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摘要 对贝母中的活性成分、贝母内生真菌的多样性以及产物、贝母内生真菌发酵条件等方面的研究进展进行了综述，贝母中主要的活性成分为生物碱，其内生真菌种类具有多样性，其中可筛选出可以产生活性生物碱的菌株，这些菌株的筛选、鉴定、发酵条件探索及代谢产物的分离提纯是研究热点。
关键词 贝母；内生真菌；活性成分；多样性；发酵条件
中图分类号 S567.23+9 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2016）28-0141-01
Abstract The research advances of active ingredients in Fritilaria anhuiensis， diversity of endophytic fungus and products，fermentation conditions were reviewed.The main active constituent of Fritilaria anhuiensis was alkaloid.The endophytic fungi species of Fritilaria anhuiensi was various，and some fungal strains of them could generate active alkaloid.The selection and identification of the fungal strains generating active alkaloid，the exploration of fermentation conditions and the separation and purification of metabolite were research hotspots.
Key words Fritilaria anhuiensis； Endophytic fungus； Active ingredient； Diversity； Fermentation conditions
贝母（Fritilaria anhuiensis）为多年生草本植物，鳞茎可以作为药用，具有止咳化痰、清热散结等功效。按照贝母不同产地和种类可以划分为川贝母（Fritillaria praewalskii maxim ex Batal）、浙贝母（Fritillaria thunbergii）、平贝母（Fritillaria ussuriensis Maxim）和皖贝母（Fritillaria anhuiensis S.C.Chen et S.P.Yin）等。川贝母味苦、甘，性寒，归肺、心经，具有化痰止咳、清热散结、润肺养肺的功效[1]。浙贝味苦而性寒，入心肺经，能缓解支气管平滑肌痉挛，具有清热化痰、散结解毒、降低血压、兴奋子宫等多种药理作用[2]。皖贝母为百合科贝母属药用植物，以鳞茎入药，具有清热、化痰、止咳镇喘等功效[3]。
贝母内生真菌具有丰富的多样性，贝母内生真菌的变化会影响贝母的外形、品质以及生长状态，贝母内生真菌中的色素及活性物质具有较高的开发利用价值，所以贝母内生真菌筛选与鉴定具有重要的意义。该研究对贝母中的活性成分、贝母内生真菌的多样性以及产物、贝母内生真菌发酵条件等方面的研究进展进行了综述。
1 贝母中的活性成分
贝母中含有多种生物碱成分，如贝母甲素、贝母乙素、西贝碱等[4]。刘汉珍等[5]采用高效液相色谱法测得皖贝母中贝母甲素和贝母乙素含量分别达0.203～0.251和0.472～0.508 mg/mL。刘震东等[6]采用HPLC与通用型蒸发光散射检测器ELSD联用测定3年生瓦布贝母中西贝碱含量为9.0 μg/g。李清华等[7-8]从皖贝母中分离出浙贝乙素、贝母辛、异浙贝甲素和皖贝甲素4种生物碱，以及β-谷甾醇、胡萝卜甙等萜类物质。王曙等[9]在川贝母中测定出含量较高的皂苷，并结合川贝母较强的止咳化痰功效，认为皂苷为川贝母中重要的活性成分。
2 贝母内生真菌的多样性
严铸云等[10]采用纯培养法对不同生长期的川贝母内生真菌鳞茎中的内生真菌进行分离和鉴定，分离得到一年生（一棵针）内生真菌10株，鉴定为8个属； 一年生（一匹叶）内生真菌8株，鉴定为7个属； 二年生内生真菌13株，鉴定为9个属； 三年生内生真菌48株，鉴定为14个属；四年生内生真菌11株，鉴定为7个属。分离的结果表明内生菌种类多样，且每个时期的生长种类均不尽相同；其中指轮枝孢属存在于每一个生长期，表明内生真菌对植物也有专一性；随生长时间的增长，内生真菌的数量也在增多，到三年生时期，内生真菌的数目达到高峰，四年生时期时，内生真菌数目减少，说明内生真菌在这5个时期为一个生理期，四年生时期完成了整个生长过程，所以内生真菌数量减少，又回到了一年生的一颗针时期。陈鹊[1]探索甘肃贝母内生真菌的应用价值，分离得到13株内生真菌，其中镰刀菌属接骨木镰刀菌菌株G6 能产生多种生物碱物质。杨宇等[11]从皖贝母中分离出被孢霉科被孢霉属的被孢霉和曲霉科青霉属的微紫青霉2种真菌。
