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【摘 要】探讨检测新鲜海螺样品中单增李斯特菌的双重PCR快速检测方法。基于单增李斯特菌hlyA基因和李斯特菌属的16sRNA基因分别合成两对引物，对影响PCR的主要因素进行优化，最终确定同时检测单增李斯特菌两个特异性基因的双重PCR最佳反应体系及条件，该方法对于纯培养物的最低检出限为102CFU/mL，模拟污染海螺样品的检测限为8CFU/g。
【关键词】单增李斯特菌；双重PCR；海螺样品
【中图分类号】R197 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2019）01-0225-02
本工作将单增李斯特菌最重要的毒力因子-编码溶血素的hlyA基因，与李斯特菌属16sRNA基因同时作为单增李斯特菌的检测指标，将双重PCR方法与选择性增菌法相结合，旨在建立一种快速灵敏检测单增李斯特菌的双重PCR方法。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种
单增李斯特菌标准株由省疾病预防控制中心提供；大肠杆菌（Escherichia coil）、沙门氏菌（Salmonella）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、产气杆菌（Aerobacter aerogenes）和伤寒杆菌（Salmonella typhi）为本实验室保存菌株。
1.1.2 试剂
李斯特氏菌显色培养基、单增李斯特菌成套生化鉴定管、胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂（TSA-YE）、李氏增菌肉汤LB1、萘啶酮酸、吖啶黄素 青岛高科园海博生物有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒、DNA Marker、溶菌酶、蛋白酶K、RNaseA以及PCR相关试剂 北京天根生化有限公司。
1.1.3 引物序列
根据文献[1]以单增李斯特菌hlyA基因和李斯特菌属的16sRNA基因作为靶基因分别合成两对特异性引物，所用引物序列见表一，引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。
1.1.4 仪器
VersaDoc凝胶成像仪 美国伯乐；PCR扩增仪 美国伯乐；JM-250电泳仪 大连捷迈科贸有限公司；D-37520高速冷冻离心机 德国Thermo公司。
1.2 方法
1.2.1 细菌的活化培养
取-80℃、25%甘油冻存的菌种，复苏培养后，分别划线于细菌培养基上，37℃培养24h，连续活化两次，将单菌落接种于普通肉汤培养基中，37℃振荡培养18h。
1.2.2 细菌基因组DNA的制备
取1ml菌液按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书步骤进行DNA提取，并溶于100 μL TE缓冲液中，于-20℃下保存。
1.2.3 双重PCR的体系建立及优化
双重PCR扩增体系：10×Buffer（Mg2+）5?L 、dNTPs（2.5mmol/L）4?L、两对10mmol/L的上下游引物各1?L、 DNA模板5?L，Taq酶（2.5U/?L）0.8?L ，用ddH2O補足至50?L。
双重PCR反应条件：采用热启动。95℃预变性3min ，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸80s，共30个循环，72℃终延伸10min。
在上述反应体系和条件下，对退火温度进行优化，分别设定退火温度为：55℃、55.8℃、57.1℃、58.9℃、61.4℃、63.3℃，通过对电泳结果的分析，最终确定最佳退火温度。
1.2.4 双重PCR特异性及灵敏度检测
特异性检测：分别提取单增李斯特标准株、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、产气杆菌及伤寒杆菌模板DNA，在最佳双重PCR体系及条件下扩增，检测引物特异性。
灵敏度检测：将过夜培养的单增李斯特菌菌液用无菌的生理盐水10倍梯度稀释，使目标菌浓度依次为：106CFU/mL 、105CFU/mL 、104CFU/mL 、103CFU/mL 、102CFU/mL 、10CFU/mL。分别提取不同浓度菌液的模板DNA，在最佳双重PCR体系及条件下扩增，确定双重PCR的检测灵敏度。
1.2.5 人工污染海螺样品的制备及检出限检测
