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摘要[目的]建立一种同时测定光枝勾儿茶中芦丁和槲皮素的含量的方法。[方法]采用HPLC法对光枝勾儿茶内的芦丁和槲皮素进行测定，色谱柱为ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.1 %磷酸水溶液，检测波长360 nm，流速1.0 mL/min，柱温25 ℃；进样量10 μL。[结果]芦丁和槲皮素分别在0.109～1.090和0.104～1.040 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。芦丁平均回收率为98.84%，RSD为2.34%；槲皮素平均回收率为99.65%，RSD为2.51%。[结论]该方法简便、准确、精密度高、重复性好，可用于该药材的质量检测。
关键词光枝勾儿茶；芦丁；槲皮素；HPLC法；含量
中图分类号R284文献标识码 A文章编号 0517-6611（2016）13-164-03
目前，市场上治疗猪、牛、羊腹泻的主要药物是抗生素类，抗生素使用后在动物体内存在残留和抗药性问题，食用后影响人体健康。中兽药能有效避免药物残留和抗药性的问题，成为目前研究的热点[1]，如止痢散，其主要成分是光枝勾儿茶[2]。光枝勾儿茶（Berchemia polyphylla Wall.ex.Lawson）是鼠李科勾儿茶属的一个变种，具有清热利湿、止咳等功效[3]，同时可治疗猪、牛、羊的腹泻[4-8]。
中兽药进入市场前需对药物的质量标准进行检测，为此需对止痢散药效进行检测。研究发现，止痢散主要药效源于光之勾儿茶内的黄酮类化合物芦丁和槲皮素[9]，测定芦丁和槲皮素的主要方法有分光光度法和HPLC法[10-11]。检测光枝勾儿茶中芦丁和槲皮素报道较少且一般均分开检测这2种物质[12-13]，忽略了两者在一起的药效作用，对评价光之勾儿茶内芦丁和槲皮素的联合药效不够精确，该研究采用HPLC法同时测定光枝勾儿茶内芦丁和槲皮素的含量，以期为评价光枝勾儿茶药效提供依据。
1材料与方法
1.1仪器Agilent 1263LC色谱仪（美国Agilent公司）；SB2200型超声波清洗机（上海卓越仪器有限公司）；AE200电子天平（中国梅特勒托利多公司）；优普超纯水机（成都优普仪器有限公司）；电热鼓风干燥箱（天津泰斯特仪器公司）；98-1-B型电子调温电热套（天津市泰斯特仪器有限公司）；SHB-循环水式多真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；旋转蒸发器RE-3000（上海亚荣生化仪器厂）。
1.2试料光枝勾儿茶采自贵州省贵阳修文、安顺镇宁、兴义贞丰、安顺关岭、安顺紫云、广西桂林、四川成都、黔东南丹寨、毕节纳雍、铜仁德江等不同地区，每个地区均采集根、藤、叶。芦丁对照品购于中国药品生物制品检定所，批号10080-200707，含量90.5%；槲皮素对照品购于中国生物制品检定所，批号10081-200406，含量97.3%。乙腈为色谱纯；其他试剂为分析纯；水为去离子水。
1.3方法
1.3.1溶液的配置。
1.3.1.1对照品溶液的制备。精密称取真空干燥芦丁对照品10.9 mg，用甲醇使其充分溶解，定容至10 mL，得质量浓度为0.109 mg/mL，备用。精密称取真空干燥槲皮素对照品10.4 mg，用甲醇使其充分溶解，并定容至10 mL，得质量浓度为0.104 mg/mL，备用。
