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中图分类号 R917 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2018）23-3189-05
DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.23.05
摘 要 目的：建立拆分盐酸西替利嗪、盐酸异丙嗪、特非那定和马来酸非尼拉敏4种H1受体拮抗药对映体的方法。方法：采用高效液相色谱法（HPLC），选择Chiralcel OJ-H手性色谱柱，检测波长为230 nm，柱温为室温，流速为1.0 mL/min，进样量为20 μL；以保留时间、选择因子和分离度为指标，考察流动相中酸碱添加剂（二乙胺）、有机改性剂的种类（乙醇、异丙醇）及其占比、甲醇等对4种药物对映体分离的影響。结果：流动相考察结果为盐酸西替利嗪和盐酸异丙嗪的流动相为正己烷-乙醇（90 ∶ 10，V/V）；特非那定的流动相为正己烷-甲醇-乙醇-二乙胺（89 ∶ 9.9 ∶ 1 ∶ 0.1，V/V/V/V）；马来酸非尼拉敏对映体的流动相为正己烷-甲醇-乙醇-二乙胺（98 ∶ 2 ∶ 0.5 ∶ 0.1，V/V/V/V）。在此条件下，4种药物的对映体均达到完全分离，分离度分别为4.36、3.76、1.55、1.71。结论：建立的Chiralcel OJ-H手性色谱柱-HPLC法对这4种H1受体拮抗药的选择性良好，可用于其对映体的手性分离。
关键词 Chiralcel OJ-H手性色谱柱；高效液相色谱法；H1受体拮抗药；盐酸西替利嗪；盐酸异丙嗪；特非那定；马来酸非尼拉敏；对映体
ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for separating of 4 kinds of H1-receptor antagonist enantiomers as cetirizine hydrochloride， promethazine hydrochloride， terfenadine and pheniramine maleate. METHODS： HPLC method was adopted. Chiralcel OJ-H chiral column was selected. Detection wavelength was set at 230 nm； column temperature was room temperature； flow rate was 1.0 mL/min； sample size was 20 μL. Using retention time， selective factors and separation rate as indexes， the influence of acid-base additives （diethylamine）， type and ratio of organic modifiers （ethanol， isopropanol）， methanol on the separation of 4 kinds of enantiomers in mobile phase were investigated. RESULTS： The results of mobile phase investigation was the mobile phase of cetirizine hydrochloride and promethazine hydrochloride was n-hexane and ethanol （90 ∶ 10， V/V）. Mobile phase of terfenadine was n-hexane-methanol-ethanol-diethylamine （89 ∶ 9.9 ∶ 1 ∶ 0.1， V/V/V/V）. Mobile phase of pheniramine maleate enantiomers was n-hexane-methanol-ethanol-diethylamine （98 ∶ 2 ∶ 0.5 ∶ 0.1， V/V/V/V）. Under the condition， 4 kinds of drug enantiomers were separated completely， with separate rate of 4.36， 3.76， 1.55， 1.71. CONCLUSIONS： Established Chiralcel OJ-H chiral column-HPLC is selective for these 4 kinds of H1-receptor antagonists， and can be used for the chiral separation of the enationmers.
