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摘要 [目的]优化超声-微波协同提取乌药叶中总黄酮的工艺。[方法]探讨乙醇体积分数、料液比、提取温度、提取时间对总黄酮提取率的影响。采用L9（34）正交设计，以黄酮提取率为指标，对工艺参数进行优化。[结果]乌药叶中总黄酮提取的最佳工艺条件为乙醇体积分数70%、料液比1∶40、提取温度45 ℃、提取时间7 min，总黄酮提取率达3.03%。[结论]该研究为乌药叶资源的进一步开发利用提供参考。
关键词 超声-微波协同提取；乌药叶；总黄酮；工艺；优化
中图分类号 S567；TQ460.6 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）17-072-02
Abstract [Objective] The process for ultrasonic.microwave assisted extraction of total flavonoids from Lindera aggregata leaves was developed. [Method] The concentration of ethanol， the ratio of solid to liquid， irradiation time and microwave temperature were selected as chief factors and orthogonal tests were studied to find the optimal extracting conditions. [Result] The optimum extraction conditions were as follows： 70% ethanol （V/V）， 1∶40 of solid to liquid， temperature at 45 ℃， extracting 7 min， the content of total flavonoids was 3.03%. [Conclusion] The study provides scientific reference for further development and utilization of Lindera aggregata leaves.
Key words Ultrasonic.microwave assisted extraction； Lindera aggregata leaves； Total flavonoids； Technique； Optimization
乌药叶为樟科山胡椒属药用植物乌药Lindera aggregata （Sims） Kosterm.的叶，具有温中燥脾、消食杀蛔、治腹中寒痛等作用[1]。毒性试验研究表明，乌药叶属实际无毒级，未见遗传毒性，长期服用安全[2]，被卫生部公告（2012年第19号）列为新资源食品。乌药叶中含有丰富的黄酮类物质[1，3]，具有抗氧化、降脂的药理作用[4-5]。
超声-微波协同法是近年发展起来的一种新方法，具有简单、快速、高效的特点，已被广泛用于天然产物有效成分的提取[6-7]。到目前为止，尚未见超声-微波协同提取乌药叶中总黄酮的文献报道。该研究优化了超声-微波协同提取乌药叶中总黄酮的工艺，为乌药叶资源的综合利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
乌药叶采自浙江省台州市天台县，经台州学院植物生理教研室陈珍博士鉴定为樟科山胡椒属植物乌药Lindera aggregata （Sims） Kosterm.的嫩叶；芦丁对照品（批号100080-200707，中国药品生物制品检定所）；其他试剂均为分析纯。
1.2 仪器 XO.SM100超声波微波组合反应系统（南京先欧生物科技有限公司）；UV.2450型紫外分光光度计（日本岛津公司）；RE.52AA型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；SH2.D（Ш）型循环水式真空泵（巩义予华仪器有限责任公司）。
1.3 试验方法
1.3.1 乌药叶中总黄酮的提取。
将乌药叶用清水洗净，自然风干，115 ℃杀青20 min，70 ℃下干燥7 h，粉碎过40目筛，经石油醚脱脂后，取适量置于三颈烧瓶中，采用超声-微波协同法提取，抽滤，弃去残渣。滤液减压浓缩并定容至50 ml，测定总黄酮含量。
1.3.2 单因素试验。
1.3.2.1 乙醇体积分数对乌药叶中总黄酮提取率的影响。按料液比1∶30分别加入50%、60%、70%、80%、90%乙醇-水溶液提取乌药叶中总黄酮，温度55 ℃下提取7 min，确定乙醇体积分数对提取效果的影响。