1.3.1.2供试品溶液的制备。准确称取光枝勾儿茶粉末10.00 mg，用100 mL甲醇回流提取3次，每次提取1 h，过滤，合并滤液，滤液挥发干燥，用甲醇定容至100 mL，再用0.45 μm滤膜过滤，滤液作为供试品备用。
1.3.2方法学考察。
1.3.2.1色谱条件及系统适应性试验。色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈-磷酸水溶液，流速1.0 mL/min，柱温28 ℃，进样量10 μL，检测波长360 nm。在选定条件下，芦丁、槲皮素色谱峰与其他杂质峰达到基线分离，分离度（R）>1.5，芦丁、槲皮素踏板数>3 000。
1.3.2.2标准曲线的绘制。
（1）芦丁标准曲线的绘制。精密吸取质量浓度为0.109 mg/mL的芦丁对照品供试液1、2、4、6、8、10 μL进样，按照“1.3.2.1”色谱条件进行测定，以峰面积（Y）为纵坐标、质量浓度（X）为横坐标绘制标准曲线，计算线性回归方程。
（2）槲皮素标准曲线的绘制。精密吸取质量浓度为0104 mg/mL的槲皮素对照品供试液1、2、4、6、8、10 μL进样，按照“1.3.2.1”色谱条件进行测定，以峰面积（Y）为纵坐标、质量浓度（X）为横坐标绘制标准曲线，计算线性回归方程。
1.3.2.3精密度试验。取对照品溶液10 μL，分别连续进样5次，每次10 μL，以峰面积计算精密度，要求RSD<3%。
1.3.2.4重复性试验。精密称取光枝勾儿茶药材6份样品，按“1.3.1.2”方法操作，每份进样5次，每次10 μL，要求芦丁、槲皮素的RSD<3%。
1.3.2.5稳定性试验。取对照品、供试品各1份，室温下分别放置0、2、4、12、24、48 h后，测定峰面积。
1.3.2.6加样回收率试验。根据线性范围设计芦丁和槲皮素含量高、中、低3种水平，精密吸取已测知芦丁和槲皮素含量的光枝勾儿茶药材适量，每个水平3份，再分别按要求精密加入一定量的对照品，按“1.3.1.2”方法操作，用HPLC方法测定，计算回收率。
1.3.3样品中芦丁、槲皮素含量的测定。过0.45 μm滤膜后，按照“1.3.2.1”色谱条件和“1.3.1.2”供试品溶液配制方法测定芦丁和槲皮素的含量。
2结果与分析 2.1方法学考察
2.1.1系统适应性试验。由图1可见，在6.105 min，芦丁对照品出现最大吸收峰，主峰尖锐且无杂峰；槲皮素对照品在19.375 min出现最大吸收峰，主峰尖锐无杂峰。样品中芦丁和槲皮素的最大吸收峰主峰尖锐无杂峰，最大吸收峰出现的时间分别在6.069和19.206 min，与对照品最大吸收峰时间十分接近。
2.1.2标准曲线的绘制。按照“1.3.2.1”方法操作，得到芦丁和槲皮素的回归曲线分别为Y=269.9X+9.689 9（r=0999 5）、Y=818.71X（r=0.999 9），表明芦丁和槲皮素的浓度分别在0.109～1.090、0.104～1.040 μg范围内与峰面积线性关系良好。
2.1.3精密度试验。按照“1.3.2.3”方法操作，得到芦丁和槲皮素RSD分别为0.32%、0.29%（n=5），表明操作过程中仪器精密度良好。
2.1.4重复性试验。按照“1.3.2.4”方法操作，得到芦丁、槲皮素RSD分别为2.48%、2.94%，表明方法具有较好的重复性。
2.1.5稳定性试验。按照“1.3.2.5”方法，得到芦丁和槲皮素的峰面积RSD分别为1.86%、287%，表明样品供试液在48 h内稳定。