3 贝母内生真菌的产物
3.1 色素
以苯胺类为主的合成色素会在人体内形成致癌物，而天然红色素资源缺乏，国内经常使用的2种有争议的食品合成色素苋菜红和胭脂红至今未能完全被替代。因此利用微生物生产色素，不受资源、环境和空间的限制，并可通过微生物大规模的发酵培养生产色素，既可降低生产成本，提高经济效益，又可避免因原料紧缺造成的环境破坏，保护生态环境。张辉东等[12]以一株川贝母暗紫贝母的内生真菌为出发菌，经超声波提取得到一种天然红色素，并对该色素稳定性进行了研究，发现在碱性溶液中比在酸性溶液中稳定性好。
3.2 生物碱
高俊杰等[13]利用高效发酵体系对Aspergillus sp.BJ7进行发酵，发现地下鳞茎中分离的BJ7 具有较高的抑菌活性，发酵9 d时BJ7的抑菌效果最好；发酵液分离浓缩后仅在正丁醇层出现抑菌效果，且当温度>50 ℃时浓缩液失去抑菌活性，其抑菌活性物质极性较大且热不稳定，具有产生生物碱的能力。陈鹊[1]从川贝母中分离的菌株A14及菌株G6产生的生物碱成分可以抑制粪肠球菌的生长，其抑菌圈平均直径分别为11.60、10.90 mm，效果中等；菌株C4代谢的生物碱成分对白色念珠菌有明显的抑制作用，抑菌圈平均直径为18.30 mm。叶波平等[14]研究浙贝母的新鲜鳞茎贝母内生真菌Nectria sp.NO6及其活性代谢产物发现，发酵液对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、藤黄八叠球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、克雷伯氏肺炎杆菌、白色念珠菌和黑曲霉细菌的生长以及人结肠癌细胞株、人宫颈癌细胞株等肿瘤细胞株的增殖具有明显的抑制作用，并在pH为5～6时抑菌活性最高。 3.3 甾醇类化合物
陈鹊[1]通过1H-NMR和13C-NMR谱数据及MS特征峰从暗紫贝母内生真菌次生代谢产物中检测出3种甾醇类化合物。
4 贝母内生真菌发酵条件的探索
殷红等[15]通过优化从平贝母鳞茎中分离出的内生真菌菌株Fu7的培养条件，发现在豆芽汁基本培养基中添加6%葡萄糖和0.05%尿素，初始pH 6.0时，最适于其菌丝生长；而添加0.10～0.15 g/L尿素、6%～7%葡萄糖，pH 6.0～6.5则有利于西贝素的积累；在相应的优化条件下，菌丝干重和西贝素含量分别比在基本培养基中提高约155%和77%。
5 结语
贝母主要的活性成分为生物碱，某些贝母内生真菌或其次生代谢产物中含有具有相应活性的生物碱。筛选和培养能够产生活性生物碱的内生真菌可以有效解决贝母药用资源相对不足、培育困难等问题。目前，贝母中产活性生物碱内生真菌的筛选与鉴定研究已相对成熟，但发酵条件的探索方面研究尚少，菌种退化是影响内生真菌目的产物产量稳定的技术瓶颈，常规复壮手段效果并不理想，探索出合适的菌种保存或复壮方法是亟待解决的问题。
参考文献
[1]陈鹊.川贝母内生真菌及其次生代谢产物的研究[D].雅安：四川农业大学，2012.
[2]张明发，沈雅琴.浙贝母药理研究进展[J].上海医药，2007，28（10）：459-461.
[3]李同根，王康才，罗庆云，等.Ca2+对皖贝母高温胁迫下抗逆生理指标及光合作用的影响[J].植物营养与肥料学报，2012，18（3）：765-770.
[4]陈德昌，王宝琹.中药对照品化学工作手册[M].北京： 中国医药科技出版社，2000.
[5]刘汉珍，戴云志.HPLC法同时测定皖贝母两种生物碱成分含量[J].中国林副特产，2006，12（6）：18-20.
[6]刘震东，王曙.HPLC-ELSD测定栽培的瓦布贝母中西贝碱[J].华西药学杂志，2005，20（3）：257-258.
[7]李清华，吴宗好.安徽贝母生物碱的分离和结构鉴定[J].药学学报，1986，21（10）：767-771.
[8]李清华，张连龙.安徽贝母二萜成分的研究[J].中国中药杂志，1990，15（3）：42-43.
[9]王曙，徐小平.川贝母与其他贝母类药材总生物碱和总皂苷的含量测定与比较[J].中国中药杂志，2002，27（5）：342-344.
[10]严铸云，张琦.不同生长期川贝母内生真菌的多样性[J].华西药学杂志，2008，23（5）：521-523.
[11]杨宇，汪学军，韦传宝，等.皖贝母内生真菌的初步研究[J].皖西学院学报，2011，27（5）：8-10.
[12]张辉东，曾雪丽.暗紫贝母内生真菌红色素的提取及稳定性研究[J].湖北农业科学，2011，50（18）：3815-3818.