KEYWORDS Chiralcel OJ-H chiral column； HPLC； H1-receptor antagonists； Cetirizine hydrochloride； Promethazine hydrochloride； Terfenazine； Pheniramine maleate； Enantiomer
组胺是一种内源性的生物活性物质，可参与多种复杂的生理过程。外源性抗原能引起人体的过敏性反应，导致血浆渗出，出现局部组织红肿，支气管、胃肠道平滑肌收缩等过敏性症状[1]。H1受体拮抗药可拮抗组胺与H1受体结合，产生抗过敏作用。目前，H1受体拮抗药在临床上主要用于治疗胃溃疡和过敏性疾病，常见的H1受体拮抗药类药物有盐酸西替利嗪、盐酸异丙嗪、马来酸非尼拉敏和特非那定等。以盐酸西替利嗪为例，其分子中存在一对对映异构体，有关研究表明[2]，盐酸西替利嗪异构体的药效存在显著差异，（+）-异构体主要用于治疗风疹，（-）-异构体主要用于抗过敏治疗，其单旋体用药可以避免外消旋体用药产生的副作用。为了减少对映体药物的毒副作用，提高药物利用度，以及控制药物的质量，应对手性对映体药物进行分析和研究。 目前，常用于拆分H1受体拮抗药的方法为毛细管电泳法与高效液相色谱法[3-5]。其中利用β-环糊精作为毛细管电泳法和高效液相色谱法的流动相添加剂或者将β-环糊精键合到硅胶上作为手性固定相拆分不同的H1受体拮抗药对映体已有报道[6-8]。而纤维素类手性固定相是近几年开始应用的固定相，因其制备简单，手性识别能力强等优点而被广泛应用[9]。笔者在本研究中首次使用Chiralcel OJ-H色谱柱，其固定相是由表面涂敷有纤维素-3（4-甲基苯甲酸酯）的硅胶组成，并考察了流动相中酸碱添加剂（二乙胺）、有机改性剂的种类（乙醇、异丙醇）及其占比、甲醇等对盐酸西替利嗪、盐酸异丙嗪、特非那定和马来酸非尼拉敏4种H1受体拮抗药类药物对映体分离的影响，优化分离条件，建立这4种药物对映体分离的方法，为后续相关药物的对映体研究提供参考。
1 材料
1.1 仪器
1580高效液相色谱仪（日本Jasco公司）；Chiralcel OJ-H色谱柱（日本Daicel公司）；SPD-15C紫外检测器（日本Shimadzu公司）；N2000色谱工作站（浙江大学智达信息有限公司）；BS1102电子天平（德国Sartorius公司）。
1.2 药品与试剂
盐酸西替利嗪对照品（消旋体，批号：100660-201102，纯度：99.8%）、左旋盐酸西替利嗪对照品（批号：100659- 201102，纯度：98.8%）、盐酸异丙嗪对照品（消旋体，批号：100422-201603，纯度：99.5%）、特非那定对照品（消旋体，批号：100292-201302，纯度：99.4%）均购至中国食品药品检定研究院；马来酸非尼拉敏对照品（消旋体，欧洲药品质量管理局，批号：P0850000，纯度：100%）；盐酸西替利嗪原料药（丹东医创药品有限责任公司，批号：160310，纯度：99.4%）；盐酸异丙嗪原料药（苏州甫路生物科技有限公司，批号：170407，纯度：99.1%）；特非那定原料药（沈阳新马药业有限公司，批号：361503017，纯度：99.0%）；马来酸非尼拉敏原料药（珠海物美科技有限公司，批号：150204，纯度：99.0%）；正己烷、乙醇、异丙醇、甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱为Chiralcel OJ-H手性色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），检测波长为230 nm，柱温为室温，流速为1.0 mL/min，进样量为20 μL，流动相根据优化条件确定。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液的制备 分别称取盐酸西替利嗪、盐酸异丙嗪、特非那定和马来酸非尼拉敏对照品适量，分别用乙醇稀释成质量浓度为0.1 mg/mL的对照品溶液，经0.45 μm微孔滤膜过滤，即得4种药物的对照品溶液，并于4 ℃下保存，备用。