2.1.6加样回收率试验。由表1可见，芦丁平均回收率为98.84%，RSD值为2.34%，槲皮素平均回收率为99.65%，RSD值为2.51%，表明加样回收率均符合要求。
2.2样品中芦丁、槲皮素含量的测定分别对采集于我国不同地区的10个光之勾儿茶样品内的芦丁和槲皮素进行同时测定，结果发现（表2），黔东南丹寨的光之勾儿茶内芦丁、槲皮素含量最高。
3讨论与结论
该试验在制备供试品溶液时分别采用50%、95%的乙醇、无水乙醇、甲醇作为溶剂，经过HPLC试验分析，得出甲醇溶解所得的供试品峰形、分离度均好。因此，选取甲醇为提取液。预试验分别采用甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸、乙腈- 水、乙腈-0.1%磷酸为流动相系统，通过出峰数目、峰面积、分离度等的对比，选择最优的流动相为乙腈-0.1%磷酸，在此流动相系统时出峰的数目多，分离效果好，漂移现象弱，峰形好。在预试验过程中分别选用280、354、360 nm，其中芦丁最大吸收波长分别为280、360 nm，槲皮素吸收最大波长分别为254、360 nm，兼顾芦丁、槲皮素检测灵敏度，确定最佳检测波长为360 nm。芦丁和槲皮素在360 nm处有最大的紫外吸收值。
该研究采用HPLC法同时测定光枝勾儿茶内芦丁和槲皮素的含量，结果发现，芦丁和槲皮素分别在0.109～1.090和0.104～1.040 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系；芦丁平均回收率为98.84%，RSD为2.34%；槲皮素平均回收率为99.65%，RSD为2.51%。该方法简便、准确、精密度高、重复性好，可用于该药材的质量检测，为光枝勾儿茶质量标准提供重要的方法依据。
参考文献
[1]滕红丽，陈科力，陈士林.壮药铁包金及其药材商品的物种基础[J].中药材，2010（5）：675-677.
[2] 广西药用植物园.广西药用植物园药用植物名录[Z].2006：139-141.
[3] 湖北省中药资源普查办公室.中药资源名录[M].北京：科学出版社，1990：212.
[4] 陈德明.消炎止痢散[J].河南农业科学，1976（3）：37.
[5] 措毛加.特效止痢散在仔猪腹泻预防中的应用[J].中国畜牧兽医文摘，2015（1）：204.
[6] 路卫星.中药止痢散防治仔猪腹泻病的试验[J].黑龙江畜牧兽医，2015（6）：111-112.
[7] 孟庆大.药典方剂止痢散的药效与毒理学研究[D].长春：吉林大学，2010.
[8] 杨娟，潘琪，魏东法，等.光枝勾儿茶化学成分研究（II）[J].中国药学杂志，2006（4）：255-257.
[9] 杨娟，段文峰，彭英，等.光枝勾儿茶化学成分研究（Ⅰ）[J].中草药，2006（6）：836-837.
[10] 吴玉强，邓家刚，钟正，等.铁包金提取物镇痛作用的研究[J].时珍国医国药，2008，19（4）：854-855.
[11] 金越，吕勇，韩国柱，等.槲皮素及异槲皮素、芦丁抗自由基活性的比较研究[J].中草药，2007（3）：408-4011.
[12] 尚永辉，李华，孙家娟，等.偏最小二乘-分光光度法同时测定芦丁与槲皮素的方法研究[J].分析测试学报，2011（4）：457-460.
[13] 滕红丽，郭力城，李鑫.光枝勾儿茶高效液相色谱指纹图谱研究[J].时珍国医国药，2011（5）：1233-1235.
