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[摘要]目的：探讨两种不同培养基诱导CIK细胞的差异。方法：健康自愿者来源的外周血单个核细胞（PBMC）.分别加入CTS培养和H3培养基中进行诱导培养，在培养的第0、3、7、10、12、14天分别取细胞进行计数，每日电子显微镜下观察细胞状态，在培养的第10天以流式细胞术检测两组培养细胞表面CD3、CD56的表达情况。结果：CIK培养基和H3培养基均可使培养细胞在第7天时开始明显扩增，第10天时可扩增至200倍。其中，CIK培养基获得的细胞扩增倍数明显高于H3培养基（P<0.05）;流式结果CD3/CD56显示两种培养基无明显差异。结论：不同成分的CTS培养基和H3培养基均可促进CIK细胞的扩增和成熟，但呈现不同生物学特征。
[关键词]CIK细胞;培养基;增殖率;表型
[中图分类号]R329 [文献标识码]A [文章编号]2096-5249（2019）19-0032-02
肿瘤的生物免疫治疗作为第四种治疗手段日益受到重视。细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced killercell，CIK）是肿瘤生物免疫治疗的主力军。国内的一些临床研究机构也相继开展了这方面的研究工作并取得了一定的成效。但是，目前CIK细胞的制备尚没有统一的规范，各个研究中心报道的培养方法并不一致，所制备CIK细胞的扩增倍数、细胞表型、生物学活性等均存在一定的差异。本研究利用两种不同培养基，使用标准的实验室培养方法（SOP），将人外周血淋巴细胞诱导成CIK，分析不同培养基获得的CIK细胞的扩增倍数，细胞表型等生物学特征，旨在为标准化使用CIK治疗提供相应的参考。
1 材料与方法
1.1主要材料无血清AIM V MED CTS培养基（InvitrogenTrading，Gibco批号：1776632），无血清了akara H3培养基（宝日医，Takara批号：WKl60315），流式细胞仪检测用抗人CD3/CD56荧光抗体购自BD公司。
1.2CIK细胞培养取肝素抗凝的健康志愿者外周血30ml，用人淋巴細胞分离液密度梯度离心（800g，20min），吸取白膜层，置于15ml离心管中，用生理盐水洗涤3次，分别用CTS培养基和H3培养基（含低浓度IL-2，IFN-r悬浮细胞，调整细胞密度为1X105/ml，加入75cm2培养瓶，37℃，5%CO2培养箱培养。根据细胞生长情况补加培养基并扩大培养。
1.3显微镜观察CIK细胞的增殖细胞培养至第O、3、7、10、12、14天时，显微镜下观察细胞生长情况;取样进行细胞计数，用台盼蓝染色检测细胞活力。
1.4流式细胞仪检测ClK细胞表型细胞培养10d后，取一定数量细胞洗涤离心，用PBS调整细胞密度至1X106/ml，加入流式管中，200ul/管;分别加入抗人CD3/CD56抗体，置暗处4℃标记20min，PBS洗涤2次，用流式细胞仪进行检测。
1.5统计学处理使用SPSSl8.0统计软件进行处理，计量资料进行描述性统计，变量用（x±s）表示;治疗前后结果比较，采用单因素重复测量方差分析，若P<0.05，则应用Bonferroni多重比较，进行治疗前与治疗后两两比较。
2 结果
2.1两种培养基体外诱导ClK细胞的增殖水平
实验结果（图1）显示
两种培养基在第0、3、7天时增殖速度无明显差异，在第10天后出现差异性，用CTS培养基获得的CIK细胞扩增倍数明显高于H3培养基（P<0.05）。培养期间，台盼蓝染色活力检测显示，以两种培养基获得的CIK细胞活力均大于98%。CTS培养基诱导10d的细胞呈明显克隆生长，H3培养基则较少（图2）。
2.2两种培养基诱导的ClK细胞表型细胞培养至第10天时，流式细胞术进行检测，结果（图3，表1）显示，CTS培养基和H3培养基诱导的CIK细胞中CD3-CD56+细胞百分比分别为（2.3±1.8）%和（1.8±0.5）%;CD3-CD56+细胞百分比分别为（1.5±0.8）%和（3.7±1.5）%;CD3+细胞百分比分别为（92.3±5.8）%和（85.9±15.5）%。
3 讨论
CIK细胞是在体外条件下通过加入不同的细胞因子（IFN-r、IL-1、IL-2、CD3McAb）刺激外周血单个核细胞培养诱导而成，同时表达CD3、CD56两种膜蛋白分子。与既往临床使用的过继免疫疗法相比，CIK细胞具有增殖速度快、杀瘤活性高、杀瘤谱广、对多重耐药肿瘤细胞同样敏感、对正常骨髓造血前体细胞细胞毒性小等特点，是目前发现的杀伤肿瘤细胞活性强，适合临床应用的一种理想的效应细胞，其疗效主要体现在控制肿瘤复发及提高生活质量等方面。CIK细胞治疗肿瘤的疗效主要取决于输注的有效细胞数量及其杀伤活性。