2.2.2 供试品溶液的制备 分别称取盐酸西替利嗪、盐酸异丙嗪、特非那定和马来酸非尼拉敏原料药适量，分别用乙醇稀释成质量浓度为0.1 mg/mL的供试品溶液，经0.45 μm微孔滤膜过滤，即得4种药物的供试品溶液，并于4 ℃下保存，备用。
2.2.3 左旋盐酸西替利嗪对照品溶液的制备 称取左旋盐酸西替利嗪对照品适量，用乙醇稀释成质量浓度为0.05 mg/mL的溶液，经0.45 μm微孔滤膜过滤，即得，并于4 ℃下保存，备用。
2.3 分离条件的选择
在前期试验中发现，盐酸西替利嗪和盐酸异丙嗪的流动相（正己烷-乙醇）在不添加碱性添加剂时，其对映体色谱峰已经能达到完全分离，为了保护色谱柱，故不继续考察酸碱添加剂对这2种药物的影响。相同条件下，特非那定和马来酸非尼拉敏对映体色谱峰峰形严重拖尾且未实现分离，改变有机改性剂的种类和占比均不能使其分离，故先考察加入酸碱添加剂（二乙胺），使其色谱峰部分分离后，继续考察有机改性剂的种类及其占比对这4种药物分离的影响。
2.3.1 酸碱添加剂的影响 按“2.1”项下色谱条件，以保留时间t、选择因子α（α应>1，且α越大，选择性越好，分离效果越好）和分离度R（R应≥1.5，且R越大，对映体的分离效果越好）为指标，考察流动相中加入0.1%二乙胺对特非那定和马来酸非尼拉敏对映体分离的影响，二乙胺对特非那定和马来酸非尼拉敏对映体分离的影响结果见表1（表中t1为第1个对映体峰的保留时间；t2为第2个对映体峰的保留时间，下同）。
特非那定和马来酸非尼拉敏对映体在未加入二乙胺时其色谱峰峰形严重拖尾且未实现分离（α=1，R=0），当在流动相中加入0.1%二乙胺后，特非那定对映体的α为1.30、R为1.03，马来酸非尼拉敏对映体的α为1.12、R为0.79，均实现了部分分离。因此，在特非那定和马来酸非尼拉敏对映体分离流动相中加入0.1%二乙胺可改善其对映体的分离。
2.3.2 有机改性剂的种类对分离的影响 以正己烷为基础溶剂，按“2.1”项下色谱条件，考察流动相中有机改性剂种类（乙醇和异丙醇）对盐酸西替利嗪、盐酸异丙嗪、特非那定和马来酸非尼拉敏对映体分离的影响，有机改性剂种类对4种药物对映体的分离影响结果见表2。
由表2可知，对于盐酸西替利嗪和盐酸异丙嗪对映体，使用乙醇作为有机改性剂时α和R更大，因此，选择正己烷-乙醇作为分离盐酸西替利嗪和盐酸异丙嗪对映体的流动相；对于特非那定和马来酸非尼拉敏对映体，当以异丙醇为有机改性剂时，手性固定相对这两种药物均没有选择性，两种药物不能被分离。当使用乙醇为有机改性劑，特非那定对映体的R由0增加为1.03，马来酸非尼拉敏对映体的R由0增加为0.79，两种药物的分离均得到明显改善，因此，选择正己烷-乙醇-0.1%二乙胺作为分离特非那定和马来酸非尼拉敏对映体的流动相。 2.3.3 有机改性剂的占比对分离的影响 根据上述试验结果，按“2.1”项下色谱条件，考察流动相中乙醇占比对盐酸西替利嗪、盐酸异丙嗪（5%、10%、15%、20%），特非那定和马来酸非尼拉敏（2%、5%、8%、10%）对映体分离的影响，结果见表3。
从表3中可知，随着乙醇占比的降低，4种药物的出峰时间均延长。当分离盐酸西替利嗪对映体的乙醇占比从20%降低到5%时，其α和R均逐渐增加；但乙醇占比为5%时，出峰时间长且峰宽明显增加；因此，选择10%乙醇占比来分离盐酸西替利嗪对映体。盐酸异丙嗪对映体在乙醇占比为10%时，α和R达到最大；因此，选择10%乙醇占比来分离盐酸异丙嗪对映体。特非那定和马来酸非尼拉敏对映体分离的情况略有不同。随着乙醇占比的降低，这2种药物的选择因子呈现先增大后减小的趋势。特非那定对映体在乙醇占比为10%时，分离度最大（R=1.03）；因此，选择10%乙醇占比来分离特非那定对映体。马来酸非尼拉敏对映体在乙醇占比为2%时，分离度最大（R=1.09）。因此，选择2%乙醇占比来分离马来酸非尼拉敏对映体。
