analyzed.Result：The PKM2 expression rate in bladder urothelial carcinoma and normal bladder tissues were 94.0% and 13.3%，the difference was statistically significant （P<0.05）.With the increase of pathological grade and clinical stage in bladder urothelial carcinoma，the expression of PKM2 was increased，the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion：The expression of PKM2 was higher in the bladder urothelial carcinoma than those in the noncancerous bladder tissue，which indicates that it may play an important role during the development of bladder urothelial carcinoma.And relationship to bladder urothelial carcinoma pathological grade，clinical stage and metastasis.
【Key words】 Energy metabolism； Bladder urothelial carcinoma； Pyruvate kinase M2； Immunohistochemical stain
First-author’s address：The First Clinical Medical College of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.11.004
膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，其中以尿路上皮癌（TCC）最为常见。膀胱尿路上皮癌多见于中老年人，近年发病率有上升趋势，其主要治疗手段以手术为主，但术后复发率高[1]。有文献[2]报道，低中级别病患在经尿道膀胱肿瘤电切术后
1年复发率为20%～40%，高级别的尿路上皮癌术后1～2年复发率可高达90%左右。目前，膀胱癌的诊断、术后复发的监测主要依赖于膀胱镜及尿脱落细胞学检查，膀胱镜检查为诊断膀胱癌的金标准，但为侵入性操作有一定的创伤性，后者虽然特异性高且无创，但敏感性差，容易产生假阴性[3]。因此寻找敏感性及特异性均高的膀胱癌肿瘤标记物作为膀胱肿瘤早期诊断、监测及预后评估受到越来越多外界的关注。
丙酮酸激酶（PK）是细胞糖酵解反应的关键酶，也是肿瘤细胞糖代谢异常的关键酶，丙酮酸激酶M2（PKM2）是丙酮酸激酶（PK）的同工酶之一，其在肿瘤细胞能量代谢过程中发挥着主导作用[4]。目前研究证实，丙酮酸激酶M2（PKM2）水平的增高见于多种恶性肿瘤，已有研究证实，在胃癌、乳腺癌、宫颈癌、肺癌、食管癌、结肠癌等多种肿瘤患者的血浆、胸腔积液以及结肠癌患者的粪便中均检测到PKM2含量的上升，是一种具有较好应用前景的肿瘤标记物[5]。本研究探讨PKM2在膀胱尿路上皮癌中的表达及其与临床病理特征间的关系。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选取2012年1月-2014年12月本院50例膀胱尿路上皮癌患者的癌组织手术切除标本，排除术前曾行放化疗的患者，术后病理证实均为膀胱尿路上皮癌。其中男35例，女15例，年龄24～84岁，平均61岁。按1997年UICC修订的膀胱癌TNM病理分期标准归类，（1）分化类型：高分化19例，中分化14例，低分化17例；（2）临床TNM分期：Ta～T1期者（非肌层浸润性膀胱癌）33例，T2～T4期者（肌层浸润性膀胱癌）17例。另取15例正常膀胱组织黏膜作对照组。
1.2 试剂 兔抗人PKM2单克隆抗体及SP免疫组化试剂盒均购自博士德公司，一抗以1∶100稀释使用，步骤按说明书。DAB显色剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司。其他试剂取自山西医科大学第一临床医学院病理教研室。 1.3 免疫组织化学染色方法 标本经4%甲醛固定，常规石蜡包埋，先行HE染色确定，选取无出血、无坏死区域，4 μm厚度组织连续切片，常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，水化后在含1% H2O2的甲醇中浸泡10 min以阻断内源酶，枸橼酸盐微波高压抗原修复，自然冷却至室温，磷酸盐缓冲液（PBS）洗过后加入用0.01 mol/L PBS稀释至1∶100的一抗——抗M2-PK抗体，室温下孵化60 min，二抗及过氧化物酶标记的链霉素亲和素抗体于37 ℃温箱孵育30 min，PBS液洗涤3次，DAB底物显色，苏木素复染核，梯度酒精脱水，树脂胶封片，显微镜下观察。用PBS液代替一抗作阴性对照。
1.4 结果判定 免疫组化染色PKM2主要表达于细胞胞浆，阳性着色为棕黄色颗粒状，染色愈浓代表阳性表达愈强。由2名病理科医师采用双盲法阅片的方式来评估免疫组化的结果。结果评定：根据阳性染色区域所占总区域的百分比分别计分：
0分（0），1分（1%～25%），2分（26%～50%），