关键词光枝勾儿茶；芦丁；槲皮素；HPLC法；含量
中图分类号R284文献标识码 A文章编号 0517-6611（2016）13-164-03
目前，市场上治疗猪、牛、羊腹泻的主要药物是抗生素类，抗生素使用后在动物体内存在残留和抗药性问题，食用后影响人体健康。中兽药能有效避免药物残留和抗药性的问题，成为目前研究的热点[1]，如止痢散，其主要成分是光枝勾儿茶[2]。光枝勾儿茶（Berchemia polyphylla Wall.ex.Lawson）是鼠李科勾儿茶属的一个变种，具有清热利湿、止咳等功效[3]，同时可治疗猪、牛、羊的腹泻[4-8]。
中兽药进入市场前需对药物的质量标准进行检测，为此需对止痢散药效进行检测。研究发现，止痢散主要药效源于光之勾儿茶内的黄酮类化合物芦丁和槲皮素[9]，测定芦丁和槲皮素的主要方法有分光光度法和HPLC法[10-11]。检测光枝勾儿茶中芦丁和槲皮素报道较少且一般均分开检测这2种物质[12-13]，忽略了两者在一起的药效作用，对评价光之勾儿茶内芦丁和槲皮素的联合药效不够精确，该研究采用HPLC法同时测定光枝勾儿茶内芦丁和槲皮素的含量，以期为评价光枝勾儿茶药效提供依据。
1材料与方法
1.1仪器Agilent 1263LC色谱仪（美国Agilent公司）；SB2200型超声波清洗机（上海卓越仪器有限公司）；AE200电子天平（中国梅特勒托利多公司）；优普超纯水机（成都优普仪器有限公司）；电热鼓风干燥箱（天津泰斯特仪器公司）；98-1-B型电子调温电热套（天津市泰斯特仪器有限公司）；SHB-循环水式多真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；旋转蒸发器RE-3000（上海亚荣生化仪器厂）。
1.2试料光枝勾儿茶采自贵州省贵阳修文、安顺镇宁、兴义贞丰、安顺关岭、安顺紫云、广西桂林、四川成都、黔东南丹寨、毕节纳雍、铜仁德江等不同地区，每个地区均采集根、藤、叶。芦丁对照品购于中国药品生物制品检定所，批号10080-200707，含量90.5%；槲皮素对照品购于中国生物制品检定所，批号10081-200406，含量97.3%。乙腈为色谱纯；其他试剂为分析纯；水为去离子水。
1.3方法
1.3.1溶液的配置。
1.3.1.1对照品溶液的制备。精密称取真空干燥芦丁对照品10.9 mg，用甲醇使其充分溶解，定容至10 mL，得质量浓度为0.109 mg/mL，备用。精密称取真空干燥槲皮素对照品10.4 mg，用甲醇使其充分溶解，并定容至10 mL，得质量浓度为0.104 mg/mL，备用。
1.3.1.2供试品溶液的制备。准确称取光枝勾儿茶粉末10.00 mg，用100 mL甲醇回流提取3次，每次提取1 h，过滤，合并滤液，滤液挥发干燥，用甲醇定容至100 mL，再用0.45 μm滤膜过滤，滤液作为供试品备用。
1.3.2方法学考察。
1.3.2.1色谱条件及系统适应性试验。色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈-磷酸水溶液，流速1.0 mL/min，柱温28 ℃，进样量10 μL，检测波长360 nm。在选定条件下，芦丁、槲皮素色谱峰与其他杂质峰达到基线分离，分离度（R）>1.5，芦丁、槲皮素踏板数>3 000。
1.3.2.2标准曲线的绘制。
（1）芦丁标准曲线的绘制。精密吸取质量浓度为0.109 mg/mL的芦丁对照品供试液1、2、4、6、8、10 μL进样，按照“1.3.2.1”色谱条件进行测定，以峰面积（Y）为纵坐标、质量浓度（X）为横坐标绘制标准曲线，计算线性回归方程。
（2）槲皮素标准曲线的绘制。精密吸取质量浓度为0104 mg/mL的槲皮素对照品供试液1、2、4、6、8、10 μL进样，按照“1.3.2.1”色谱条件进行测定，以峰面积（Y）为纵坐标、质量浓度（X）为横坐标绘制标准曲线，计算线性回归方程。
1.3.2.3精密度试验。取对照品溶液10 μL，分别连续进样5次，每次10 μL，以峰面积计算精密度，要求RSD<3%。
1.3.2.4重复性试验。精密称取光枝勾儿茶药材6份样品，按“1.3.1.2”方法操作，每份进样5次，每次10 μL，要求芦丁、槲皮素的RSD<3%。
