论文部分内容阅读
急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一种恶性的血液系统肿瘤,其特征在于血液和骨髓中不成熟细胞的异常积累。AML中的恶性细胞已经部分或完全的失去了成熟的能力,并且经常表现出染色体、细胞信号传递和细胞周期控制等方面的异常。目前虽然在AML的预后方面,部分研究取得了一些进展,但是AML患者治疗后复发的比率仍然很高,整体存活率较低。而且对于大多数缺乏典型细胞遗传学或分子标志变化的AML患者来说,很难精确评估其生存和预后情况。因此,在分子生物学和细胞生物学水平上研究AML的发病机制,找到更多有价值的生物标记和潜在治疗靶点,对于提高AML的治疗效果具有重要的意义。据报道,miRNA的异常表达跟AML的发生发展有关。miRNA是一种小的非编码单链RNA分子,它在转录水平上通过结合靶基因的mRNA来调控其表达。越来越多的证据证明miRNA在肿瘤发生的多个过程中发挥关键作用,包括细胞增殖、凋亡、分化、侵袭以及肿瘤血管生成等。最近的研究表明,miR-139-5p的异常表达与肿瘤发生和发展有关,包括胃癌、乳腺癌、结直肠癌、肝癌和胶质母细胞瘤等。然而,关于miR-139-5p在AML中的具体作用及机制尚未知晓。四跨膜蛋白3(tetraspanin-3,Tspan3)属于Tetraspanins家族成员。Tetraspanins是一个庞大的膜蛋白家族,有四个跨膜螺旋体,其中包括两个胞外环和两个胞内环。Tetraspanins在多种细胞和组织中表达,与多种细胞过程相关,如细胞粘附、信号转导、细胞增殖迁移融合以及免疫反应的调控等。有研究表明Tspan3是侵袭性白血病的重要调节者,是RNA结合蛋白Musashi2(Msi2)的靶点,而Msi2是白血病生长的关键调节点,说明Tspan3在AML的发生发展中发挥着重要的作用。本研究主要探讨miR-139-5p靶向Tspan3在AML中的作用及机制。首先检测了miR-139-5p和Tspan3在AML患者和正常人骨髓单个核细胞(bone marrow mononuclear cell,BMMC)中的表达,并对二者在AML患者的骨髓单个核细胞中的表达情况进行了相关性分析,又利用在线生物信息学软件DINAN、miRDB、TargetScan等对miR-139-5p的靶基因进行了预测。构建了miR-139-5p过表达和Tspan3过表达两种慢病毒载体,用LV-miR-139-5p和LV-Tspan3两种慢病毒感染HL-60细胞和OCI-AML3细胞,构建miR-139-5p过表达和miR-139-5p和Tspan3共表达的稳定细胞系,用双荧光素酶报告基因实验验证了miR-139-5p和Tspan3的靶向关系,并检测了miR-139-5p靶向Tspan3对AML细胞增殖、凋亡、周期、侵袭、迁移以及PI3K/AKT信号通路的影响。最后,构建AML移植瘤小鼠模型,进一步检测了miR-139-5p靶向Tspan3在动物体内对AML移植瘤生长的影响。本实验旨在研究miR-139-5p靶向Tspan3在AML中的作用及机制,尝试为靶向治疗AML提供新的靶点以及安全有效的新疗法。本研究主要分为三部分:第一部分:miR-139-5p和Tspan3在AML中的表达及意义;第二部分:miR-139-5p靶向Tspan3对AML细胞生物功能的影响及分子机制;第三部分:miR-139-5p靶向Tspan3对AML移植瘤生长的影响及分子机制。主要内容:第一部分:miR-139-5p和Tspan3在AML中的表达及意义方法1.qRT-PCR检测miR-139-5p和Tspan3在AML患者和正常人骨髓单个核细胞中的表达情况。2.利用Graphpad对miR-139-5p和Tspan3的表达水平进行相关性分析。3.利用在线生物信息学软件DINAN,miRDB和TargetScan等预测miR-139-5p的靶基因。结果1.与正常人骨髓单个核细胞相比,miR-139-5p在AML患者骨髓单个核细胞中的表达水平明显降低,而Tspan3的表达水平明显升高。2.在AML患者的骨髓单个核细胞中miR-139-5p和Tspan3的表达水平呈现负相关。3.多个生物信息学软件均预测Tspan3是miR-139-5p的靶基因。