[13]高俊杰，袁小凤.浙贝母内生真菌的分离筛选及抑菌活性菌株Aspergillus sp.BJ7性质的初步研究[J].中国中医药科技，2012，19（2）：140-142.
[14]叶波平，张少华.贝母内生真菌Nectria sp.NO6及其活性代谢产物的研究[C]//2008年中国微生物学会学术年会论文摘要集.海口：海南省微生物学会，2008.
[15]殷红，陈娟丽.贝母内生真菌产西贝素发酵条件的研究[J].西北大学学报（自然科学版），2011，41（2）：261-264.
关键词 贝母；内生真菌；活性成分；多样性；发酵条件
中图分类号 S567.23+9 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2016）28-0141-01
Abstract The research advances of active ingredients in Fritilaria anhuiensis， diversity of endophytic fungus and products，fermentation conditions were reviewed.The main active constituent of Fritilaria anhuiensis was alkaloid.The endophytic fungi species of Fritilaria anhuiensi was various，and some fungal strains of them could generate active alkaloid.The selection and identification of the fungal strains generating active alkaloid，the exploration of fermentation conditions and the separation and purification of metabolite were research hotspots.
Key words Fritilaria anhuiensis； Endophytic fungus； Active ingredient； Diversity； Fermentation conditions
贝母（Fritilaria anhuiensis）为多年生草本植物，鳞茎可以作为药用，具有止咳化痰、清热散结等功效。按照贝母不同产地和种类可以划分为川贝母（Fritillaria praewalskii maxim ex Batal）、浙贝母（Fritillaria thunbergii）、平贝母（Fritillaria ussuriensis Maxim）和皖贝母（Fritillaria anhuiensis S.C.Chen et S.P.Yin）等。川贝母味苦、甘，性寒，归肺、心经，具有化痰止咳、清热散结、润肺养肺的功效[1]。浙贝味苦而性寒，入心肺经，能缓解支气管平滑肌痉挛，具有清热化痰、散结解毒、降低血压、兴奋子宫等多种药理作用[2]。皖贝母为百合科贝母属药用植物，以鳞茎入药，具有清热、化痰、止咳镇喘等功效[3]。
贝母内生真菌具有丰富的多样性，贝母内生真菌的变化会影响贝母的外形、品质以及生长状态，贝母内生真菌中的色素及活性物质具有较高的开发利用价值，所以贝母内生真菌筛选与鉴定具有重要的意义。该研究对贝母中的活性成分、贝母内生真菌的多样性以及产物、贝母内生真菌发酵条件等方面的研究进展进行了综述。
1 贝母中的活性成分
贝母中含有多种生物碱成分，如贝母甲素、贝母乙素、西贝碱等[4]。刘汉珍等[5]采用高效液相色谱法测得皖贝母中贝母甲素和贝母乙素含量分别达0.203～0.251和0.472～0.508 mg/mL。刘震东等[6]采用HPLC与通用型蒸发光散射检测器ELSD联用测定3年生瓦布贝母中西贝碱含量为9.0 μg/g。李清华等[7-8]从皖贝母中分离出浙贝乙素、贝母辛、异浙贝甲素和皖贝甲素4种生物碱，以及β-谷甾醇、胡萝卜甙等萜类物质。王曙等[9]在川贝母中测定出含量较高的皂苷，并结合川贝母较强的止咳化痰功效，认为皂苷为川贝母中重要的活性成分。
2 贝母内生真菌的多样性
严铸云等[10]采用纯培养法对不同生长期的川贝母内生真菌鳞茎中的内生真菌进行分离和鉴定，分离得到一年生（一棵针）内生真菌10株，鉴定为8个属； 一年生（一匹叶）内生真菌8株，鉴定为7个属； 二年生内生真菌13株，鉴定为9个属； 三年生内生真菌48株，鉴定为14个属；四年生内生真菌11株，鉴定为7个属。分离的结果表明内生菌种类多样，且每个时期的生长种类均不尽相同；其中指轮枝孢属存在于每一个生长期，表明内生真菌对植物也有专一性；随生长时间的增长，内生真菌的数量也在增多，到三年生时期，内生真菌的数目达到高峰，四年生时期时，内生真菌数目减少，说明内生真菌在这5个时期为一个生理期，四年生时期完成了整个生长过程，所以内生真菌数量减少，又回到了一年生的一颗针时期。陈鹊[1]探索甘肃贝母内生真菌的应用价值，分离得到13株内生真菌，其中镰刀菌属接骨木镰刀菌菌株G6 能产生多种生物碱物质。杨宇等[11]从皖贝母中分离出被孢霉科被孢霉属的被孢霉和曲霉科青霉属的微紫青霉2种真菌。
