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摘要 [目的]鉴定安徽和县地区辣椒病株辣椒轻斑驳病毒（pepper mild mottle virus，PMMoV） （PMMoV-AH）。[方法]采用胶体金免疫层析试纸条和RT-PCR检测和县辣椒病样辣椒轻斑驳病毒，并将其外壳蛋白基因序列与已报道的国内外12个PMMoV分离物进行同源性分析。[结果]PMMoV-AH与已报道的12个分离物核苷酸同源性介于94.5%～100.0%，氨基酸同源性介于96.8%～100.0%。基于外殼蛋白基因序列进行系统发育分析发现，PMMoV-AH与亚洲分离物亲缘关系密切，与其他区域分离物亲缘关系较远。[结论]PMMoV危害性强，对于其在安徽地区的发生和防治还需进一步研究。
关键词 辣椒轻斑驳病毒；外壳基因；和县
中图分类号 S436.418.1 文献标识码
A 文章编号 0517-6611（2018）32-0082-03
Identification of Pepper Mild Mottle Virus in Hexian，Anhui Province
YAN Dankan1，ZHENG Hongying2，ZHANG Haishan1 et al （1.Institute of Plant Protection and AgroProducts Safety，Anhui Academy of Agricultural Sciences，Heifei，Anhui 230031；2.Institute of Virology and Biotechnology，Zhejiang Academy of Agricultural Sciences，Hangzhou，Zhejiang 310021）
Abstract [Objective]To identify the pepper mild mottle virus in Hexian，Anhui Province.[Method]The PMMoVAH was identified in the sample of diseased fruits of pepper which collected in Hexian by using immunochromatography colloidal gold strip and RTPCR method.The pair of universal primers was used to amplify the coat protein gene sequence of PMMoVAH.[Result]Sequence analysis and phylogenetic analysis showed that PMMoVAH was closely related to 12 PMMoV isolates reported in China and abroad with nucleotide sequence identity between 94.5%-100.0% and amino acid sequence identity between 96.8%-100.0%.Phylogenetic tree showed that PMMoVAH was closely related to Asian isolates but not with other isolates.[Conclusion]Due to the significant losses caused by PMMoV，further research is required to control and prevent the prevailing of the disease caused by PMMoV in Anhui Province.
Key words Pepper mild mottle virus；Coat protein gene；Hexian
基金项目 国家公益性行业（农业）科研专项（201303028）；安徽省农业科学院学科建设项目 （17A1125）；安徽省蔬菜产业技术体系。
作者简介 严丹侃（1986—），男，安徽滁州人，助理研究员，硕士，从事植物病毒与媒介昆虫研究。*通讯作者，章东方，研究员，从事植物病毒与媒介昆虫研究；燕飞，研究员，博士，从事植物病毒学研究。
收稿日期 2017-11-28；修回日期 2018-05-30
辣椒病毒病是辣椒生产中的重要病害，目前已发现近 40种病毒可以侵染辣椒[1-2]，包括烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus，TMV）、 黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus，CMV） 、马铃薯 Y 病毒（potato virus Y，PVY）、蚕豆萎蔫病毒（broad bean wilt virus，BBWV）和辣椒轻斑驳病毒（pepper mild mottle virus，PMMoV）等。安徽省和县是全国著名的蔬菜生产基地，截至2016年底，该县种植蔬菜面积2.87万hm2，年产蔬菜110万t。和县蔬菜生产以秋延辣椒生产闻名，常年种植面积0.67万hm2以上，鲜产红辣椒20多万t，是全国绿色食品原料（辣椒）标准化生产基地，“和县辣椒”品牌获得地理标志商标。近年来，和县辣椒生产上辣椒病毒病危害加重，特别是当地主栽辣椒品种“好农11”发病严重。染病辣椒叶片症状较轻，而果实症状明显，呈现斑驳、凹陷和坏死等病毒病症状，后期辣椒果实外观和内在品质均显著变差，严重影响当地辣椒生产。为明确该病毒病种类，笔者采用血清学和 RT-PCR 等方法对该病毒进行了鉴定，并对其所感染病毒的系统发育关系进行了分析，从而为和县辣椒病毒病防治提供理论基础。 1 材料与方法