1.3.2.2 料液比对乌药叶中总黄酮提取率的影响。选用料液比为1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g/ml），乙醇体积分数采用“1.3.2.1”的最佳值，55 ℃下提取7 min，确定料液比对提取效果的影响。
1.3.2.3 提取温度对乌药叶中总黄酮提取率的影响。设定提取温度为35、40、45、50、55 ℃下提取乌药叶7 min，乙醇体积分数、料液比采用“1.3.2.1”、“1.3.2.2”的最佳值，确定提取温度对提取效果的影响。
1.3.2.4 提取时间对乌药叶中总黄酮提取率的影响。分别设定时间为5、6、7、8、9 min提取乌药叶中总黄酮，其余操作条件采用上述试验的最佳值，确定提取时间对提取效果的影响。
1.3.2.5 提取次数对乌药叶中总黄酮提取率的影响。对乌药叶分别提取1、2、3、4、5次，其余操作条件采用上述试验的最佳值，确定提取次数对提取效果的影响。
1.3.3 正交试验。在单因素试验的基础上，设计4因素3水平L9（34）正交表（表1）进行试验，优化提取工艺。 1.3.4 总黄酮提取率的测定。
取提取液1 ml，加入0.5 mol/L AlCl3溶液1.0 ml，摇匀，放置15 min，再用pH 6.0的HAc.NaAc缓冲溶液定容至10 ml，混匀，超声振荡5 min后，在415 nm处测定吸光度[8]。以芦丁为对照品，得吸光度A与质量浓度C（mg/ml）之间的回归方程为A=35.42 059C-0.019 42（r=0.999 64）。根据标准曲线回归方程，计算提取液的黄酮含量，从而得到总黄酮提取率，提取率=黄酮含量×提取液体积×稀释倍数乌药叶质量×100%。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响。选用不同比例的乙醇-水体系进行比较，结果表明（图1），乙醇体积分数为50%时，黄酮提取率较小，随着乙醇浓度的增加，黄酮的提取率增大，当乙醇体积分数达70%时，黄酮的提取率达最大，继续增加乙醇浓度，提取率则逐渐下降。故选用70%乙醇为提取溶剂。
2.1.2 料液比对总黄酮提取率的影响。从图1可看出，随着料液比的增加，黄酮类化合物的提取率先增加后减少，在1∶40时达最大值。过多的溶剂使得杂质含量变大，且回收溶剂时蒸馏时间过长，给后序的浓缩带来困难，能耗过高。因此，宜选1∶40为最佳料液比。
2.1.3 提取温度对总黄酮提取率的影响。由图1可见，随着温度的升高，黄酮提取率显著增加，在45 ℃时达最大，但当温度进一步增加时，黄酮类化合物的提取率却缓慢下降。这可能是因为温度过高会导致活性成分降解或异构化，使提取物有效成分含量降低。因此，45 ℃为最佳的提取温度。
2.1.4 提取时间对总黄酮提取率的影响。黄酮类化合物的提取率随着提取时间的增加逐渐增加，当在7 min时达最大值，之后随着提取时间的不断增加而逐渐下降（图1）。可见，随着提取时间的增长，微波和超声波产生大量的热对黄酮的结构有一定的破坏作用。因此，宜选7 min为最佳提取时间。
2.1.5 提取次数对总黄酮提取率的影响。从图1可看出，随着提取次数的增加，黄酮类化合物的提取率也不断升高。但提取2次之后，提取率增加比较缓慢，说明提取2次黄酮已基本溶出。考虑到提取周期、经济等因素，提取2次为最佳的提取次数。
2.2 正交试验
由表2可知，各因素对乌药叶中总黄酮提取率的影响程度主次顺序为乙醇体积分数>料液比>提取时间>提取温度。最佳提取方案为A2B2C2D2，即在料液比1∶40、70%乙醇、提取温度45 ℃条件下提取7 min。
2.3 验证试验
在优选的工艺条件下提取乌药叶中总黄酮，平行操作3份，测得总黄酮提取率为（3.03±0.05）%，RSD为1.55%，表明选择的最佳提取工艺可行。
2.4 超声-微波协同提取与常规提取方法的比较
将超声-微波协同提取的结果与文献[9-11]中加热回流法、微波法、超声波法提取的结果进行比较，结果发现（表3），该试验方法温度最低，总黄酮提取率最高，且溶剂安全价廉；在协同萃取的条件下，微波使植物细胞中的溶剂迅速升温，快速增加目的物的溶出，同时超声波的空化作用增加细胞破碎，加速胞内物质的释放，提高传质速度，从而提高有效成分得率。
3 结论
通过单因素试验与正交试验对乌药叶中总黄酮超声-微波协同提取工艺进行了优化，建立了一种快速提取乌药叶中总黄酮的方法。结果表明，其最佳条件为乙醇体积分数70%、料液比1∶40、提取温度45 ℃、提取时间7 min，此条件下总黄酮提取率达3.03%。该工艺稳定可行，与常规提取方法相比，具明显优势，适于乌药叶中总黄酮的提取。
参考文献
[1]肖梅，曹宁，樊晶晶，等.乌药叶黄酮类化学成分研究[J].中药材，2011，34（1）：62-64.