2.3.4 甲醇对分离的影响 在“2.3.3”项试验结果基础上，特非那定对映体的R=1.03，马来酸非尼拉敏对映体的R=1.09，均小于1.5，故继续优化分离条件，以实现完全分离。据有关文献报道[10]，甲醇的加入有利于对映体的拆分。因此，尝试在特非那定和马来酸非尼拉敏对映体分离的流动相中加入甲醇。结果显示，特非那定对映体在正己烷-甲醇-乙醇-二乙胺体积比为89 ∶ 9.9 ∶ 1 ∶ 0.1的条件下，获得了最大分离度（R=1.56）；马来酸非尼拉敏对映体在正己烷-乙醇-甲醇-二乙胺体积比为 98 ∶ 2 ∶ 0.5 ∶ 0.1时，获得了最大分离度（R=1.61）。两种药物均达到了完全分离。
2.4 系统适用性考察
精密吸取“2.2”项下各药物的对照品溶液和供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件和“2.3”项下优化后的各药流动相组成，进样分析。结果显示，盐酸西替利嗪、盐酸异丙嗪、特非那定和马来酸非尼拉敏对照品溶液的R分别为4.29、3.67、1.56和1.68，4种药物对照品溶液的高效液相色谱图详见图1。盐酸西替利嗪、盐酸异丙嗪、特非那定和马来酸非尼拉敏供试品溶液的分离度分别为4.36、3.76、1.55和1.71，4种药物供试品溶液的高效液相色谱图详见图2。
2.5 对映体洗脱顺序的考察
准确预測对映异构体在高效液相色谱中的洗脱顺序对于手性药物的定性和定量分析具有重要意义。因此，笔者以盐酸西替利嗪为例，考察盐酸西替利嗪对映体的洗脱顺序。精密吸取“2.2.1”项下盐酸西替利嗪对照品溶液和“2.2.3” 左旋盐酸西替利嗪溶液，按“2.1”项色谱条件和“2.3”项下优化后的各流动相组成，进样分析。结果显示，右旋盐酸西替利嗪先被洗脱下来，左旋盐酸西替利嗪后被洗脱下来，两对映体分离情况详见图3。
3 讨论
本文使用的Chiralcel OJ-H手性色谱柱固定相是由硅胶载体涂覆纤维素-3（4-甲基苯甲酸酯）制备而成，根据“三点相互作用”原理[11]，固定相上的羰基可以与对映体中的羟基、氨基形成氢键，与具有羰基的对映体发生偶极-偶极相互作用，与带有羟基或氨基的对映体则可通过氢键发生作用；固定相上的甲基是供电子基团，引入甲基可使苯环上的电子云密度增强，使得C=O基团上的电子云密度加大，从而加强了固定相与对映体之间的相互作用。盐酸西替利嗪、盐酸异丙嗪、特非那定和马来酸非尼拉敏的化学结构中均含有苯环、氨基或羟基等基团，可与固定相的苯基之间还能形成π-π相互作用，从而实现了4种H1受体拮抗药的对映体分离。
根据本研究结果可知，盐酸西替利嗪和盐酸异丙嗪对映体分离效果较好。这是由于在盐酸西替利嗪的分子结构中，手性碳分别与2个苯环和1个哌嗪基相连，与固定相的苯基之间能产生较强的π-π作用；在盐酸异丙嗪的分子中，手性碳原子不仅与氨基相连，还能与固定相产生氢键作用；同时，手性碳原子上还连有吩噻嗪基，能与固定相的苯环产生π-π作用，故使得该手性固定相对盐酸异丙嗪具有较强的对映体选择性。由特非那丁和马来酸非尼拉敏的结构式可知，特非那定手性碳原子的α位仅连有1个苯环，与盐酸异丙嗪和盐酸西替利嗪相比，其与固定相的苯环产生的π-π作用较小；且由于其结构式中有较大的空间位阻，减小了分子与固定相之间空间适应性，而在马来酸非尼拉敏的手性碳原子的β位连有叔胺基团，形成空间位阻，使得该固定相对特非那定和马来酸非尼拉敏的手性选择性较小。
综上所述，本试验建立的方法简单、快速，且分离效果好，不仅能够拓展纤维素涂覆型手性固定相的应用范围，还可作为盐酸西替利嗪、盐酸异丙嗪、特非那定和马来酸非尼拉敏对映体分离的新方法，并在立体选择性代谢研究、手性药物质量控制等方面具有一定的参考价值。
参考文献
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（收稿日期：2018-08-14 修回日期：2018-10-10）
（编辑：唐晓莲）
DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.23.05