1.3.2.5稳定性试验。取对照品、供试品各1份，室温下分别放置0、2、4、12、24、48 h后，测定峰面积。
1.3.2.6加样回收率试验。根据线性范围设计芦丁和槲皮素含量高、中、低3种水平，精密吸取已测知芦丁和槲皮素含量的光枝勾儿茶药材适量，每个水平3份，再分别按要求精密加入一定量的对照品，按“1.3.1.2”方法操作，用HPLC方法测定，计算回收率。
1.3.3样品中芦丁、槲皮素含量的测定。过0.45 μm滤膜后，按照“1.3.2.1”色谱条件和“1.3.1.2”供试品溶液配制方法测定芦丁和槲皮素的含量。
2结果与分析 2.1方法学考察
2.1.1系统适应性试验。由图1可见，在6.105 min，芦丁对照品出现最大吸收峰，主峰尖锐且无杂峰；槲皮素对照品在19.375 min出现最大吸收峰，主峰尖锐无杂峰。样品中芦丁和槲皮素的最大吸收峰主峰尖锐无杂峰，最大吸收峰出现的时间分别在6.069和19.206 min，与对照品最大吸收峰时间十分接近。
2.1.2标准曲线的绘制。按照“1.3.2.1”方法操作，得到芦丁和槲皮素的回归曲线分别为Y=269.9X+9.689 9（r=0999 5）、Y=818.71X（r=0.999 9），表明芦丁和槲皮素的浓度分别在0.109～1.090、0.104～1.040 μg范围内与峰面积线性关系良好。
2.1.3精密度试验。按照“1.3.2.3”方法操作，得到芦丁和槲皮素RSD分别为0.32%、0.29%（n=5），表明操作过程中仪器精密度良好。
2.1.4重复性试验。按照“1.3.2.4”方法操作，得到芦丁、槲皮素RSD分别为2.48%、2.94%，表明方法具有较好的重复性。
2.1.5稳定性试验。按照“1.3.2.5”方法，得到芦丁和槲皮素的峰面积RSD分别为1.86%、287%，表明样品供试液在48 h内稳定。
2.1.6加样回收率试验。由表1可见，芦丁平均回收率为98.84%，RSD值为2.34%，槲皮素平均回收率为99.65%，RSD值为2.51%，表明加样回收率均符合要求。
2.2样品中芦丁、槲皮素含量的测定分别对采集于我国不同地区的10个光之勾儿茶样品内的芦丁和槲皮素进行同时测定，结果发现（表2），黔东南丹寨的光之勾儿茶内芦丁、槲皮素含量最高。
3讨论与结论
该试验在制备供试品溶液时分别采用50%、95%的乙醇、无水乙醇、甲醇作为溶剂，经过HPLC试验分析，得出甲醇溶解所得的供试品峰形、分离度均好。因此，选取甲醇为提取液。预试验分别采用甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸、乙腈- 水、乙腈-0.1%磷酸为流动相系统，通过出峰数目、峰面积、分离度等的对比，选择最优的流动相为乙腈-0.1%磷酸，在此流动相系统时出峰的数目多，分离效果好，漂移现象弱，峰形好。在预试验过程中分别选用280、354、360 nm，其中芦丁最大吸收波长分别为280、360 nm，槲皮素吸收最大波长分别为254、360 nm，兼顾芦丁、槲皮素检测灵敏度，确定最佳检测波长为360 nm。芦丁和槲皮素在360 nm处有最大的紫外吸收值。
该研究采用HPLC法同时测定光枝勾儿茶内芦丁和槲皮素的含量，结果发现，芦丁和槲皮素分别在0.109～1.090和0.104～1.040 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系；芦丁平均回收率为98.84%，RSD为2.34%；槲皮素平均回收率为99.65%，RSD为2.51%。该方法简便、准确、精密度高、重复性好，可用于该药材的质量检测，为光枝勾儿茶质量标准提供重要的方法依据。
参考文献
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[5] 措毛加.特效止痢散在仔猪腹泻预防中的应用[J].中国畜牧兽医文摘，2015（1）：204.
[6] 路卫星.中药止痢散防治仔猪腹泻病的试验[J].黑龙江畜牧兽医，2015（6）：111-112.
[7] 孟庆大.药典方剂止痢散的药效与毒理学研究[D].长春：吉林大学，2010.
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