[2]陶曙，江月仙.乌药叶的毒理试验研究[J].中国医院药学杂志，2008，28（18）：1548-1550.
[3] 罗镭，张琳，田景奎，等.乌药叶化学成分的研究[J].中草药，2009，40（6）：856-858.
[4] 顾莉蕴，罗琼，肖梅，等.乌药叶总黄酮的抗氧化作用及对四氯化碳至小鼠肝损伤的保护作用[J].中药新药与临床药理，2008，19（6）：447-451.
[5] 曹宁，郭文洁，唐佳瑜，等.乌药叶总黄酮对高脂血症脂肪肝小鼠模型的降脂作用[J].中药新药与临床药理，2011， 22（2）：149-153.
[6] 裴志胜，张海德，袁腊梅，等.超声-微波协同萃取紫参薯花青素工艺[J].食品科学，2012，33（2）：78-83.
[7] 毛宝兴，张连富.超声-微波协同萃取法提取甘草总黄酮工艺研究[J].天然产物研究与开发，2009，21（B05）：150-154.
[8] 许海丹，陈珍，顾霞敏.乌药叶中总黄酮的含量测定[J].应用化工，2010，39（9）：1405-1407.
[9] 许海丹，顾霞敏.乌药叶中总黄酮提取工艺的研究[J].科学技术与工程，2010，10（26）：6515-6518.
[10] 王小伟，金则新，李建辉.微波萃取乌药叶中总黄酮的工艺研究[J].浙江林业科技，2009，29（4）：33-36.
[11] 陈建军，何国庆.超声波辅助萃取法提取乌药叶黄酮类化合物的工艺研究[J].林产化学与工业，2010，30（6）：102-107.
关键词 超声-微波协同提取；乌药叶；总黄酮；工艺；优化
中图分类号 S567；TQ460.6 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）17-072-02
Abstract [Objective] The process for ultrasonic.microwave assisted extraction of total flavonoids from Lindera aggregata leaves was developed. [Method] The concentration of ethanol， the ratio of solid to liquid， irradiation time and microwave temperature were selected as chief factors and orthogonal tests were studied to find the optimal extracting conditions. [Result] The optimum extraction conditions were as follows： 70% ethanol （V/V）， 1∶40 of solid to liquid， temperature at 45 ℃， extracting 7 min， the content of total flavonoids was 3.03%. [Conclusion] The study provides scientific reference for further development and utilization of Lindera aggregata leaves.