无菌操作取一只海螺的软组织及体液（阴性）共12.5g，加入李氏增菌肉汤LB1（含抑菌剂）中，充分摇匀制成均质液，用无菌生理盐水10倍梯度稀释初始浓度为106CFU/mL的单增李斯特菌菌液，取1mL不同稀释度的菌液分别加入待检试样的均质液中，30℃震荡培养24h，分别取1mL增菌液按照方法1.2.2提取模板DNA，进行双重PCR检测，确定人工污染海螺样品的最低检出限。
2 结果与分析
2.1 不同退火温度下双重PCR扩增结果
对双重PCR的退火温度进行优化（图一），结果可见两条带在一定温度范围内均能有效扩增， 702bp 条带在相同退火温度下的扩增效果均较938bp条带明显，其中在退火温度为55.8℃和58.9℃时，两特异条带同时扩增清晰，考虑到降低退火温度可以提高扩增效率，最终选定55.8℃为最佳退火温度，从而确定双重PCR最佳反应条件。
2.2 特异性及灵敏度检测结果
在双重PCR最佳反应体系及条件下，应用引物1及引物2对不同细菌的模板DNA进行双重PCR扩增。特异性检测结果（图二）显示：只有单增李斯特菌标准株可扩增出938bp和702bp二条带，而其他6株致病菌除引物二聚体外均未出现任何扩增条带，该双重PCR特异性良好。
将初始浓度分别为106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL、102CFU/mL、10CFU/mL的单增李斯特菌菌液的DNA作为双重PCR反应模板，确定双重PCR检测纯菌液的灵敏度，由图三可知：两特异条带同时检出的最低菌液浓度为102CFU/mL，其灵敏度能够满足样品选择性增菌后的检测要求。
2.3人工污染海螺样品的检出限
单增李斯特菌菌液初始浓度为106CFU/mL，取不同稀释浓度菌液1mL，污染12.5g海螺阴性样品，30℃ LB1震荡培养24h，分别提取增菌液DNA进行双重PCR检测，检测结果如图四所示，当浓度为102CFU/mL的菌液污染海螺样模板品仍可检出，经计算，此双重PCR检测模拟污染海螺样品检出限为8CFU/g。
3 结论
本工作所采用的检测水产品中单增李斯特菌的双重PCR快速方法，菌液灵敏度为102CFU/mL，模拟污染海螺样品检出限为8CFU/g，全程检测时间包括增菌时间在内仅27小时，与国标方法相比省时省力且经济，可快速检测出实际样品中的阳性样品与疑似阳性样品，可作为海螺样品中单增李斯特菌的初步鉴定方法。
参考文献
[1]王海艳，刘中学，等.食品中单增李斯特菌PCR检测方法所用引物的特异性比较[J].检验检疫科学，2007（6）：3-8.（J）
【关键词】单增李斯特菌；双重PCR；海螺样品
【中图分类号】R197 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2019）01-0225-02
本工作将单增李斯特菌最重要的毒力因子-编码溶血素的hlyA基因，与李斯特菌属16sRNA基因同时作为单增李斯特菌的检测指标，将双重PCR方法与选择性增菌法相结合，旨在建立一种快速灵敏检测单增李斯特菌的双重PCR方法。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种
单增李斯特菌标准株由省疾病预防控制中心提供；大肠杆菌（Escherichia coil）、沙门氏菌（Salmonella）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、产气杆菌（Aerobacter aerogenes）和伤寒杆菌（Salmonella typhi）为本实验室保存菌株。
1.1.2 试剂
李斯特氏菌显色培养基、单增李斯特菌成套生化鉴定管、胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂（TSA-YE）、李氏增菌肉汤LB1、萘啶酮酸、吖啶黄素 青岛高科园海博生物有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒、DNA Marker、溶菌酶、蛋白酶K、RNaseA以及PCR相关试剂 北京天根生化有限公司。
1.1.3 引物序列
根据文献[1]以单增李斯特菌hlyA基因和李斯特菌属的16sRNA基因作为靶基因分别合成两对特异性引物，所用引物序列见表一，引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。
1.1.4 仪器
VersaDoc凝胶成像仪 美国伯乐；PCR扩增仪 美国伯乐；JM-250电泳仪 大连捷迈科贸有限公司；D-37520高速冷冻离心机 德国Thermo公司。