摘 要 目的：建立拆分盐酸西替利嗪、盐酸异丙嗪、特非那定和马来酸非尼拉敏4种H1受体拮抗药对映体的方法。方法：采用高效液相色谱法（HPLC），选择Chiralcel OJ-H手性色谱柱，检测波长为230 nm，柱温为室温，流速为1.0 mL/min，进样量为20 μL；以保留时间、选择因子和分离度为指标，考察流动相中酸碱添加剂（二乙胺）、有机改性剂的种类（乙醇、异丙醇）及其占比、甲醇等对4种药物对映体分离的影響。结果：流动相考察结果为盐酸西替利嗪和盐酸异丙嗪的流动相为正己烷-乙醇（90 ∶ 10，V/V）；特非那定的流动相为正己烷-甲醇-乙醇-二乙胺（89 ∶ 9.9 ∶ 1 ∶ 0.1，V/V/V/V）；马来酸非尼拉敏对映体的流动相为正己烷-甲醇-乙醇-二乙胺（98 ∶ 2 ∶ 0.5 ∶ 0.1，V/V/V/V）。在此条件下，4种药物的对映体均达到完全分离，分离度分别为4.36、3.76、1.55、1.71。结论：建立的Chiralcel OJ-H手性色谱柱-HPLC法对这4种H1受体拮抗药的选择性良好，可用于其对映体的手性分离。
关键词 Chiralcel OJ-H手性色谱柱；高效液相色谱法；H1受体拮抗药；盐酸西替利嗪；盐酸异丙嗪；特非那定；马来酸非尼拉敏；对映体
ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for separating of 4 kinds of H1-receptor antagonist enantiomers as cetirizine hydrochloride， promethazine hydrochloride， terfenadine and pheniramine maleate. METHODS： HPLC method was adopted. Chiralcel OJ-H chiral column was selected. Detection wavelength was set at 230 nm； column temperature was room temperature； flow rate was 1.0 mL/min； sample size was 20 μL. Using retention time， selective factors and separation rate as indexes， the influence of acid-base additives （diethylamine）， type and ratio of organic modifiers （ethanol， isopropanol）， methanol on the separation of 4 kinds of enantiomers in mobile phase were investigated. RESULTS： The results of mobile phase investigation was the mobile phase of cetirizine hydrochloride and promethazine hydrochloride was n-hexane and ethanol （90 ∶ 10， V/V）. Mobile phase of terfenadine was n-hexane-methanol-ethanol-diethylamine （89 ∶ 9.9 ∶ 1 ∶ 0.1， V/V/V/V）. Mobile phase of pheniramine maleate enantiomers was n-hexane-methanol-ethanol-diethylamine （98 ∶ 2 ∶ 0.5 ∶ 0.1， V/V/V/V）. Under the condition， 4 kinds of drug enantiomers were separated completely， with separate rate of 4.36， 3.76， 1.55， 1.71. CONCLUSIONS： Established Chiralcel OJ-H chiral column-HPLC is selective for these 4 kinds of H1-receptor antagonists， and can be used for the chiral separation of the enationmers.
