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摘 要：采用小檗碱临床利用量对黄柏药材的质量进行再评价研究。通过正交试验优选黄柏小檗碱最佳临床提取工艺，根据最佳提取工艺采用HPLC法测定5批不同产地黄柏小檗碱含量，然后计算其临床利用量。黄柏小檗碱最佳临床提取工艺为加药材10倍量的水提取3次，每次1.5 h。贵州、陕西、湖北、天津、新疆的小檗碱临床利用量（g/100 g）分别为11.10，7.30，1.35，1.30，1.40 g。该文建立的方法将中药材中的有效成分与临床实际利用情况相联系，为黄柏及其他的中药材品质评价提供新思路。
关键词：黄柏；小檗碱；临床利用量；质量评价
文献标志码：A 文章编号：1674-5124（2016）12-0045-04
0 引 言
黄柏为一种常用中药，是芸香科植物黄皮树（Phellodendron chinense Schneid.）的干燥树皮，具有清热泻火、解毒退虚热之功效，小檗碱为其主要成分之一[1]。小檗碱为临床上常用的一种广谱抗菌药，主要用于菌痢、胃肠炎、痈肿等细菌性感染[2]。研究证明小檗碱还具有抗肿瘤、抗心律失常、降血糖、将压等作用[3]。目前药材质量评价主要以化学有效成分含量为指标，但一些研究发现有些有效成分在临床上利用量不高，出现了“质优用劣”的现象。《中国药典》2015版一部里收载的中药材有效成分含量为（过三号药典筛）药粉含量，即用部分药材含量来作为药材的整体含量，一些研究表明，取过筛后的细粉进行含量测定，所得结果并不能完全代表药材整体真实的含量。因此刘涛等[4]提出用药材真实含量结合有效成分临床利用量来评价药材的质量。“中药成分临床利用量”是指药材成分在临床应用时，药材中的化学成分可被临床使用时的使用量。基于“中药成分临床利用量”的中药材药用质量评价指标，符合中医药临床应用特点，是体现中药特色的中药质量评价方法。本文对5个产地的黄柏采用小檗碱临床利用量的方法进行品质考察，对其有效成分在临床上的应用具有重要参考价值，也为其他药材的品质评价提供了一种新思路。
1 仪器与试剂
iChrom P5100型高效液相色谱仪（大连依利特分析仪器有限公司），BS-6KH型电子天平（上海友声衡器有限公司），FA2004型电子分析天平（上海良平仪器仪表有限公司生产）。黄柏药材购自各地大型药材市场及药房，共6个样品，经成都大学鉴定四川、贵州、天津、陕西、湖北、新疆产地购买的实验药材为黄柏干燥树皮（详情见表5）；其中四川黄柏（批号20150523）购自成都市荷花池中药材市场，用于工艺条件研究。小檗碱对照品（批号150623-160724），由中国食品药品检定研究所提供。乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
长期以来，人们习用水作为溶媒煎煮黄柏药材，供患者服用，因此结合临床实际应用，本实验用水作为提取溶媒，不超过3次提取次数和1.5 h提取时间对黄柏药材的临床利用量进行考察。
2.1 黄柏小檗碱含量测定
2.1.1 色谱条件
色谱柱GS-120-5-C18-AP（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相乙腈-0.1%磷酸（ν∶ν，50∶50）（100 mL加0.1 g十二烷基磺酸钠），检测波长265 nm，柱温室温，流量1 mL/min。
2.1.2 对照品溶液的制备
精密称取小檗碱适量，用2.1.1的流动相稀释成质量浓度为0.074 3 mg/mL的溶液，其 HPLC图谱如图1（a）所示。
2.1.3 供试品溶液的制备
供试品溶液1 精密称定过三号筛的粉末约0.1 g，置于100 mL容量品中，加流动相80 mL超声处理，40 min冷却，用流动相稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得。
供试品溶液2 精密称定供试品溶液1制备粉碎时未过三号筛的部分药材约0.1 g，置于100 mL容量品中，加流动相80 mL超声处理，40 min冷却，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
供试品溶液3 精密量取2.2.2、2.2.3、2.3.2项下的提取2 mL至50 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，再按2.1.1的色谱条件测定，其 HPLC图谱如图1（b）所示。