1.2 方法
1.2.1 细菌的活化培养
取-80℃、25%甘油冻存的菌种，复苏培养后，分别划线于细菌培养基上，37℃培养24h，连续活化两次，将单菌落接种于普通肉汤培养基中，37℃振荡培养18h。
1.2.2 细菌基因组DNA的制备
取1ml菌液按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书步骤进行DNA提取，并溶于100 μL TE缓冲液中，于-20℃下保存。
1.2.3 双重PCR的体系建立及优化
双重PCR扩增体系：10×Buffer（Mg2+）5?L 、dNTPs（2.5mmol/L）4?L、两对10mmol/L的上下游引物各1?L、 DNA模板5?L，Taq酶（2.5U/?L）0.8?L ，用ddH2O補足至50?L。
双重PCR反应条件：采用热启动。95℃预变性3min ，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸80s，共30个循环，72℃终延伸10min。
在上述反应体系和条件下，对退火温度进行优化，分别设定退火温度为：55℃、55.8℃、57.1℃、58.9℃、61.4℃、63.3℃，通过对电泳结果的分析，最终确定最佳退火温度。
1.2.4 双重PCR特异性及灵敏度检测
特异性检测：分别提取单增李斯特标准株、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、产气杆菌及伤寒杆菌模板DNA，在最佳双重PCR体系及条件下扩增，检测引物特异性。
灵敏度检测：将过夜培养的单增李斯特菌菌液用无菌的生理盐水10倍梯度稀释，使目标菌浓度依次为：106CFU/mL 、105CFU/mL 、104CFU/mL 、103CFU/mL 、102CFU/mL 、10CFU/mL。分别提取不同浓度菌液的模板DNA，在最佳双重PCR体系及条件下扩增，确定双重PCR的检测灵敏度。
1.2.5 人工污染海螺样品的制备及检出限检测
无菌操作取一只海螺的软组织及体液（阴性）共12.5g，加入李氏增菌肉汤LB1（含抑菌剂）中，充分摇匀制成均质液，用无菌生理盐水10倍梯度稀释初始浓度为106CFU/mL的单增李斯特菌菌液，取1mL不同稀释度的菌液分别加入待检试样的均质液中，30℃震荡培养24h，分别取1mL增菌液按照方法1.2.2提取模板DNA，进行双重PCR检测，确定人工污染海螺样品的最低检出限。
2 结果与分析
2.1 不同退火温度下双重PCR扩增结果
对双重PCR的退火温度进行优化（图一），结果可见两条带在一定温度范围内均能有效扩增， 702bp 条带在相同退火温度下的扩增效果均较938bp条带明显，其中在退火温度为55.8℃和58.9℃时，两特异条带同时扩增清晰，考虑到降低退火温度可以提高扩增效率，最终选定55.8℃为最佳退火温度，从而确定双重PCR最佳反应条件。
2.2 特异性及灵敏度检测结果
在双重PCR最佳反应体系及条件下，应用引物1及引物2对不同细菌的模板DNA进行双重PCR扩增。特异性检测结果（图二）显示：只有单增李斯特菌标准株可扩增出938bp和702bp二条带，而其他6株致病菌除引物二聚体外均未出现任何扩增条带，该双重PCR特异性良好。
将初始浓度分别为106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL、102CFU/mL、10CFU/mL的单增李斯特菌菌液的DNA作为双重PCR反应模板，确定双重PCR检测纯菌液的灵敏度，由图三可知：两特异条带同时检出的最低菌液浓度为102CFU/mL，其灵敏度能够满足样品选择性增菌后的检测要求。
2.3人工污染海螺样品的检出限
单增李斯特菌菌液初始浓度为106CFU/mL，取不同稀释浓度菌液1mL，污染12.5g海螺阴性样品，30℃ LB1震荡培养24h，分别提取增菌液DNA进行双重PCR检测，检测结果如图四所示，当浓度为102CFU/mL的菌液污染海螺样模板品仍可检出，经计算，此双重PCR检测模拟污染海螺样品检出限为8CFU/g。
3 结论
本工作所采用的检测水产品中单增李斯特菌的双重PCR快速方法，菌液灵敏度为102CFU/mL，模拟污染海螺样品检出限为8CFU/g，全程检测时间包括增菌时间在内仅27小时，与国标方法相比省时省力且经济，可快速检测出实际样品中的阳性样品与疑似阳性样品，可作为海螺样品中单增李斯特菌的初步鉴定方法。
参考文献
[1]王海艳，刘中学，等.食品中单增李斯特菌PCR检测方法所用引物的特异性比较[J].检验检疫科学，2007（6）：3-8.（J）