KEYWORDS Chiralcel OJ-H chiral column； HPLC； H1-receptor antagonists； Cetirizine hydrochloride； Promethazine hydrochloride； Terfenazine； Pheniramine maleate； Enantiomer
组胺是一种内源性的生物活性物质，可参与多种复杂的生理过程。外源性抗原能引起人体的过敏性反应，导致血浆渗出，出现局部组织红肿，支气管、胃肠道平滑肌收缩等过敏性症状[1]。H1受体拮抗药可拮抗组胺与H1受体结合，产生抗过敏作用。目前，H1受体拮抗药在临床上主要用于治疗胃溃疡和过敏性疾病，常见的H1受体拮抗药类药物有盐酸西替利嗪、盐酸异丙嗪、马来酸非尼拉敏和特非那定等。以盐酸西替利嗪为例，其分子中存在一对对映异构体，有关研究表明[2]，盐酸西替利嗪异构体的药效存在显著差异，（+）-异构体主要用于治疗风疹，（-）-异构体主要用于抗过敏治疗，其单旋体用药可以避免外消旋体用药产生的副作用。为了减少对映体药物的毒副作用，提高药物利用度，以及控制药物的质量，应对手性对映体药物进行分析和研究。 目前，常用于拆分H1受体拮抗药的方法为毛细管电泳法与高效液相色谱法[3-5]。其中利用β-环糊精作为毛细管电泳法和高效液相色谱法的流动相添加剂或者将β-环糊精键合到硅胶上作为手性固定相拆分不同的H1受体拮抗药对映体已有报道[6-8]。而纤维素类手性固定相是近几年开始应用的固定相，因其制备简单，手性识别能力强等优点而被广泛应用[9]。笔者在本研究中首次使用Chiralcel OJ-H色谱柱，其固定相是由表面涂敷有纤维素-3（4-甲基苯甲酸酯）的硅胶组成，并考察了流动相中酸碱添加剂（二乙胺）、有机改性剂的种类（乙醇、异丙醇）及其占比、甲醇等对盐酸西替利嗪、盐酸异丙嗪、特非那定和马来酸非尼拉敏4种H1受体拮抗药类药物对映体分离的影响，优化分离条件，建立这4种药物对映体分离的方法，为后续相关药物的对映体研究提供参考。
1 材料
1.1 仪器
1580高效液相色谱仪（日本Jasco公司）；Chiralcel OJ-H色谱柱（日本Daicel公司）；SPD-15C紫外检测器（日本Shimadzu公司）；N2000色谱工作站（浙江大学智达信息有限公司）；BS1102电子天平（德国Sartorius公司）。
1.2 药品与试剂
盐酸西替利嗪对照品（消旋体，批号：100660-201102，纯度：99.8%）、左旋盐酸西替利嗪对照品（批号：100659- 201102，纯度：98.8%）、盐酸异丙嗪对照品（消旋体，批号：100422-201603，纯度：99.5%）、特非那定对照品（消旋体，批号：100292-201302，纯度：99.4%）均购至中国食品药品检定研究院；马来酸非尼拉敏对照品（消旋体，欧洲药品质量管理局，批号：P0850000，纯度：100%）；盐酸西替利嗪原料药（丹东医创药品有限责任公司，批号：160310，纯度：99.4%）；盐酸异丙嗪原料药（苏州甫路生物科技有限公司，批号：170407，纯度：99.1%）；特非那定原料药（沈阳新马药业有限公司，批号：361503017，纯度：99.0%）；马来酸非尼拉敏原料药（珠海物美科技有限公司，批号：150204，纯度：99.0%）；正己烷、乙醇、异丙醇、甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱为Chiralcel OJ-H手性色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），检测波长为230 nm，柱温为室温，流速为1.0 mL/min，进样量为20 μL，流动相根据优化条件确定。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液的制备 分别称取盐酸西替利嗪、盐酸异丙嗪、特非那定和马来酸非尼拉敏对照品适量，分别用乙醇稀释成质量浓度为0.1 mg/mL的对照品溶液，经0.45 μm微孔滤膜过滤，即得4种药物的对照品溶液，并于4 ℃下保存，备用。