1.1 材料 2016年 10 月—2017年4月在安徽省和县温室大棚采集辣椒样本（PMMoV-AH），采集样本为具有明显扭曲或斑驳等症状的辣椒病果，将其保存于-70 ℃冰箱中备用。
供试 PMMoV胶体金免疫层析试纸条购自美国Agdia公司；植物总 RNA 提取试剂盒MiniBEST Plant RNA Extraction Kit购自TaKaRa公司；PCR扩增采用的Premix TaqTM购自TaKaRa公司。
1.2 方法
1.2.1 辣椒果实总RNA提取和cDNA合成。选取 2 份经 DAS-ELISA 检测为阳性的辣椒病叶，提取病叶总 RNA，以2份温室培育的健康辣椒叶片作为阴性对照，每份样品称取 0.1 g。按照 MiniBEST Plant RNA Extraction Kit说明书提取RNA，以 M4-T[5’-GTTTTCCCAGTCACGAC（T）15-3’] 为起始引物[3]，M-MLV 逆转录酶（Toyobo 公司）合成病毒基因组RNA的第一链cDNA，具体方法参照说明书。
1.2.2 外壳蛋白基因序列的克隆与测序。通用引物 Tob Uni1：5′-ATTTAAGTGGAGGGAAAACCACT-3′和 Tob Uni2：5′-GTYGTTGATGAGTTCGTGGA-3′用于扩增烟草花叶病毒属病毒[4]，引物的合成由上海生工生物工程股份有限公司完成。PCR酶采用Premix TaqTM（TaKaRa公司），反应体系和反应条件参照产品说明书。取 PCR 产物 5 μL 在 1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳，然后于凝胶成像仪上观察、拍照。PCR 产物经回收后，送至上海生工生物工程股份有限公司进行克隆测序。
2 结果与分析
2.1 辣椒果实采集与胶体金免疫层析试纸条检测
安徽和县辣椒种植区辣椒果实呈现明显的斑驳症状，其中辣椒呈现青绿色时出现黄色斑块，果实在成熟时不能转变为红色，出现黄色斑块；辣椒植株和叶片症状不明显（图1）。对采集到的辣椒病果进行PMMoV胶体金免疫层析试纸条检测，辣椒病果呈阳性，表明采集到的样品中携带 PMMoV，而健康的辣椒果实中未检测到PMMoV存在。
2.2 RT-PCR 检测结果
琼脂糖凝胶电泳检测结果表明，2份辣椒病果样品RNA经通用引物扩增大小约为750 bp的预期目的片段，经克隆测序后比对，发现为PMMoV的外壳蛋白基因序列，阴性对照的健康辣椒叶片中未出现扩增条带（图2）。
2.3 序列测定与分析
将PCR 产物经回收后进行克隆测序，并将所获得的序列结果提交至 GenBank（登录号为MG437273）。从GenBank中获得PMMoV其他12个分离物全基因组序列，以同属的TMV和番茄花叶病毒（tomato mosaic virus，ToMV）为外群，根据外壳蛋白基因序列，使用DNAstar软件中的MegAlign进行开放阅读框及非编码区序列比对分析，结果表明（表1）PMMoV-AH 与选取的 12 个 PMMoV 分离物核苷酸序列同源性为 94.5%～100.0%；与亚洲分离物同源性均为97.9% 以上； 与中国保定和日本茨城分离物XJ-01同源性达100.0%；而与欧洲的 3 个分离物 PMMoV-Is、PMMoV-I 和 PMMoV-Ia 的同源性相对较低（94.5%～94.9%）；与外群ToMV同源性仅为 67.7%，与 TMV同源性仅为 65.8%。氨基酸序列比对结果显示，PMMoV-AH 与12 个 PMMoV 分离物氨基酸的序列同源性为96.8%～100.0%； 除中国贵州分离物PMMoV-Guizhou外，与其他亚洲分离物同源性均达100.0%；而与欧洲分离物同源性稍低，为96.8%～98.1%；与外群 ToMV 和 TMV 的同源性仅为 73.7%和 71.8%。
2.4 基于外壳蛋白基因序列的进化关系分析
将 PMMoV-AH 外壳蛋白基因序列与已知的12 个 PMMoV 分离物和外群ToMV和TMV的外壳蛋白基因序列构建系统发育进化树（图 3），使用Mega6.0软件[5]进行系统发育树分析，采用邻位相接聚类分析法分别构建系统发育树，用1 000次重复的自展检验评价系统发育树拓扑结构的可靠性。所有PMMoV 分离物形成两大支系群体，来自亚洲（中国、日本、韩国和印度）的分离物聚为 1 个分支，而来自以色列和欧洲（西班牙和意大利 ）的3 个分离物形成另1个分支。
3 讨论与结论
PMMoV自从在新疆被首次报道以来[6]，陆续在陕西、山东、河北、北京、宁夏、贵州、台湾、甘肃、青海、辽宁和湖南等地被发现，其危害面积逐步增加。该研究通过胶体金免疫层析试纸条和RT-PCR检测，确定安徽和县地区辣椒上暴发的病毒为辣椒轻斑驳病毒，这是该病毒在安徽地区的首次报道。通过对PMMoV外壳蛋白基因序列与其他地区的分离物同源性进行比对分析，结果表明PMMoV-AH 与已报道的 12 个其他分离物同源性较高，核苷酸同源性介于94.5%～100.0%，氨基酸同源性介于96.8%～100.0%。构建系统进化树发现， PMMoV-AH与亚洲分离物亲缘关系密切。和县作为安徽省重要的蔬菜生产区，辣椒生产遭受PMMoV危害十分严重，主要表現为辣椒果实变小畸形、果面斑驳，影响果实的外观和品质，造成严重的经济损失。同时，该病毒在辣椒种子、加工辣椒和人类粪便中均可检出，且具有侵染性[7-8]。因此，重视 PMMoV 对辣椒生产的威胁，加强优质辣椒抗性品种的选育，建立高效简便、快捷灵敏的检测和防治方法已十分紧迫。
参考文献
[1]