第二部分:miR-139-5p靶向Tspan3对AML细胞生物功能的影响及分子机制方法1.构建Lent-miR-139-5p和Lent-Tspan3慢病毒载体。对Lent-miR-139-5p和Lent-Tspan3慢病毒载体进行病毒包装和滴定。用LV-miR-139-5p慢病毒感染HL-60、OCI-AML3细胞,经嘌呤霉素筛选得到HL-60-miR-139-5p和OCI-AML3-miR-139-5p稳定细胞系。又用LV-Tspan3慢病毒感染HL-60-miR-139-5p和OCI-AML3-miR-139-5p稳定细胞系,获得HL-60-miR-139-5p+Tspan3和OCI-AML3-miR-139-5p+Tspan3稳定细胞系。2.双荧光素酶报告基因实验验证miR-139-5p和Tspan3的靶向关系。3.CCK-8检测miR-139-5p靶向Tspan3对HL-60、OCI-AML3细胞增殖的影响。4.流式细胞术检测miR-139-5p靶向Tspan3对HL-60、OCI-AML3细胞周期和凋亡的影响。5.Transwell实验检测miR-139-5p靶向Tspan3对HL-60、OCI-AML3细胞侵袭和迁移能力的影响。6.Western blot检测miR-139-5p靶向Tspan3对PI3K/AKT信号通路的影响。结果1.Lent-miR-139-5p和Lent-Tspan3两种慢病毒载体单克隆PCR以及基因测序结果与NCBI上一致,说明两种慢病毒载体构建成功。经测定LV-miR-139-5p和LV-Tspan3病毒滴定值为2×10~8 TU/mL。2.双荧光素酶报告基因实验验证Tspan3是miR-139-5p的靶基因。3.在白血病细胞HL-60和OCI-AML3中,miR-139-5p过表达可以靶向抑制Tspan3的表达,进而抑制PI3K/AKT信号通路的活性,从而抑制细胞增殖、迁移、侵袭,降低S期细胞比例,阻滞细胞于G2/M期,并促进细胞凋亡。第三部分:miR-139-5p靶向Tspan3对AML移植瘤生长的影响及分子机制方法1.构建HL-60、HL-60-miR-139-5p、HL-60-miR-139-5p+Tspan3 3组AML移植瘤小鼠模型,并检测移植瘤的体积和重量。2.免疫组化检测AML移植瘤中Ki67的表达水平。3.qRT-PCR检测miR-139-5p和Tspan3在AML移植瘤中的表达水平。4.Western blot检测AML移植瘤中Tspan3蛋白以及PI3K/AKT信号通路相关蛋白Akt、p-Akt的表达情况。结果1.成功构建HL-60、HL-60-miR-139-5p、HL-60-miR-139-5p+Tspan3 3组AML荷瘤小鼠模型。2.对移植瘤的体积和质量检测发现,miR-139-5p过表达可以明显抑制AML移植瘤的生长,而Tspan3过表达后又恢复AML移植瘤的生长。3.免疫组化检测结果显示,与HL-60组相比,HL-60-miR-139-5p组移植瘤组织中增殖相关蛋白Ki67表达显著减少,而Tspan3过表达逆转了该抑制效应。4.qRT-PCR和Western blot检测发现,AML移植瘤肿瘤组织中,miR-139-5p过表达明显抑制Tspan3的表达。5.Western blot检测发现,与HL-60组相比,miR-139-5p过表达能够抑制移植瘤组织中p-Akt的表达,而Tspan3过表达逆转了该抑制效应。结论1.与正常人骨髓单个核细胞相比,在AML患者骨髓单个核细胞中miR-139-5p的表达水平明显降低,而Tspan3的表达水平明显升高,且二者的表达水平呈负相关。多个生物信息学软件均预测Tspan3是miR-139-5p的靶基因。2.双荧光素酶报告基因实验验证Tspan3是miR-139-5p的靶基因。在白血病细胞HL-60和OCI-AML3中,miR-139-5p通过靶向抑制Tspan3的表达,进而抑制PI3K/AKT信号通路的活性,从而抑制其细胞增殖、迁移、侵袭,降低S期细胞比例,阻滞细胞于G2/M期,并促进细胞凋亡。3.体内实验进一步表明miR-139-5p过表达能够抑制Tspan3的表达,进而抑制PI3K/AKT信号通路的活性,抑制AML移植瘤的生长。