2.1.4 精密度试验
精密吸取盐酸小檗碱对照品溶液10 μL，按照2.1.1的色谱条件重复进样6次，测定其峰面积，计算RSD为1.04%，表明仪器精密度良好。
2.1.5 加样回收率试验
精密吸取已知含量的黄柏提取液1 mL于50 mL量瓶中，精密加入对照品溶液3 mL（1.01 mg/mL），按2.1.3中供试品溶液2的方法制成供试品溶液，平行6份，按2.1.1的色谱条件分别测定盐酸小檗碱峰面积，结果平均回收率为98.96%，RSD为1.55%，表明本方法回收率良好。结果见表1。
2.2 正交试验设计优选提取工艺
2.2.1 因素及水平的选择
以水为提取溶媒[5-6]，选取溶媒用量、提取次数、提取时间为考察因素，以提取液中小檗碱的量为考察指标[7-8]，采用L9（34）正交表安排实验。其因素水平表如表2所示。
2.2.2 正交试验设计及结果
分别取9组四川黄柏药材（每组80 g）按照正交试验设计表进行实验，测量提取液的体积，根据2.1.1和2.1.3的步骤进行含量测定，以小檗碱含量为指标进行分析[9-10]。结果如表3所示，方差分析如表4所示。
由表3可得，水的用量、提取次数以及提取时间3个因素对小檗碱的提取影响程度不同，R值大小依次为RC>RB>RA，提取时间对于含量的影响最大。表4可得，水的用量（A）对实验结果有显著性影響，提取次数（B）和提取时间（C）对实验结果有极显著性影响，根据此分析结果，选择最佳提取工艺为A3B3C3，即用10倍药材量的水提取3次，每次1.5 h。 2.2.3 提取工艺验证
取3组黄柏药材，1、2组80 g，第3组160 g，1、2组分别加入800 mL水，第3组加入1 600 mL水，每组提取3次，每次1.5 h。测定提取液的体积，计算小檗碱的量，结果如表5所示。
结果表明，3组验证试验小檗碱的量分别为6.388 9，6.560 7，13.590 1 g，表明所选择的提取工艺稳定、可行。
2.3 不同产地黄柏小檗碱真实含量以及临床利用量测定
2.3.1 不同产地黄柏小檗碱真实含量测定
按2.1.3供试品溶液制备方法和2.1.1的色谱條件分别测定5批不同产地黄柏，其通过三号药典筛的粉末与未通过的部分药材的小檗碱含量，然后计算出黄柏整体药材小檗碱含量，即为药材真实含量。结果如表7所示。
2.3.2 不同产地黄柏小檗碱临床利用量测定
分别取每批不同产地的黄柏药材2组，每组100 g，分别加入1 000 mL水，每组提取3次，每次1.5 h。测定提取液的体积，计算小檗碱的临床利用量，结果如表8所示。
2.3.3 实验结果
从表7中可以得知，贵州与陕西的黄柏小檗碱的真实含量最高，分别为15.7%、16.4%；湖北与新疆的相差不大，分别为3.42%、5.07%；天津的最低，其小檗碱真实含量为1.56%。药材的真实含量低于过三号药典筛的粉末的含量。
从表8中可以得知，不同产地黄柏小檗碱的临床利用量各不相同，临床利用量最高的是贵州，为11.10 g/100 g；其次是陕西的黄柏临床利用量，为7.30 g/100 g；天津、湖北、新疆的临床利用量相差不大，分别为1.30，1.35，1.40 g/100 g。
2.3.4 结 论
由表7可知，5个产地黄柏的真实含量比药典中的方法低，将会对提取转移率的计算产生一定的影响，故在计算提取转移率时，采用真实含量计算较好。由表8可知，陕西的黄柏含量最高，但提取转移率较低，而天津的黄柏含量最低，转移率却较高，表明药材含量的高低与提取转移率并非成正比关系，因此，在“真实含量”以及提取转移率基础上提出的“中药成分临床利用量”评价中药品质的方法具有一定意义。中药成分临床利用量[11-12]不仅可以反映药材真实含量和转移率的高低，同时对该成分在临床上实际被利用的情况具有重要参考价值，为中药材的品质评价提供了一种新思路。
3 结束语
本文采用小檗碱临床利用量对黄柏药材进行质量评价，测定贵州、陕西、湖北、天津、新疆等地小檗碱的真实含量和临床利用量，建立了中药有效成分与临床实际利用的关系。在“真实含量”以及提取转移率基础上提出的“中药成分临床利用量”评价中药品质的方法就具有一定的优势。“中药成分临床利用量”是指药材成分在临床应用时，药材中的化学成分可被临床使用时利用的量[4]。中药成分临床利用量不仅可以反映指标成分或有效成分含量以及提取转移率的高低，同时对其在临床上实际被利用的情况具有重要参考价值，为中药材的品质评价提供了一种新的方法。
参考文献
[1] 胡宝平，税丕先. 小檗碱提取工艺研究进展[J]. 泸州医学院学报，2011，34（2）：214-216.
