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摘要[目的]探求表征土壤重金属污染的主要指示酶，为重金属污染土壤环境质量评价提供理论依据。[方法]以东北黑土为主要研究对象，采用实验室模拟试验，研究不同浓度重金属Cu、Zn、Pb、Cd单因素污染对土壤中过氧化氢酶、脲酶、转化酶、蛋白酶和脱氢酶活性及微生物群落的影响。[结果]土壤脲酶活性与重金属的污染程度呈良好的负相关关系，土壤过氧化氢酶活性对Cu、Zn含量的增加表现较敏感，土壤转化酶活性对Cu非常敏感。[结论]土壤脲酶活性最适于作为土壤重金属污染的敏感指标。
关键词重金属；黑土；脲酶；土壤酶活性；微生物群落
中图分类号S151文献标识码A文章编号0517-6611（2014）01-00099-03
基金项目国家自然基金青年基金项目（41203049）；中国博士后科学基金（20110491289）。
作者简介费杨（1990- ），男，山东临邑人，硕士研究生，从事环境污染与控制研究。*通讯作者，讲师，博士，从事环境污染与控制化学、污染物形态与迁移转化研究，Email： [email protected]。
收稿日期20131129重金属矿藏的大量开采，农药和化肥的不合理施用，工业“三废”以及生活垃圾处置不当等，使得土壤重金属污染问题越来越严重。土壤重金属污染物可通过吸入、摄取、皮肤接触等多种途径危害人体健康。我国土壤重金属污染问题十分突出。粮食、蔬菜、水果等食物重金属超标问题严重。污染问题已引起社会对农产品质量安全问题的普遍关注。
随着人们生活水平的不断提高，人们更关心土壤中重金属的归宿、生物毒性，因而土壤环境质量监测及生态恢复等问题引起人们的关注，土壤酶的研究逐渐被人们所重视。土壤酶活性可以作为一种指标，反映土壤受污染的程度[1-3]。同时，土壤酶是土壤生物化学反应的催化剂，参与土壤系统中许多重要的代谢过程，因而可用它来检测土壤中重金属的相对污染程度。因此，通过实验室模拟试验，以东北黑土为主要研究对象，研究不同浓度重金属Cu、Zn、Pb、Cd单因素污染对土壤中过氧化氢酶、脲酶、转化酶、蛋白酶和脱氢酶活性及微生物群落的影响，以探求表征土壤重金属污染的主要指示酶，为重金属污染土壤环境质量评价提供理论依据。
1材料与方法
1.1供试土壤供试土壤为黑土，采自吉林省长春市吉林大学和平校区未受污染农田表层（125.27°E， 43.91°N），采样深度0～20 cm。采样区属于暖温带大陆性季风气候，四季分明，雨热同期，年平均气温4.8 ℃，最高温度39.5 ℃，最低温度-39.8 ℃，日照时间2 688 h，年平均降水量522～615 mm。
1.2土壤预培养及重金属的添加自土壤被运回实验室后，在阴凉通风处自然晾干，并过5 mm筛，剔除大小砾石、动植物残体等杂物。根据《土壤环境质量标准》（GB15618-1995），设定土壤中重金属掺入量，以三级标准下土壤环境质量标准值为1倍基值，分别设定1倍、2倍、4倍、6倍不同浓度梯度及对照（不掺重金属）。以Cu（NO3）2·3H2O、Zn（NO3）2·6H2O、Pb（NO3）2、Cd（NO3）2·4H2O的水溶液形式，采用喷雾法逐步混匀，调节并保持土壤含水量在田间最大持水量（50%）的30%左右。室温下培养10 d后取土样，室内自然风干，研磨，过1 mm筛，保存，以供土壤中过氧化氢酶、脲酶、转化酶、蛋白酶活性的测定，并且取新鲜土样进行土壤脱氢酶活性的测定。
1.3土壤酶活性的测定方法土壤过氧化氢酶活性的测定采用高锰酸钾滴定法[4-6]；土壤脲酶活性的测定采用苯酚钠比色法[4-6]；土壤转化酶活性的测定采用3，5-二硝基水杨酸比色法[4-6]；土壤蛋白酶活性的测定采用茚三酮比色法[7]；土壤脱氢酶活性的测定采用TTC比色法[7]。