3 贝母内生真菌的产物
3.1 色素
以苯胺类为主的合成色素会在人体内形成致癌物，而天然红色素资源缺乏，国内经常使用的2种有争议的食品合成色素苋菜红和胭脂红至今未能完全被替代。因此利用微生物生产色素，不受资源、环境和空间的限制，并可通过微生物大规模的发酵培养生产色素，既可降低生产成本，提高经济效益，又可避免因原料紧缺造成的环境破坏，保护生态环境。张辉东等[12]以一株川贝母暗紫贝母的内生真菌为出发菌，经超声波提取得到一种天然红色素，并对该色素稳定性进行了研究，发现在碱性溶液中比在酸性溶液中稳定性好。
3.2 生物碱
高俊杰等[13]利用高效发酵体系对Aspergillus sp.BJ7进行发酵，发现地下鳞茎中分离的BJ7 具有较高的抑菌活性，发酵9 d时BJ7的抑菌效果最好；发酵液分离浓缩后仅在正丁醇层出现抑菌效果，且当温度>50 ℃时浓缩液失去抑菌活性，其抑菌活性物质极性较大且热不稳定，具有产生生物碱的能力。陈鹊[1]从川贝母中分离的菌株A14及菌株G6产生的生物碱成分可以抑制粪肠球菌的生长，其抑菌圈平均直径分别为11.60、10.90 mm，效果中等；菌株C4代谢的生物碱成分对白色念珠菌有明显的抑制作用，抑菌圈平均直径为18.30 mm。叶波平等[14]研究浙贝母的新鲜鳞茎贝母内生真菌Nectria sp.NO6及其活性代谢产物发现，发酵液对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、藤黄八叠球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、克雷伯氏肺炎杆菌、白色念珠菌和黑曲霉细菌的生长以及人结肠癌细胞株、人宫颈癌细胞株等肿瘤细胞株的增殖具有明显的抑制作用，并在pH为5～6时抑菌活性最高。 3.3 甾醇类化合物
陈鹊[1]通过1H-NMR和13C-NMR谱数据及MS特征峰从暗紫贝母内生真菌次生代谢产物中检测出3种甾醇类化合物。
4 贝母内生真菌发酵条件的探索
殷红等[15]通过优化从平贝母鳞茎中分离出的内生真菌菌株Fu7的培养条件，发现在豆芽汁基本培养基中添加6%葡萄糖和0.05%尿素，初始pH 6.0时，最适于其菌丝生长；而添加0.10～0.15 g/L尿素、6%～7%葡萄糖，pH 6.0～6.5则有利于西贝素的积累；在相应的优化条件下，菌丝干重和西贝素含量分别比在基本培养基中提高约155%和77%。
5 结语
贝母主要的活性成分为生物碱，某些贝母内生真菌或其次生代谢产物中含有具有相应活性的生物碱。筛选和培养能够产生活性生物碱的内生真菌可以有效解决贝母药用资源相对不足、培育困难等问题。目前，贝母中产活性生物碱内生真菌的筛选与鉴定研究已相对成熟，但发酵条件的探索方面研究尚少，菌种退化是影响内生真菌目的产物产量稳定的技术瓶颈，常规复壮手段效果并不理想，探索出合适的菌种保存或复壮方法是亟待解决的问题。
参考文献
[1]陈鹊.川贝母内生真菌及其次生代谢产物的研究[D].雅安：四川农业大学，2012.
[2]张明发，沈雅琴.浙贝母药理研究进展[J].上海医药，2007，28（10）：459-461.
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[8]李清华，张连龙.安徽贝母二萜成分的研究[J].中国中药杂志，1990，15（3）：42-43.
[9]王曙，徐小平.川贝母与其他贝母类药材总生物碱和总皂苷的含量测定与比较[J].中国中药杂志，2002，27（5）：342-344.
[10]严铸云，张琦.不同生长期川贝母内生真菌的多样性[J].华西药学杂志，2008，23（5）：521-523.
[11]杨宇，汪学军，韦传宝，等.皖贝母内生真菌的初步研究[J].皖西学院学报，2011，27（5）：8-10.
[12]张辉东，曾雪丽.暗紫贝母内生真菌红色素的提取及稳定性研究[J].湖北农业科学，2011，50（18）：3815-3818.
[13]高俊杰，袁小凤.浙贝母内生真菌的分离筛选及抑菌活性菌株Aspergillus sp.BJ7性质的初步研究[J].中国中医药科技，2012，19（2）：140-142.
[14]叶波平，张少华.贝母内生真菌Nectria sp.NO6及其活性代谢产物的研究[C]//2008年中国微生物学会学术年会论文摘要集.海口：海南省微生物学会，2008.
[15]殷红，陈娟丽.贝母内生真菌产西贝素发酵条件的研究[J].西北大学学报（自然科学版），2011，41（2）：261-264.