[2] 胡俊青，胡晓. 黄柏化学成分和药理作用的现代研究[J]. 当代医学，2009，15（7）：139-141.
[3] 方艺霖. 含小檗碱类中药品质生物评价与控制的初步研究[D]. 成都：成都中医药大学，2008.
[4] 刘涛，苟小军，万德光，等. 基于“中药成分临床利用率”的中药材药用品质评价模式的商建[J]. 中草药，2015，46（13）：1863-1866.
[5] 邢俊波，刘云. 正交设计优选黄柏中小檗碱的提取工艺[J].时珍国医国药，2003，14（3）：129-130.
[6] 吴珊珊. 黄柏不同规格、不同炮制品内在质量研究[D]. 成都：成都中医药大学，2014.
[7] 李跃辉，胡薏冰，王银，等. 不同产区与采收期黄柏中小檗碱与黄柏碱含量对比研究[J]. 中国医药导报，2014，11（11）：90-93.
[8] 孙雪梅，卢先明，邓晶晶，等. HPLC测定黄柏不同部位中的盐酸小檗碱和盐酸药根碱[J].华西药学杂志，2010，25（5）：599-600.
[9] 林丽. 黄柏炮制前后水提液的成分变化[J]. 社区医学杂志，2014，12（21）：37-39.
[10] 刘涛，郭晓恒，吴春梅，等. 肺毒清颗粒中有效成分的含量测定及转移率考察[J]. 中国实验方剂学杂志，2013，19（10）：54-56.
[11] 刘涛，张蕾，刘婷，等. 不同产地黄芩中的黄芩苷提取转移率研究[J]. 成都大学学报（自然科学版），2014，33（1）：7-9.
[12] 简永耀，靳龙文. 不同产地黄柏药材的质量分析[J]. 淮海医药，2007，25（6）：566-567.
（编辑：徐柳）
关键词：黄柏；小檗碱；临床利用量；质量评价
文献标志码：A 文章编号：1674-5124（2016）12-0045-04
0 引 言
黄柏为一种常用中药，是芸香科植物黄皮树（Phellodendron chinense Schneid.）的干燥树皮，具有清热泻火、解毒退虚热之功效，小檗碱为其主要成分之一[1]。小檗碱为临床上常用的一种广谱抗菌药，主要用于菌痢、胃肠炎、痈肿等细菌性感染[2]。研究证明小檗碱还具有抗肿瘤、抗心律失常、降血糖、将压等作用[3]。目前药材质量评价主要以化学有效成分含量为指标，但一些研究发现有些有效成分在临床上利用量不高，出现了“质优用劣”的现象。《中国药典》2015版一部里收载的中药材有效成分含量为（过三号药典筛）药粉含量，即用部分药材含量来作为药材的整体含量，一些研究表明，取过筛后的细粉进行含量测定，所得结果并不能完全代表药材整体真实的含量。因此刘涛等[4]提出用药材真实含量结合有效成分临床利用量来评价药材的质量。“中药成分临床利用量”是指药材成分在临床应用时，药材中的化学成分可被临床使用时的使用量。基于“中药成分临床利用量”的中药材药用质量评价指标，符合中医药临床应用特点，是体现中药特色的中药质量评价方法。本文对5个产地的黄柏采用小檗碱临床利用量的方法进行品质考察，对其有效成分在临床上的应用具有重要参考价值，也为其他药材的品质评价提供了一种新思路。
1 仪器与试剂
iChrom P5100型高效液相色谱仪（大连依利特分析仪器有限公司），BS-6KH型电子天平（上海友声衡器有限公司），FA2004型电子分析天平（上海良平仪器仪表有限公司生产）。黄柏药材购自各地大型药材市场及药房，共6个样品，经成都大学鉴定四川、贵州、天津、陕西、湖北、新疆产地购买的实验药材为黄柏干燥树皮（详情见表5）；其中四川黄柏（批号20150523）购自成都市荷花池中药材市场，用于工艺条件研究。小檗碱对照品（批号150623-160724），由中国食品药品检定研究所提供。乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