1.4土壤微生物群落计数方法微生物群落计数用平板涂抹法测定[8]，其中细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基测定，真菌采用马铃薯蔗糖培养基测定，放线菌采用高氏一号培养基测定。
1.5数据处理方法试验数据采用Microsoft Excel 2003进行处理和统计分析，并作图。
2结果分析与讨论
2.1重金属Cu、Zn、Pb、Cd单因素多浓度污染对酶活性的影响从图1可以看出，与未加重金属的对照相比，不同掺杂量的重金属进入土壤10 d之后，重金属Pb、Cd污染土壤中过氧化氢酶活性基本不随Pb、Cd浓度的改变而变化，说明重金属Pb、Cd污染对过氧化氢酶活性的影响与浓度关系不大，只要超过污染基准值，土壤过氧化氢酶活性就保持在一个相对稳定值。重金属Cu、Zn处理的土壤中过氧化氢酶活性都有所下降，且随着掺入量的增加，土壤过氧化氢酶活性呈不断下降的趋势，说明重金属Cu、Zn污染对过氧化氢酶活性的抑制作用随Cu、Zn浓度的增大而增强。在Cu、Zn掺入量为6倍基值处，过氧化氢酶活性分别下降了49.8%和31.0%，其中重金属Cu污染对过氧化氢酶活性的抑制作用最大。但是，当Cu掺杂量为6倍基值时，土壤过氧化氢酶活性相比4倍基值Cu掺入量时略有升高，可能是由于一小部分微生物在高浓度的Cu污染下存活下来，产生抗性，并且自行繁殖，使得土壤过氧化氢酶活性升高。由此可知，土壤过氧化氢酶活性对重金属Cu、Zn含量的增加表现较敏感，适于作为土壤Cu、Zn单一污染评价的敏感指标。
2.2 重金属Cu、Zn、Pb、Cd单因素多浓度污染对土壤微生物群落的影响图5～7分别为不同掺杂量的Cu、Zn、Pb、Cd进入土壤10 d之后土壤中细菌、真菌和放线菌总菌数的变化。从图5可以看出，土壤Cu、Zn污染对其中的细菌菌落总数都有一定的抑制作用，且随着Cu、Zn浓度的增加，细菌总菌数呈不断下降的趋势，在6倍基值处Cu、Zn污染土壤中细菌菌落总数分别比对照下降了59.6%、65.7%。这与前面Cu、Zn污染对土壤过氧化氢酶、脲酶和转化酶活性的影响趋势一样。但是，土壤Pb、Cd污染与土壤细菌菌落总数没有表现出良好的相关性。 从图6可以看出，除重金属Cd外，Cu、Zn、Pb对土壤真菌数量都有一定的促进作用，其中Zn对真菌数量的促进作用最明显，相关性最好，在4倍基值处，土壤真菌数量相比对照增加685.3%，而Cu、Pb含量与土壤真菌总数并没有表现出良好的规律性，Cd污染土壤中真菌总数基本没有变化。而图7中土壤放线菌总数与重金属含量也没有良好的相关性。研究还表明，重金属污染对土壤酶活性的抑制作用主要是通过抑制土壤中细菌的数量和活性，使得土壤酶的分泌、合成减少，从而土壤酶活性降低。
通过外源加入重金属，研究Cu、Zn、Pb、Cd单因素多浓度污染对土壤过氧化氢酶、脲酶、转化酶、蛋白酶和脱氢酶活性以及微生物群落的影响。结果表明，土壤脲酶活性对重金属污染最敏感，与重金属的污染程度呈良好的负相关关系，最适于作为土壤重金属污染的敏感指标；土壤过氧化氢酶活性对重金属Cu、Zn含量的增加表现较敏感，适于作为土壤图6重金属Cu、Zn、Pb、Cd单因素多浓度污染对土壤真菌总菌数的影响图7重金属Cu、Zn、Pb、Cd单因素多浓度污染对土壤放线菌总菌数的影响Cu、Zn单一污染评价的敏感指标；Cu对转化酶活性的抑制作用非常强烈，土壤转化酶对金属Cu非常敏感，可以作为土壤Cu污染评价的敏感指标。而土壤蛋白酶、脱氢酶与土壤重金属污染程度没有良好的相关关系，不适于作为土壤重金属污染评价的指示酶。从微生物平板计数试验可以看出，重金属污染对土壤酶活性的抑制作用主要是通过抑制土壤中细菌的数量和活性，使得土壤酶的分泌、合成减少，从而土壤酶活性降低。
参考文献
[1] 尹君，高如泰，刘文菊，等.土壤酶活性与土壤Cd污染评价指标[J].农业环境保护，1999，18（3）：30-132.