KAZINCZI G，HORVTH J，GBORJNYI R.Some aspects of pepper virus research[J].Acta phytopathologica et entomologica hungarica，2001，36（3/4）：329-347. [2]MIJATOVIC′ M，IVANOVIC′ M，OBRADOVIC′ A，et al.Potato virus Y （PVY） on pepper in Serbia[J].Acta horticulturae，2002，579：545-549.
[3] CHEN J，CHEN J，ADAMS M J.A universal PCR primer to detect members of the Potyviridae，and its use to examine the taxonomic status of several members of the family[J].Archives of virology，2001，146（4）：757-766.
[4] LETSCHERT B，ADAM G，LESEMANN D E，et al.Detection and differentiation of serologically crossreacting tobamoviruses of economical importance by RT-PCR and RT-PCR-RFLP[J].Journal of virological methods，2002，106（1）：1-10.
[5] TAMURA K，STECHER G，PETERSON D，et al.MEGA6： Molecular evolutionary genetics analysis version 6.0 [J].Molecular biology and evolution，2003，30（12）： 2725-2729.
[6] 向本春，謝浩，崔星明，等.新疆辣椒轻微斑驳病毒的分离鉴定[J].病毒学报，1994，10（3）：240-245.
[7] ZHANG T，BREITBART M，LEE W H，et al.RNA viral community in human feces：Prevalence of plant pathogenic viruses[J].PLoS Biology，2005，4（1）：108-118.
[8] PENG J J，SHI B B，ZHENG H Y，et al.Detection of pepper mild mottle virus in pepper sauce in China[J].Archives of virology，2015，160（8）：2079-2080.
关键词 辣椒轻斑驳病毒；外壳基因；和县
中图分类号 S436.418.1 文献标识码
A 文章编号 0517-6611（2018）32-0082-03
Identification of Pepper Mild Mottle Virus in Hexian，Anhui Province
YAN Dankan1，ZHENG Hongying2，ZHANG Haishan1 et al （1.Institute of Plant Protection and AgroProducts Safety，Anhui Academy of Agricultural Sciences，Heifei，Anhui 230031；2.Institute of Virology and Biotechnology，Zhejiang Academy of Agricultural Sciences，Hangzhou，Zhejiang 310021）
Abstract [Objective]To identify the pepper mild mottle virus in Hexian，Anhui Province.[Method]The PMMoVAH was identified in the sample of diseased fruits of pepper which collected in Hexian by using immunochromatography colloidal gold strip and RTPCR method.The pair of universal primers was used to amplify the coat protein gene sequence of PMMoVAH.[Result]Sequence analysis and phylogenetic analysis showed that PMMoVAH was closely related to 12 PMMoV isolates reported in China and abroad with nucleotide sequence identity between 94.5%-100.0% and amino acid sequence identity between 96.8%-100.0%.Phylogenetic tree showed that PMMoVAH was closely related to Asian isolates but not with other isolates.[Conclusion]Due to the significant losses caused by PMMoV，further research is required to control and prevent the prevailing of the disease caused by PMMoV in Anhui Province.