长期以来，人们习用水作为溶媒煎煮黄柏药材，供患者服用，因此结合临床实际应用，本实验用水作为提取溶媒，不超过3次提取次数和1.5 h提取时间对黄柏药材的临床利用量进行考察。
2.1 黄柏小檗碱含量测定
2.1.1 色谱条件
色谱柱GS-120-5-C18-AP（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相乙腈-0.1%磷酸（ν∶ν，50∶50）（100 mL加0.1 g十二烷基磺酸钠），检测波长265 nm，柱温室温，流量1 mL/min。
2.1.2 对照品溶液的制备
精密称取小檗碱适量，用2.1.1的流动相稀释成质量浓度为0.074 3 mg/mL的溶液，其 HPLC图谱如图1（a）所示。
2.1.3 供试品溶液的制备
供试品溶液1 精密称定过三号筛的粉末约0.1 g，置于100 mL容量品中，加流动相80 mL超声处理，40 min冷却，用流动相稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得。
供试品溶液2 精密称定供试品溶液1制备粉碎时未过三号筛的部分药材约0.1 g，置于100 mL容量品中，加流动相80 mL超声处理，40 min冷却，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
供试品溶液3 精密量取2.2.2、2.2.3、2.3.2项下的提取2 mL至50 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，再按2.1.1的色谱条件测定，其 HPLC图谱如图1（b）所示。
2.1.4 精密度试验
精密吸取盐酸小檗碱对照品溶液10 μL，按照2.1.1的色谱条件重复进样6次，测定其峰面积，计算RSD为1.04%，表明仪器精密度良好。
2.1.5 加样回收率试验
精密吸取已知含量的黄柏提取液1 mL于50 mL量瓶中，精密加入对照品溶液3 mL（1.01 mg/mL），按2.1.3中供试品溶液2的方法制成供试品溶液，平行6份，按2.1.1的色谱条件分别测定盐酸小檗碱峰面积，结果平均回收率为98.96%，RSD为1.55%，表明本方法回收率良好。结果见表1。
2.2 正交试验设计优选提取工艺
2.2.1 因素及水平的选择
以水为提取溶媒[5-6]，选取溶媒用量、提取次数、提取时间为考察因素，以提取液中小檗碱的量为考察指标[7-8]，采用L9（34）正交表安排实验。其因素水平表如表2所示。
2.2.2 正交试验设计及结果
分别取9组四川黄柏药材（每组80 g）按照正交试验设计表进行实验，测量提取液的体积，根据2.1.1和2.1.3的步骤进行含量测定，以小檗碱含量为指标进行分析[9-10]。结果如表3所示，方差分析如表4所示。
由表3可得，水的用量、提取次数以及提取时间3个因素对小檗碱的提取影响程度不同，R值大小依次为RC>RB>RA，提取时间对于含量的影响最大。表4可得，水的用量（A）对实验结果有显著性影響，提取次数（B）和提取时间（C）对实验结果有极显著性影响，根据此分析结果，选择最佳提取工艺为A3B3C3，即用10倍药材量的水提取3次，每次1.5 h。 2.2.3 提取工艺验证
取3组黄柏药材，1、2组80 g，第3组160 g，1、2组分别加入800 mL水，第3组加入1 600 mL水，每组提取3次，每次1.5 h。测定提取液的体积，计算小檗碱的量，结果如表5所示。
结果表明，3组验证试验小檗碱的量分别为6.388 9，6.560 7，13.590 1 g，表明所选择的提取工艺稳定、可行。
2.3 不同产地黄柏小檗碱真实含量以及临床利用量测定
2.3.1 不同产地黄柏小檗碱真实含量测定