[2] 李博文，刘树庆.潮褐土镉、锌、铅复合污染与土壤酶活性的研究[J].吉林农业科学，2000，25（1）：38-41.
[3] 王广林，王立龙，王育鹏，等.冶炼厂污灌区土壤铜和锌污染与土壤酶活性[J].应用生态学报，2005，16（2）：328-331.
[4] 周礼恺，张志明.土壤酶活性的测定方法[J].土壤通报，1980（5）：37-38.
[5] 周礼恺.土壤酶学[M].北京：科学出版社，1987.
[6] 李振高，骆永明，滕应.土壤与环境微生物研究法[M].北京：科学出版社，2008.
[7] 关松荫.土壤酶及其研究法[M].北京：农业出版社，1987.
[8] 沈萍，范秀容，李广武.微生物学实验[M].北京：高等教育出版社，2002.
[9] 吴金水，林启美，黄巧云，等.土壤微生物生物量测定方法及其应用[M].
关键词重金属；黑土；脲酶；土壤酶活性；微生物群落
中图分类号S151文献标识码A文章编号0517-6611（2014）01-00099-03
基金项目国家自然基金青年基金项目（41203049）；中国博士后科学基金（20110491289）。
作者简介费杨（1990- ），男，山东临邑人，硕士研究生，从事环境污染与控制研究。*通讯作者，讲师，博士，从事环境污染与控制化学、污染物形态与迁移转化研究，Email： [email protected]。
收稿日期20131129重金属矿藏的大量开采，农药和化肥的不合理施用，工业“三废”以及生活垃圾处置不当等，使得土壤重金属污染问题越来越严重。土壤重金属污染物可通过吸入、摄取、皮肤接触等多种途径危害人体健康。我国土壤重金属污染问题十分突出。粮食、蔬菜、水果等食物重金属超标问题严重。污染问题已引起社会对农产品质量安全问题的普遍关注。
随着人们生活水平的不断提高，人们更关心土壤中重金属的归宿、生物毒性，因而土壤环境质量监测及生态恢复等问题引起人们的关注，土壤酶的研究逐渐被人们所重视。土壤酶活性可以作为一种指标，反映土壤受污染的程度[1-3]。同时，土壤酶是土壤生物化学反应的催化剂，参与土壤系统中许多重要的代谢过程，因而可用它来检测土壤中重金属的相对污染程度。因此，通过实验室模拟试验，以东北黑土为主要研究对象，研究不同浓度重金属Cu、Zn、Pb、Cd单因素污染对土壤中过氧化氢酶、脲酶、转化酶、蛋白酶和脱氢酶活性及微生物群落的影响，以探求表征土壤重金属污染的主要指示酶，为重金属污染土壤环境质量评价提供理论依据。
1材料与方法
1.1供试土壤供试土壤为黑土，采自吉林省长春市吉林大学和平校区未受污染农田表层（125.27°E， 43.91°N），采样深度0～20 cm。采样区属于暖温带大陆性季风气候，四季分明，雨热同期，年平均气温4.8 ℃，最高温度39.5 ℃，最低温度-39.8 ℃，日照时间2 688 h，年平均降水量522～615 mm。
1.2土壤预培养及重金属的添加自土壤被运回实验室后，在阴凉通风处自然晾干，并过5 mm筛，剔除大小砾石、动植物残体等杂物。根据《土壤环境质量标准》（GB15618-1995），设定土壤中重金属掺入量，以三级标准下土壤环境质量标准值为1倍基值，分别设定1倍、2倍、4倍、6倍不同浓度梯度及对照（不掺重金属）。以Cu（NO3）2·3H2O、Zn（NO3）2·6H2O、Pb（NO3）2、Cd（NO3）2·4H2O的水溶液形式，采用喷雾法逐步混匀，调节并保持土壤含水量在田间最大持水量（50%）的30%左右。室温下培养10 d后取土样，室内自然风干，研磨，过1 mm筛，保存，以供土壤中过氧化氢酶、脲酶、转化酶、蛋白酶活性的测定，并且取新鲜土样进行土壤脱氢酶活性的测定。
1.3土壤酶活性的测定方法土壤过氧化氢酶活性的测定采用高锰酸钾滴定法[4-6]；土壤脲酶活性的测定采用苯酚钠比色法[4-6]；土壤转化酶活性的测定采用3，5-二硝基水杨酸比色法[4-6]；土壤蛋白酶活性的测定采用茚三酮比色法[7]；土壤脱氢酶活性的测定采用TTC比色法[7]。