Key words Pepper mild mottle virus；Coat protein gene；Hexian
基金项目 国家公益性行业（农业）科研专项（201303028）；安徽省农业科学院学科建设项目 （17A1125）；安徽省蔬菜产业技术体系。
作者简介 严丹侃（1986—），男，安徽滁州人，助理研究员，硕士，从事植物病毒与媒介昆虫研究。*通讯作者，章东方，研究员，从事植物病毒与媒介昆虫研究；燕飞，研究员，博士，从事植物病毒学研究。
收稿日期 2017-11-28；修回日期 2018-05-30
辣椒病毒病是辣椒生产中的重要病害，目前已发现近 40种病毒可以侵染辣椒[1-2]，包括烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus，TMV）、 黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus，CMV） 、马铃薯 Y 病毒（potato virus Y，PVY）、蚕豆萎蔫病毒（broad bean wilt virus，BBWV）和辣椒轻斑驳病毒（pepper mild mottle virus，PMMoV）等。安徽省和县是全国著名的蔬菜生产基地，截至2016年底，该县种植蔬菜面积2.87万hm2，年产蔬菜110万t。和县蔬菜生产以秋延辣椒生产闻名，常年种植面积0.67万hm2以上，鲜产红辣椒20多万t，是全国绿色食品原料（辣椒）标准化生产基地，“和县辣椒”品牌获得地理标志商标。近年来，和县辣椒生产上辣椒病毒病危害加重，特别是当地主栽辣椒品种“好农11”发病严重。染病辣椒叶片症状较轻，而果实症状明显，呈现斑驳、凹陷和坏死等病毒病症状，后期辣椒果实外观和内在品质均显著变差，严重影响当地辣椒生产。为明确该病毒病种类，笔者采用血清学和 RT-PCR 等方法对该病毒进行了鉴定，并对其所感染病毒的系统发育关系进行了分析，从而为和县辣椒病毒病防治提供理论基础。 1 材料与方法
1.1 材料 2016年 10 月—2017年4月在安徽省和县温室大棚采集辣椒样本（PMMoV-AH），采集样本为具有明显扭曲或斑驳等症状的辣椒病果，将其保存于-70 ℃冰箱中备用。
供试 PMMoV胶体金免疫层析试纸条购自美国Agdia公司；植物总 RNA 提取试剂盒MiniBEST Plant RNA Extraction Kit购自TaKaRa公司；PCR扩增采用的Premix TaqTM购自TaKaRa公司。
1.2 方法
1.2.1 辣椒果实总RNA提取和cDNA合成。选取 2 份经 DAS-ELISA 检测为阳性的辣椒病叶，提取病叶总 RNA，以2份温室培育的健康辣椒叶片作为阴性对照，每份样品称取 0.1 g。按照 MiniBEST Plant RNA Extraction Kit说明书提取RNA，以 M4-T[5’-GTTTTCCCAGTCACGAC（T）15-3’] 为起始引物[3]，M-MLV 逆转录酶（Toyobo 公司）合成病毒基因组RNA的第一链cDNA，具体方法参照说明书。
1.2.2 外壳蛋白基因序列的克隆与测序。通用引物 Tob Uni1：5′-ATTTAAGTGGAGGGAAAACCACT-3′和 Tob Uni2：5′-GTYGTTGATGAGTTCGTGGA-3′用于扩增烟草花叶病毒属病毒[4]，引物的合成由上海生工生物工程股份有限公司完成。PCR酶采用Premix TaqTM（TaKaRa公司），反应体系和反应条件参照产品说明书。取 PCR 产物 5 μL 在 1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳，然后于凝胶成像仪上观察、拍照。PCR 产物经回收后，送至上海生工生物工程股份有限公司进行克隆测序。
2 结果与分析
2.1 辣椒果实采集与胶体金免疫层析试纸条检测
安徽和县辣椒种植区辣椒果实呈现明显的斑驳症状，其中辣椒呈现青绿色时出现黄色斑块，果实在成熟时不能转变为红色，出现黄色斑块；辣椒植株和叶片症状不明显（图1）。对采集到的辣椒病果进行PMMoV胶体金免疫层析试纸条检测，辣椒病果呈阳性，表明采集到的样品中携带 PMMoV，而健康的辣椒果实中未检测到PMMoV存在。
2.2 RT-PCR 检测结果
琼脂糖凝胶电泳检测结果表明，2份辣椒病果样品RNA经通用引物扩增大小约为750 bp的预期目的片段，经克隆测序后比对，发现为PMMoV的外壳蛋白基因序列，阴性对照的健康辣椒叶片中未出现扩增条带（图2）。
2.3 序列测定与分析