Key words Ultrasonic.microwave assisted extraction； Lindera aggregata leaves； Total flavonoids； Technique； Optimization
乌药叶为樟科山胡椒属药用植物乌药Lindera aggregata （Sims） Kosterm.的叶，具有温中燥脾、消食杀蛔、治腹中寒痛等作用[1]。毒性试验研究表明，乌药叶属实际无毒级，未见遗传毒性，长期服用安全[2]，被卫生部公告（2012年第19号）列为新资源食品。乌药叶中含有丰富的黄酮类物质[1，3]，具有抗氧化、降脂的药理作用[4-5]。
超声-微波协同法是近年发展起来的一种新方法，具有简单、快速、高效的特点，已被广泛用于天然产物有效成分的提取[6-7]。到目前为止，尚未见超声-微波协同提取乌药叶中总黄酮的文献报道。该研究优化了超声-微波协同提取乌药叶中总黄酮的工艺，为乌药叶资源的综合利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
乌药叶采自浙江省台州市天台县，经台州学院植物生理教研室陈珍博士鉴定为樟科山胡椒属植物乌药Lindera aggregata （Sims） Kosterm.的嫩叶；芦丁对照品（批号100080-200707，中国药品生物制品检定所）；其他试剂均为分析纯。
1.2 仪器 XO.SM100超声波微波组合反应系统（南京先欧生物科技有限公司）；UV.2450型紫外分光光度计（日本岛津公司）；RE.52AA型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；SH2.D（Ш）型循环水式真空泵（巩义予华仪器有限责任公司）。
1.3 试验方法
1.3.1 乌药叶中总黄酮的提取。
将乌药叶用清水洗净，自然风干，115 ℃杀青20 min，70 ℃下干燥7 h，粉碎过40目筛，经石油醚脱脂后，取适量置于三颈烧瓶中，采用超声-微波协同法提取，抽滤，弃去残渣。滤液减压浓缩并定容至50 ml，测定总黄酮含量。
1.3.2 单因素试验。
1.3.2.1 乙醇体积分数对乌药叶中总黄酮提取率的影响。按料液比1∶30分别加入50%、60%、70%、80%、90%乙醇-水溶液提取乌药叶中总黄酮，温度55 ℃下提取7 min，确定乙醇体积分数对提取效果的影响。
1.3.2.2 料液比对乌药叶中总黄酮提取率的影响。选用料液比为1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g/ml），乙醇体积分数采用“1.3.2.1”的最佳值，55 ℃下提取7 min，确定料液比对提取效果的影响。
1.3.2.3 提取温度对乌药叶中总黄酮提取率的影响。设定提取温度为35、40、45、50、55 ℃下提取乌药叶7 min，乙醇体积分数、料液比采用“1.3.2.1”、“1.3.2.2”的最佳值，确定提取温度对提取效果的影响。
1.3.2.4 提取时间对乌药叶中总黄酮提取率的影响。分别设定时间为5、6、7、8、9 min提取乌药叶中总黄酮，其余操作条件采用上述试验的最佳值，确定提取时间对提取效果的影响。
1.3.2.5 提取次数对乌药叶中总黄酮提取率的影响。对乌药叶分别提取1、2、3、4、5次，其余操作条件采用上述试验的最佳值，确定提取次数对提取效果的影响。
1.3.3 正交试验。在单因素试验的基础上，设计4因素3水平L9（34）正交表（表1）进行试验，优化提取工艺。 1.3.4 总黄酮提取率的测定。
取提取液1 ml，加入0.5 mol/L AlCl3溶液1.0 ml，摇匀，放置15 min，再用pH 6.0的HAc.NaAc缓冲溶液定容至10 ml，混匀，超声振荡5 min后，在415 nm处测定吸光度[8]。以芦丁为对照品，得吸光度A与质量浓度C（mg/ml）之间的回归方程为A=35.42 059C-0.019 42（r=0.999 64）。根据标准曲线回归方程，计算提取液的黄酮含量，从而得到总黄酮提取率，提取率=黄酮含量×提取液体积×稀释倍数乌药叶质量×100%。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响。选用不同比例的乙醇-水体系进行比较，结果表明（图1），乙醇体积分数为50%时，黄酮提取率较小，随着乙醇浓度的增加，黄酮的提取率增大，当乙醇体积分数达70%时，黄酮的提取率达最大，继续增加乙醇浓度，提取率则逐渐下降。故选用70%乙醇为提取溶剂。