1.4土壤微生物群落计数方法微生物群落计数用平板涂抹法测定[8]，其中细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基测定，真菌采用马铃薯蔗糖培养基测定，放线菌采用高氏一号培养基测定。
1.5数据处理方法试验数据采用Microsoft Excel 2003进行处理和统计分析，并作图。
2结果分析与讨论
2.1重金属Cu、Zn、Pb、Cd单因素多浓度污染对酶活性的影响从图1可以看出，与未加重金属的对照相比，不同掺杂量的重金属进入土壤10 d之后，重金属Pb、Cd污染土壤中过氧化氢酶活性基本不随Pb、Cd浓度的改变而变化，说明重金属Pb、Cd污染对过氧化氢酶活性的影响与浓度关系不大，只要超过污染基准值，土壤过氧化氢酶活性就保持在一个相对稳定值。重金属Cu、Zn处理的土壤中过氧化氢酶活性都有所下降，且随着掺入量的增加，土壤过氧化氢酶活性呈不断下降的趋势，说明重金属Cu、Zn污染对过氧化氢酶活性的抑制作用随Cu、Zn浓度的增大而增强。在Cu、Zn掺入量为6倍基值处，过氧化氢酶活性分别下降了49.8%和31.0%，其中重金属Cu污染对过氧化氢酶活性的抑制作用最大。但是，当Cu掺杂量为6倍基值时，土壤过氧化氢酶活性相比4倍基值Cu掺入量时略有升高，可能是由于一小部分微生物在高浓度的Cu污染下存活下来，产生抗性，并且自行繁殖，使得土壤过氧化氢酶活性升高。由此可知，土壤过氧化氢酶活性对重金属Cu、Zn含量的增加表现较敏感，适于作为土壤Cu、Zn单一污染评价的敏感指标。
2.2 重金属Cu、Zn、Pb、Cd单因素多浓度污染对土壤微生物群落的影响图5～7分别为不同掺杂量的Cu、Zn、Pb、Cd进入土壤10 d之后土壤中细菌、真菌和放线菌总菌数的变化。从图5可以看出，土壤Cu、Zn污染对其中的细菌菌落总数都有一定的抑制作用，且随着Cu、Zn浓度的增加，细菌总菌数呈不断下降的趋势，在6倍基值处Cu、Zn污染土壤中细菌菌落总数分别比对照下降了59.6%、65.7%。这与前面Cu、Zn污染对土壤过氧化氢酶、脲酶和转化酶活性的影响趋势一样。但是，土壤Pb、Cd污染与土壤细菌菌落总数没有表现出良好的相关性。 从图6可以看出，除重金属Cd外，Cu、Zn、Pb对土壤真菌数量都有一定的促进作用，其中Zn对真菌数量的促进作用最明显，相关性最好，在4倍基值处，土壤真菌数量相比对照增加685.3%，而Cu、Pb含量与土壤真菌总数并没有表现出良好的规律性，Cd污染土壤中真菌总数基本没有变化。而图7中土壤放线菌总数与重金属含量也没有良好的相关性。研究还表明，重金属污染对土壤酶活性的抑制作用主要是通过抑制土壤中细菌的数量和活性，使得土壤酶的分泌、合成减少，从而土壤酶活性降低。
通过外源加入重金属，研究Cu、Zn、Pb、Cd单因素多浓度污染对土壤过氧化氢酶、脲酶、转化酶、蛋白酶和脱氢酶活性以及微生物群落的影响。结果表明，土壤脲酶活性对重金属污染最敏感，与重金属的污染程度呈良好的负相关关系，最适于作为土壤重金属污染的敏感指标；土壤过氧化氢酶活性对重金属Cu、Zn含量的增加表现较敏感，适于作为土壤图6重金属Cu、Zn、Pb、Cd单因素多浓度污染对土壤真菌总菌数的影响图7重金属Cu、Zn、Pb、Cd单因素多浓度污染对土壤放线菌总菌数的影响Cu、Zn单一污染评价的敏感指标；Cu对转化酶活性的抑制作用非常强烈，土壤转化酶对金属Cu非常敏感，可以作为土壤Cu污染评价的敏感指标。而土壤蛋白酶、脱氢酶与土壤重金属污染程度没有良好的相关关系，不适于作为土壤重金属污染评价的指示酶。从微生物平板计数试验可以看出，重金属污染对土壤酶活性的抑制作用主要是通过抑制土壤中细菌的数量和活性，使得土壤酶的分泌、合成减少，从而土壤酶活性降低。
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