【摘 要】
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目的对 ITGB3基因新的终止突变c.1476G>A进行体外表达研究，以阐明其功能。方法 应用体外定点诱变技术构建突变型 ITGB3 c．1476G>A cDNA的真核表达载体，转化感受态细胞，提取质粒后测序验证。采用非脂质体介导重组质粒转染中国仓鼠卵巢癌细胞株(Chinese hamster ovarian cancer, CHO)细胞，经G418筛选获取稳定表达细胞株。采用实时荧光定量PCR、
【机 构】
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310006 杭州，浙江省血液中心输血研究所、卫生部血液安全研究重点实验室浙江省血液安全研究重点实验室,310006 杭州，浙江省血液中心输血研究所、卫生部血液安全研究重点实验室浙江省血液安全研究重点
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目的对 ITGB3基因新的终止突变c.1476G>A进行体外表达研究，以阐明其功能。
方法 应用体外定点诱变技术构建突变型 ITGB3 c．1476G>A cDNA的真核表达载体，转化感受态细胞，提取质粒后测序验证。采用非脂质体介导重组质粒转染中国仓鼠卵巢癌细胞株(Chinese hamster ovarian cancer, CHO)细胞，经G418筛选获取稳定表达细胞株。采用实时荧光定量PCR、Western印迹和流式细胞术分别检测CHO稳定表达株 ITGB3基因的mRNA表达和血小板膜糖蛋白Ⅲa(glycoprotein Ⅲa, GPⅢa)糖蛋白水平。
结果成功构建野生型和突变型 ITGB3 cDNA的真核表达载体，转染筛选后分别获得了稳定表达的CHO细胞株。突变型细胞株中CD61抗原表达量仅为野生型的37%，而 ITGB3 mRNA转录水平为野生型的6%。Western印迹结果显示，野生型细胞株稳定表达完整的GPⅢa蛋白，而突变型CHO细胞株无完整的GPⅢa蛋白表达。
结论ITGB3 c．1476G>A终止突变可导致 ITGB3基因的转录水平降低，影响GPⅢa蛋白合成及CD61抗原的表达水平。
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