2.1.2 料液比对总黄酮提取率的影响。从图1可看出，随着料液比的增加，黄酮类化合物的提取率先增加后减少，在1∶40时达最大值。过多的溶剂使得杂质含量变大，且回收溶剂时蒸馏时间过长，给后序的浓缩带来困难，能耗过高。因此，宜选1∶40为最佳料液比。
2.1.3 提取温度对总黄酮提取率的影响。由图1可见，随着温度的升高，黄酮提取率显著增加，在45 ℃时达最大，但当温度进一步增加时，黄酮类化合物的提取率却缓慢下降。这可能是因为温度过高会导致活性成分降解或异构化，使提取物有效成分含量降低。因此，45 ℃为最佳的提取温度。
2.1.4 提取时间对总黄酮提取率的影响。黄酮类化合物的提取率随着提取时间的增加逐渐增加，当在7 min时达最大值，之后随着提取时间的不断增加而逐渐下降（图1）。可见，随着提取时间的增长，微波和超声波产生大量的热对黄酮的结构有一定的破坏作用。因此，宜选7 min为最佳提取时间。
2.1.5 提取次数对总黄酮提取率的影响。从图1可看出，随着提取次数的增加，黄酮类化合物的提取率也不断升高。但提取2次之后，提取率增加比较缓慢，说明提取2次黄酮已基本溶出。考虑到提取周期、经济等因素，提取2次为最佳的提取次数。
2.2 正交试验
由表2可知，各因素对乌药叶中总黄酮提取率的影响程度主次顺序为乙醇体积分数>料液比>提取时间>提取温度。最佳提取方案为A2B2C2D2，即在料液比1∶40、70%乙醇、提取温度45 ℃条件下提取7 min。
2.3 验证试验
在优选的工艺条件下提取乌药叶中总黄酮，平行操作3份，测得总黄酮提取率为（3.03±0.05）%，RSD为1.55%，表明选择的最佳提取工艺可行。
2.4 超声-微波协同提取与常规提取方法的比较
将超声-微波协同提取的结果与文献[9-11]中加热回流法、微波法、超声波法提取的结果进行比较，结果发现（表3），该试验方法温度最低，总黄酮提取率最高，且溶剂安全价廉；在协同萃取的条件下，微波使植物细胞中的溶剂迅速升温，快速增加目的物的溶出，同时超声波的空化作用增加细胞破碎，加速胞内物质的释放，提高传质速度，从而提高有效成分得率。
3 结论
通过单因素试验与正交试验对乌药叶中总黄酮超声-微波协同提取工艺进行了优化，建立了一种快速提取乌药叶中总黄酮的方法。结果表明，其最佳条件为乙醇体积分数70%、料液比1∶40、提取温度45 ℃、提取时间7 min，此条件下总黄酮提取率达3.03%。该工艺稳定可行，与常规提取方法相比，具明显优势，适于乌药叶中总黄酮的提取。
参考文献
[1]肖梅，曹宁，樊晶晶，等.乌药叶黄酮类化学成分研究[J].中药材，2011，34（1）：62-64.
[2]陶曙，江月仙.乌药叶的毒理试验研究[J].中国医院药学杂志，2008，28（18）：1548-1550.
[3] 罗镭，张琳，田景奎，等.乌药叶化学成分的研究[J].中草药，2009，40（6）：856-858.
[4] 顾莉蕴，罗琼，肖梅，等.乌药叶总黄酮的抗氧化作用及对四氯化碳至小鼠肝损伤的保护作用[J].中药新药与临床药理，2008，19（6）：447-451.
[5] 曹宁，郭文洁，唐佳瑜，等.乌药叶总黄酮对高脂血症脂肪肝小鼠模型的降脂作用[J].中药新药与临床药理，2011， 22（2）：149-153.
[6] 裴志胜，张海德，袁腊梅，等.超声-微波协同萃取紫参薯花青素工艺[J].食品科学，2012，33（2）：78-83.
[7] 毛宝兴，张连富.超声-微波协同萃取法提取甘草总黄酮工艺研究[J].天然产物研究与开发，2009，21（B05）：150-154.
[8] 许海丹，陈珍，顾霞敏.乌药叶中总黄酮的含量测定[J].应用化工，2010，39（9）：1405-1407.
[9] 许海丹，顾霞敏.乌药叶中总黄酮提取工艺的研究[J].科学技术与工程，2010，10（26）：6515-6518.
[10] 王小伟，金则新，李建辉.微波萃取乌药叶中总黄酮的工艺研究[J].浙江林业科技，2009，29（4）：33-36.
[11] 陈建军，何国庆.超声波辅助萃取法提取乌药叶黄酮类化合物的工艺研究[J].林产化学与工业，2010，30（6）：102-107.