2.2.2 供试品溶液的制备 分别称取盐酸西替利嗪、盐酸异丙嗪、特非那定和马来酸非尼拉敏原料药适量，分别用乙醇稀释成质量浓度为0.1 mg/mL的供试品溶液，经0.45 μm微孔滤膜过滤，即得4种药物的供试品溶液，并于4 ℃下保存，备用。
2.2.3 左旋盐酸西替利嗪对照品溶液的制备 称取左旋盐酸西替利嗪对照品适量，用乙醇稀释成质量浓度为0.05 mg/mL的溶液，经0.45 μm微孔滤膜过滤，即得，并于4 ℃下保存，备用。
2.3 分离条件的选择
在前期试验中发现，盐酸西替利嗪和盐酸异丙嗪的流动相（正己烷-乙醇）在不添加碱性添加剂时，其对映体色谱峰已经能达到完全分离，为了保护色谱柱，故不继续考察酸碱添加剂对这2种药物的影响。相同条件下，特非那定和马来酸非尼拉敏对映体色谱峰峰形严重拖尾且未实现分离，改变有机改性剂的种类和占比均不能使其分离，故先考察加入酸碱添加剂（二乙胺），使其色谱峰部分分离后，继续考察有机改性剂的种类及其占比对这4种药物分离的影响。
2.3.1 酸碱添加剂的影响 按“2.1”项下色谱条件，以保留时间t、选择因子α（α应>1，且α越大，选择性越好，分离效果越好）和分离度R（R应≥1.5，且R越大，对映体的分离效果越好）为指标，考察流动相中加入0.1%二乙胺对特非那定和马来酸非尼拉敏对映体分离的影响，二乙胺对特非那定和马来酸非尼拉敏对映体分离的影响结果见表1（表中t1为第1个对映体峰的保留时间；t2为第2个对映体峰的保留时间，下同）。
特非那定和马来酸非尼拉敏对映体在未加入二乙胺时其色谱峰峰形严重拖尾且未实现分离（α=1，R=0），当在流动相中加入0.1%二乙胺后，特非那定对映体的α为1.30、R为1.03，马来酸非尼拉敏对映体的α为1.12、R为0.79，均实现了部分分离。因此，在特非那定和马来酸非尼拉敏对映体分离流动相中加入0.1%二乙胺可改善其对映体的分离。
2.3.2 有机改性剂的种类对分离的影响 以正己烷为基础溶剂，按“2.1”项下色谱条件，考察流动相中有机改性剂种类（乙醇和异丙醇）对盐酸西替利嗪、盐酸异丙嗪、特非那定和马来酸非尼拉敏对映体分离的影响，有机改性剂种类对4种药物对映体的分离影响结果见表2。
由表2可知，对于盐酸西替利嗪和盐酸异丙嗪对映体，使用乙醇作为有机改性剂时α和R更大，因此，选择正己烷-乙醇作为分离盐酸西替利嗪和盐酸异丙嗪对映体的流动相；对于特非那定和马来酸非尼拉敏对映体，当以异丙醇为有机改性剂时，手性固定相对这两种药物均没有选择性，两种药物不能被分离。当使用乙醇为有机改性劑，特非那定对映体的R由0增加为1.03，马来酸非尼拉敏对映体的R由0增加为0.79，两种药物的分离均得到明显改善，因此，选择正己烷-乙醇-0.1%二乙胺作为分离特非那定和马来酸非尼拉敏对映体的流动相。 2.3.3 有机改性剂的占比对分离的影响 根据上述试验结果，按“2.1”项下色谱条件，考察流动相中乙醇占比对盐酸西替利嗪、盐酸异丙嗪（5%、10%、15%、20%），特非那定和马来酸非尼拉敏（2%、5%、8%、10%）对映体分离的影响，结果见表3。