将PCR 产物经回收后进行克隆测序，并将所获得的序列结果提交至 GenBank（登录号为MG437273）。从GenBank中获得PMMoV其他12个分离物全基因组序列，以同属的TMV和番茄花叶病毒（tomato mosaic virus，ToMV）为外群，根据外壳蛋白基因序列，使用DNAstar软件中的MegAlign进行开放阅读框及非编码区序列比对分析，结果表明（表1）PMMoV-AH 与选取的 12 个 PMMoV 分离物核苷酸序列同源性为 94.5%～100.0%；与亚洲分离物同源性均为97.9% 以上； 与中国保定和日本茨城分离物XJ-01同源性达100.0%；而与欧洲的 3 个分离物 PMMoV-Is、PMMoV-I 和 PMMoV-Ia 的同源性相对较低（94.5%～94.9%）；与外群ToMV同源性仅为 67.7%，与 TMV同源性仅为 65.8%。氨基酸序列比对结果显示，PMMoV-AH 与12 个 PMMoV 分离物氨基酸的序列同源性为96.8%～100.0%； 除中国贵州分离物PMMoV-Guizhou外，与其他亚洲分离物同源性均达100.0%；而与欧洲分离物同源性稍低，为96.8%～98.1%；与外群 ToMV 和 TMV 的同源性仅为 73.7%和 71.8%。
2.4 基于外壳蛋白基因序列的进化关系分析
将 PMMoV-AH 外壳蛋白基因序列与已知的12 个 PMMoV 分离物和外群ToMV和TMV的外壳蛋白基因序列构建系统发育进化树（图 3），使用Mega6.0软件[5]进行系统发育树分析，采用邻位相接聚类分析法分别构建系统发育树，用1 000次重复的自展检验评价系统发育树拓扑结构的可靠性。所有PMMoV 分离物形成两大支系群体，来自亚洲（中国、日本、韩国和印度）的分离物聚为 1 个分支，而来自以色列和欧洲（西班牙和意大利 ）的3 个分离物形成另1个分支。
3 讨论与结论
PMMoV自从在新疆被首次报道以来[6]，陆续在陕西、山东、河北、北京、宁夏、贵州、台湾、甘肃、青海、辽宁和湖南等地被发现，其危害面积逐步增加。该研究通过胶体金免疫层析试纸条和RT-PCR检测，确定安徽和县地区辣椒上暴发的病毒为辣椒轻斑驳病毒，这是该病毒在安徽地区的首次报道。通过对PMMoV外壳蛋白基因序列与其他地区的分离物同源性进行比对分析，结果表明PMMoV-AH 与已报道的 12 个其他分离物同源性较高，核苷酸同源性介于94.5%～100.0%，氨基酸同源性介于96.8%～100.0%。构建系统进化树发现， PMMoV-AH与亚洲分离物亲缘关系密切。和县作为安徽省重要的蔬菜生产区，辣椒生产遭受PMMoV危害十分严重，主要表現为辣椒果实变小畸形、果面斑驳，影响果实的外观和品质，造成严重的经济损失。同时，该病毒在辣椒种子、加工辣椒和人类粪便中均可检出，且具有侵染性[7-8]。因此，重视 PMMoV 对辣椒生产的威胁，加强优质辣椒抗性品种的选育，建立高效简便、快捷灵敏的检测和防治方法已十分紧迫。
参考文献
[1]
KAZINCZI G，HORVTH J，GBORJNYI R.Some aspects of pepper virus research[J].Acta phytopathologica et entomologica hungarica，2001，36（3/4）：329-347. [2]MIJATOVIC′ M，IVANOVIC′ M，OBRADOVIC′ A，et al.Potato virus Y （PVY） on pepper in Serbia[J].Acta horticulturae，2002，579：545-549.
[3] CHEN J，CHEN J，ADAMS M J.A universal PCR primer to detect members of the Potyviridae，and its use to examine the taxonomic status of several members of the family[J].Archives of virology，2001，146（4）：757-766.
[4] LETSCHERT B，ADAM G，LESEMANN D E，et al.Detection and differentiation of serologically crossreacting tobamoviruses of economical importance by RT-PCR and RT-PCR-RFLP[J].Journal of virological methods，2002，106（1）：1-10.
[5] TAMURA K，STECHER G，PETERSON D，et al.MEGA6： Molecular evolutionary genetics analysis version 6.0 [J].Molecular biology and evolution，2003，30（12）： 2725-2729.
[6] 向本春，謝浩，崔星明，等.新疆辣椒轻微斑驳病毒的分离鉴定[J].病毒学报，1994，10（3）：240-245.
[7] ZHANG T，BREITBART M，LEE W H，et al.RNA viral community in human feces：Prevalence of plant pathogenic viruses[J].PLoS Biology，2005，4（1）：108-118.
[8] PENG J J，SHI B B，ZHENG H Y，et al.Detection of pepper mild mottle virus in pepper sauce in China[J].Archives of virology，2015，160（8）：2079-2080.