3分（51%～75%）和4分（76%～100%）。根据染色的程度不同分别计分：0分（阴性，无染色），1分（弱阳性，浅黄色），2分（中等阳性，棕黄色）和3分（强阳性，棕褐色）。两者分值相加为最终分值（0～7分不等）：≤1分为阴性（-），2～3分为弱阳性（+），4～5分为中等阳性（++），6～7分为强阳性（+++）。进行统计分析时将（-）和（+）计为阴性，将（++）和（+++）计为阳性。
1.5 统计学处理 所有资料均采用SPSS 19.0统计学软件进行分析，计数资料的比较采用 字2检验或四格表矫正 字2检验，以及Fisher’s精确概率法检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 PKM2在膀胱尿路上皮癌组织及正常膀胱黏膜组织中的表达 免疫组化染色PKM2主要表达于细胞胞浆（图1），棕黄色颗粒状为阳性着色。PKM2在膀胱尿路上皮癌组织及正常膀胱组织中的阳性表达率分别为94.0%（47/50）和13.3%（1/15）。膀胱尿路上皮癌组织中PKM2阳性表达率明显高于正常组织，差异有统计学意义（P<0.05）。
2.2 PKM2的表达与患者临床病理因素的关系 50例膀胱尿路上皮癌患者中，男性组中PKM2阳性表达率为57.7%（20/35），女性组中PKM2阳性表达率为88.0%（8/15），两组比较差异无统计学意义（ 字2=0.13，P>0.05）；65岁以下组中的PKM2阳性表达率为62.0%（16/26），65岁以上组中PKM2阳性表达率为50.0%（12/24），两组比较差异无统计学意义（ 字2=0.67，P>0.05）；组织学分级为Grade I中PKM2阳性表达率为35.2%（6/17），Grade Ⅱ～Ⅲ中阳性表达率为66.7%（22/33），两组比较差异有统计学意义（ 字2=4.48，P<0.05）；临床分期为Ta～T1期组中PKM2阳性表达率为42.4%（14/33），临床分T2～T4期期组中PKM2阳性表达率为82.4%（14/17），两组比较差异有统计学意义（ 字2=7.26，P<0.05）。
3 讨论
有关肿瘤代谢的研究始于1920年，德国生物化学家Warburg首次发现肿瘤细胞中存在的特殊代谢方式——肿瘤细胞转换大量的葡萄糖变为乳酸，即使在氧存在的情况下。而正常分化组织细胞只有在缺氧的情况下才会进行糖酵解反应，即消耗葡萄糖，产生乳酸，这一理论被称为Warburg效应或有氧糖酵解[6-7]。丙酮酸激酶（PK）是糖酵解中的关键酶，也是肿瘤细胞糖代谢异常的关键酶，丙酮酸激酶催化其底物磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）去磷酸化生成丙酮酸及ATP。PK主要有4种同工酶，由于组织的不同代谢功能，不同的丙酮酸激酶同工酶在它们的动力学特征及调控机制上有很大的不同。PKM-L主要在糖异生表达活跃的组织中表达，如肝、肾和肠，PKM-L的表达受营养调控，在富含碳水化合物的饮食当中增强；PKM-R被发现在红细胞中表达，它和PKM-L的动力学特征和调控机制上非常相似；PKM1表达于需要提供大量能量及耗氧量大的组织中，如肌肉和脑；PKM2被表达于某些分化组织当中，如脂肪组织、肺、视网膜、胰岛等，并且是所有具有高比率核酸合成的细胞的特征同工酶，即所有增殖的细胞，如胚胎细胞、成体干细胞，尤其是肿瘤细胞[8-9]。在胚胎发育过程中，PKM2同工酶逐渐被相应的组织特异性同工酶所替代，相反，在肿瘤发生发展过程中，PKM2的表达逐渐上升，并取代组织中原有的同工酶类型，如L-PK在肝脏或M1-PK在大脑的消失和M2-PK同工酶开始表达[10]。PEP的亲和力和M2-PK同工酶的酶活性依赖于酶的四级结构并通过代谢中间体和原癌基因进行调节[6-7]。
PKM2有四聚体及二聚体两种不同的构象，并且在癌细胞当中PKM2四聚体与二聚体可以相互转换。PKM2两种构象的动力学特征表明，四聚体形式的特征在于它对它的底物PEP有很高的亲和力，而二聚体形式对PEP的亲和力则很低，在生理状态下的PEP浓度只有四聚体形式是高活性的，而二聚体几乎不活动[11]。PKM2四聚体对PEP的高亲和力以及它和其他糖酵解酶类紧密的空间邻近关系，使得它能高度有效的将葡萄糖转化为乳酸。但在肿瘤细胞中PKM2被发现主要以几乎无活性的二聚体形式存在[12]。因此，有推测表明当PKM2在肿瘤细胞当中以二聚体形式存在时，高PKM2表达导致葡萄糖代谢主要用于生物大分子的合成，而不是用于氧化代谢能源的产生，这促进了癌细胞的增殖和肿瘤的生长[13]。近年来研究表明，PKM2翻译后修饰（包括脯氨酸羟基化、赖氨酸乙酰化、酪氨酸磷酸化、半胱氨酸氧化和泛素化）在癌症的代谢及细胞的发展当中起到至关重要的作用[14-18]。
PKM2二聚体又被称为肿瘤PKM2，研究发现PKM2在多种恶性肿瘤当中表达异常，部分研究表明PKM2的上升水平与肿瘤的发生、发展、分化、转移、分期及预后密切相关[5]。本研究结果显示，PKM2在TCC组织中的表达率正常膀胱组织明显增高，并随着分化程度的降低而表达增高。PKM2在临床分期T2～T4（肌层浸润性膀胱癌）组中的阳性表达率高于Ta～T1（非肌层浸润性膀胱癌）组，有研究表明，PKM2可促进肿瘤细胞的生长，而敲低PKM2可抑制肿瘤细胞的成瘤能力和生长速率[19]。 综上，笔者推测PKM2的表达可能对膀胱尿路上皮癌的发生、发展和转移有促进作用。PKM2可能作为膀胱癌恶性程度的肿瘤标记物。因本次实验未涉及到其他肿瘤标记物，尚不能说明在膀胱癌中PKM2有最佳的敏感性，有待进一步研究观察，在膀胱尿路上皮癌中PKM2是否有必要与其他肿瘤标记物联合检测，以提高其敏感性及特异性。
参考文献
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（收稿日期：2015-10-29） （本文编辑：蔡元元）