论文部分内容阅读
背景和目的血管新生在整个生命过程中都发挥着关键的作用,但是随着年龄的增长,老年个体的血管新生功能呈现进程性减弱,修复缺血和受损组织的能力显著降低。内皮祖细胞(EPC)已被证实在成体的血管新生中起重要作用,来源于老年个体的EPC其增殖、存活及迁移功能明显减弱。最近的研究表明miRNA参与了血管新生的调控。miR-34a是肿瘤抑制因子,通过作用于靶蛋白沉默信息调控子1(SIRT1)导致细胞周期阻滞或者细胞凋亡。但是,目前尚不清楚miR-34a是否在EPC介导的血管新生中起作用。此外,最近已报道miR-34a在老年小鼠的心脏和脾脏中水平升高,提示衰老可上调miR-34a水平。EPC还受到eNOS的调控,在衰老的情况下eNOS的功能也被削弱。研究已证明,eNOS的必需辅因子BH4水平的下降可引起eNOS解偶联,导致EPC的数量及迁移能力降低。GTP水解酶I(GTPCH I)是生理情况下合成BH4的限速酶。GTPCH I活性的降低可减少BH4的产生,引起eNOS解偶联,从而导致活性氧(ROS)水平升高。但是EPC中的GTPCHI是否可以通过影响ROS的产生进而调控miR-34a的表达尚不清楚。本研究旨在探讨正常与衰老情况下miR-34a调控EPC介导的血管新生及miR-34a的上游调控因素。方法我们分别从成年雄性Spraque-Dawley大鼠(201～225 g)、年轻(8周龄)的C57BL/6小鼠(野生型)、GTPCH I转基因小鼠(Tg-GCH,内皮特异性过表达GTPCH I)、Hph-1小鼠(GTPCH I表达水平组成型降低)、老年(18～20月龄)的C57BL/6小鼠及eNOS/GCH双转基因小鼠(全部为雄性)的骨髓中分离EPC。用流式细胞术联合干细胞和内皮细胞表面标志对培养7天后的细胞进行表型鉴定。应用Real-time PCR和Western blot分别检测miR-34a和SIRT1的表达水平。miR-34a mimic或inhibitor被转染进入EPC以过表达miR-34a或抑制miR-34a的表达。SIRT1 siRNA也被用来降低EPC中SIRT1的水平。我们还应用Matrigel小管形成试验检测EPC的体外血管新生能力,用Matrigel plug试验分析EPC的体内血管新生能力,用衰老相关的β-半乳糖苷酶染色确定EPC的衰老状况,用流式细胞术测定ROS水平。小鼠后肢缺血模型结合随后的激光多普勒成像用来评估小鼠急性缺血后血流的恢复能力。结果 miR-34a调节大鼠EPC介导的血管新生。流式细胞术的结果显示,培养7天后的EPC表达干细胞标志CD34、CD133和内皮细胞标志VEGFR-2、VE-Cadherin。Real-time PCR证实EPC表达miR-34a。转染miR-34a mimic后,EPC中miR-34a水平增加约23倍,伴随着EPC的血管新生功能显著降低。过表达miR-34a还增加了约40%的衰老细胞,同时SIRT1的表达水平降低了约40%。在EPC中用SIRT1 siRNA抑制SIRT1的表达后,EPC的血管新生能力明显降低,而衰老细胞数增加。进一步的研究发现,过表达miR-34a或者敲低SIRT1都能增加SIRT1效应蛋白FoxO1的乙酰化水平,提示SIRT1-FoxO1信号通路可能介导了miR-34a对EPC血管新生的抑制作用。老龄小鼠EPC血管新生功能下降与miR-34a相关。老年小鼠在股动、静脉结扎后血流的恢复较年轻小鼠明显减慢。与减缓的血流恢复相一致,老年小鼠EPC的体外血管新生能力下降约56%。值得注意的是老年小鼠EPC中miR-34a水平增加约1倍,而SIRT1蛋白水平下降约46%。在老年小鼠EPC中转染miR-34a inhibitor抑制miR-34a的表达后,血管新生能力显著升高。相反在年轻小鼠EPC中转染miR-34a mimic过表达miR-34a后,其血管新生活性减弱。Matrigel plug试验结果显示,混有过表达miR-34a的EPC的plug中形成了无序的细胞簇,但是混有对照EPC的plug中则形成了血管样结构,并且在管腔中可见红细胞,表明过表达miR-34a会抑制EPC的体内血管新生功能。进一步研究发现,抑制miR-34a可增加老年小鼠EPC中SIRT1的表达,而过表达miR-34a则降低年轻小鼠EPC中SIRT1的含量。GTPCH I调控miR-34a和SIRT1的表达。老年小鼠EPC中ROS水平显著升高,而GTPCHI蛋白水平显著降低。与老年野生型小鼠的EPC相比,老年eNOS/GCH双转基因小鼠EPC中miR-34a水平降低,伴随着SIRT1水平的升高,但与年轻野生型小鼠EPC比较,老年eNOS/GCH双转基因小鼠EPC中miR-34a和SIRT1水平无显著差异,提示GTPCHI和/或eNOS可能参与了调控miR-34a及其靶蛋白SIRT1的表达。最后,我们在Tg-GCH小鼠和GTPCHI缺乏的Hph-1小鼠的EPC中检测了miR-34a和SIRT1的表达水平。结果显示,与野生型小鼠EPC相比,Tg-GCH小鼠EPC中miR-34a水平下降,伴随SIRT1水平的升高,而在Hph-1小鼠EPC中miR-34a水平升高,伴随SIRT1水平的降低。结论 miR-34a抑制EPC介导的血管新生;衰老与SIRT1-FoxO1信号通路介导了miR-34a对EPC血管新生功能的抑制作用;老龄小鼠EPC血管新生功能减弱与miR-34a水平升高及其靶蛋白SIRT1的表达下降相关;GTPCH I参与了miR-34a及其靶蛋白SIRT1表达的调控。本研究从miRNA调控EPC介导的血管新生角度阐明了miR-34a在老年动物血管新生能力减弱中的作用机制,为改善老龄个体血管新生能力提供了新的思路。