按2.1.3供试品溶液制备方法和2.1.1的色谱條件分别测定5批不同产地黄柏，其通过三号药典筛的粉末与未通过的部分药材的小檗碱含量，然后计算出黄柏整体药材小檗碱含量，即为药材真实含量。结果如表7所示。
2.3.2 不同产地黄柏小檗碱临床利用量测定
分别取每批不同产地的黄柏药材2组，每组100 g，分别加入1 000 mL水，每组提取3次，每次1.5 h。测定提取液的体积，计算小檗碱的临床利用量，结果如表8所示。
2.3.3 实验结果
从表7中可以得知，贵州与陕西的黄柏小檗碱的真实含量最高，分别为15.7%、16.4%；湖北与新疆的相差不大，分别为3.42%、5.07%；天津的最低，其小檗碱真实含量为1.56%。药材的真实含量低于过三号药典筛的粉末的含量。
从表8中可以得知，不同产地黄柏小檗碱的临床利用量各不相同，临床利用量最高的是贵州，为11.10 g/100 g；其次是陕西的黄柏临床利用量，为7.30 g/100 g；天津、湖北、新疆的临床利用量相差不大，分别为1.30，1.35，1.40 g/100 g。
2.3.4 结 论
由表7可知，5个产地黄柏的真实含量比药典中的方法低，将会对提取转移率的计算产生一定的影响，故在计算提取转移率时，采用真实含量计算较好。由表8可知，陕西的黄柏含量最高，但提取转移率较低，而天津的黄柏含量最低，转移率却较高，表明药材含量的高低与提取转移率并非成正比关系，因此，在“真实含量”以及提取转移率基础上提出的“中药成分临床利用量”评价中药品质的方法具有一定意义。中药成分临床利用量[11-12]不仅可以反映药材真实含量和转移率的高低，同时对该成分在临床上实际被利用的情况具有重要参考价值，为中药材的品质评价提供了一种新思路。
3 结束语
本文采用小檗碱临床利用量对黄柏药材进行质量评价，测定贵州、陕西、湖北、天津、新疆等地小檗碱的真实含量和临床利用量，建立了中药有效成分与临床实际利用的关系。在“真实含量”以及提取转移率基础上提出的“中药成分临床利用量”评价中药品质的方法就具有一定的优势。“中药成分临床利用量”是指药材成分在临床应用时，药材中的化学成分可被临床使用时利用的量[4]。中药成分临床利用量不仅可以反映指标成分或有效成分含量以及提取转移率的高低，同时对其在临床上实际被利用的情况具有重要参考价值，为中药材的品质评价提供了一种新的方法。
参考文献
[1] 胡宝平，税丕先. 小檗碱提取工艺研究进展[J]. 泸州医学院学报，2011，34（2）：214-216.
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[5] 邢俊波，刘云. 正交设计优选黄柏中小檗碱的提取工艺[J].时珍国医国药，2003，14（3）：129-130.
[6] 吴珊珊. 黄柏不同规格、不同炮制品内在质量研究[D]. 成都：成都中医药大学，2014.
[7] 李跃辉，胡薏冰，王银，等. 不同产区与采收期黄柏中小檗碱与黄柏碱含量对比研究[J]. 中国医药导报，2014，11（11）：90-93.
[8] 孙雪梅，卢先明，邓晶晶，等. HPLC测定黄柏不同部位中的盐酸小檗碱和盐酸药根碱[J].华西药学杂志，2010，25（5）：599-600.
[9] 林丽. 黄柏炮制前后水提液的成分变化[J]. 社区医学杂志，2014，12（21）：37-39.
[10] 刘涛，郭晓恒，吴春梅，等. 肺毒清颗粒中有效成分的含量测定及转移率考察[J]. 中国实验方剂学杂志，2013，19（10）：54-56.
[11] 刘涛，张蕾，刘婷，等. 不同产地黄芩中的黄芩苷提取转移率研究[J]. 成都大学学报（自然科学版），2014，33（1）：7-9.
[12] 简永耀，靳龙文. 不同产地黄柏药材的质量分析[J]. 淮海医药，2007，25（6）：566-567.
（编辑：徐柳）