本研究比较了两种不同的培养基诱导刺激对人外周血单个核细胞制备CIK的影响，结果发现，两种培养基均使培养细胞在第7天时即开始明显扩增，在培养10d时即可扩增至300倍左右，用CTS培养基获得的CIK细胞扩增能力明显高于H3培养基。CTS培养基所获得的CIK细胞中，CD3+细胞百分比明显高于H3培养基;CD3-CD56+CD3+CD56+细胞百分比无明显差异。说明CTS培养基可以在体外快速扩增CIK细胞，且T细胞纯度较高，有利于为今后体外高效扩增培养CIK提供一定的参考。
[关键词]CIK细胞;培养基;增殖率;表型
[中图分类号]R329 [文献标识码]A [文章编号]2096-5249（2019）19-0032-02
肿瘤的生物免疫治疗作为第四种治疗手段日益受到重视。细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced killercell，CIK）是肿瘤生物免疫治疗的主力军。国内的一些临床研究机构也相继开展了这方面的研究工作并取得了一定的成效。但是，目前CIK细胞的制备尚没有统一的规范，各个研究中心报道的培养方法并不一致，所制备CIK细胞的扩增倍数、细胞表型、生物学活性等均存在一定的差异。本研究利用两种不同培养基，使用标准的实验室培养方法（SOP），将人外周血淋巴细胞诱导成CIK，分析不同培养基获得的CIK细胞的扩增倍数，细胞表型等生物学特征，旨在为标准化使用CIK治疗提供相应的参考。
1 材料与方法
1.1主要材料无血清AIM V MED CTS培养基（InvitrogenTrading，Gibco批号：1776632），无血清了akara H3培养基（宝日医，Takara批号：WKl60315），流式细胞仪检测用抗人CD3/CD56荧光抗体购自BD公司。
1.2CIK细胞培养取肝素抗凝的健康志愿者外周血30ml，用人淋巴細胞分离液密度梯度离心（800g，20min），吸取白膜层，置于15ml离心管中，用生理盐水洗涤3次，分别用CTS培养基和H3培养基（含低浓度IL-2，IFN-r悬浮细胞，调整细胞密度为1X105/ml，加入75cm2培养瓶，37℃，5%CO2培养箱培养。根据细胞生长情况补加培养基并扩大培养。
1.3显微镜观察CIK细胞的增殖细胞培养至第O、3、7、10、12、14天时，显微镜下观察细胞生长情况;取样进行细胞计数，用台盼蓝染色检测细胞活力。
1.4流式细胞仪检测ClK细胞表型细胞培养10d后，取一定数量细胞洗涤离心，用PBS调整细胞密度至1X106/ml，加入流式管中，200ul/管;分别加入抗人CD3/CD56抗体，置暗处4℃标记20min，PBS洗涤2次，用流式细胞仪进行检测。
1.5统计学处理使用SPSSl8.0统计软件进行处理，计量资料进行描述性统计，变量用（x±s）表示;治疗前后结果比较，采用单因素重复测量方差分析，若P<0.05，则应用Bonferroni多重比较，进行治疗前与治疗后两两比较。
2 结果
2.1两种培养基体外诱导ClK细胞的增殖水平
实验结果（图1）显示
两种培养基在第0、3、7天时增殖速度无明显差异，在第10天后出现差异性，用CTS培养基获得的CIK细胞扩增倍数明显高于H3培养基（P<0.05）。培养期间，台盼蓝染色活力检测显示，以两种培养基获得的CIK细胞活力均大于98%。CTS培养基诱导10d的细胞呈明显克隆生长，H3培养基则较少（图2）。
2.2两种培养基诱导的ClK细胞表型细胞培养至第10天时，流式细胞术进行检测，结果（图3，表1）显示，CTS培养基和H3培养基诱导的CIK细胞中CD3-CD56+细胞百分比分别为（2.3±1.8）%和（1.8±0.5）%;CD3-CD56+细胞百分比分别为（1.5±0.8）%和（3.7±1.5）%;CD3+细胞百分比分别为（92.3±5.8）%和（85.9±15.5）%。
3 讨论
CIK细胞是在体外条件下通过加入不同的细胞因子（IFN-r、IL-1、IL-2、CD3McAb）刺激外周血单个核细胞培养诱导而成，同时表达CD3、CD56两种膜蛋白分子。与既往临床使用的过继免疫疗法相比，CIK细胞具有增殖速度快、杀瘤活性高、杀瘤谱广、对多重耐药肿瘤细胞同样敏感、对正常骨髓造血前体细胞细胞毒性小等特点，是目前发现的杀伤肿瘤细胞活性强，适合临床应用的一种理想的效应细胞，其疗效主要体现在控制肿瘤复发及提高生活质量等方面。CIK细胞治疗肿瘤的疗效主要取决于输注的有效细胞数量及其杀伤活性。
本研究比较了两种不同的培养基诱导刺激对人外周血单个核细胞制备CIK的影响，结果发现，两种培养基均使培养细胞在第7天时即开始明显扩增，在培养10d时即可扩增至300倍左右，用CTS培养基获得的CIK细胞扩增能力明显高于H3培养基。CTS培养基所获得的CIK细胞中，CD3+细胞百分比明显高于H3培养基;CD3-CD56+CD3+CD56+细胞百分比无明显差异。说明CTS培养基可以在体外快速扩增CIK细胞，且T细胞纯度较高，有利于为今后体外高效扩增培养CIK提供一定的参考。