从表3中可知，随着乙醇占比的降低，4种药物的出峰时间均延长。当分离盐酸西替利嗪对映体的乙醇占比从20%降低到5%时，其α和R均逐渐增加；但乙醇占比为5%时，出峰时间长且峰宽明显增加；因此，选择10%乙醇占比来分离盐酸西替利嗪对映体。盐酸异丙嗪对映体在乙醇占比为10%时，α和R达到最大；因此，选择10%乙醇占比来分离盐酸异丙嗪对映体。特非那定和马来酸非尼拉敏对映体分离的情况略有不同。随着乙醇占比的降低，这2种药物的选择因子呈现先增大后减小的趋势。特非那定对映体在乙醇占比为10%时，分离度最大（R=1.03）；因此，选择10%乙醇占比来分离特非那定对映体。马来酸非尼拉敏对映体在乙醇占比为2%时，分离度最大（R=1.09）。因此，选择2%乙醇占比来分离马来酸非尼拉敏对映体。
2.3.4 甲醇对分离的影响 在“2.3.3”项试验结果基础上，特非那定对映体的R=1.03，马来酸非尼拉敏对映体的R=1.09，均小于1.5，故继续优化分离条件，以实现完全分离。据有关文献报道[10]，甲醇的加入有利于对映体的拆分。因此，尝试在特非那定和马来酸非尼拉敏对映体分离的流动相中加入甲醇。结果显示，特非那定对映体在正己烷-甲醇-乙醇-二乙胺体积比为89 ∶ 9.9 ∶ 1 ∶ 0.1的条件下，获得了最大分离度（R=1.56）；马来酸非尼拉敏对映体在正己烷-乙醇-甲醇-二乙胺体积比为 98 ∶ 2 ∶ 0.5 ∶ 0.1时，获得了最大分离度（R=1.61）。两种药物均达到了完全分离。
2.4 系统适用性考察
精密吸取“2.2”项下各药物的对照品溶液和供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件和“2.3”项下优化后的各药流动相组成，进样分析。结果显示，盐酸西替利嗪、盐酸异丙嗪、特非那定和马来酸非尼拉敏对照品溶液的R分别为4.29、3.67、1.56和1.68，4种药物对照品溶液的高效液相色谱图详见图1。盐酸西替利嗪、盐酸异丙嗪、特非那定和马来酸非尼拉敏供试品溶液的分离度分别为4.36、3.76、1.55和1.71，4种药物供试品溶液的高效液相色谱图详见图2。
2.5 对映体洗脱顺序的考察
准确预測对映异构体在高效液相色谱中的洗脱顺序对于手性药物的定性和定量分析具有重要意义。因此，笔者以盐酸西替利嗪为例，考察盐酸西替利嗪对映体的洗脱顺序。精密吸取“2.2.1”项下盐酸西替利嗪对照品溶液和“2.2.3” 左旋盐酸西替利嗪溶液，按“2.1”项色谱条件和“2.3”项下优化后的各流动相组成，进样分析。结果显示，右旋盐酸西替利嗪先被洗脱下来，左旋盐酸西替利嗪后被洗脱下来，两对映体分离情况详见图3。
3 讨论
本文使用的Chiralcel OJ-H手性色谱柱固定相是由硅胶载体涂覆纤维素-3（4-甲基苯甲酸酯）制备而成，根据“三点相互作用”原理[11]，固定相上的羰基可以与对映体中的羟基、氨基形成氢键，与具有羰基的对映体发生偶极-偶极相互作用，与带有羟基或氨基的对映体则可通过氢键发生作用；固定相上的甲基是供电子基团，引入甲基可使苯环上的电子云密度增强，使得C=O基团上的电子云密度加大，从而加强了固定相与对映体之间的相互作用。盐酸西替利嗪、盐酸异丙嗪、特非那定和马来酸非尼拉敏的化学结构中均含有苯环、氨基或羟基等基团，可与固定相的苯基之间还能形成π-π相互作用，从而实现了4种H1受体拮抗药的对映体分离。
根据本研究结果可知，盐酸西替利嗪和盐酸异丙嗪对映体分离效果较好。这是由于在盐酸西替利嗪的分子结构中，手性碳分别与2个苯环和1个哌嗪基相连，与固定相的苯基之间能产生较强的π-π作用；在盐酸异丙嗪的分子中，手性碳原子不仅与氨基相连，还能与固定相产生氢键作用；同时，手性碳原子上还连有吩噻嗪基，能与固定相的苯环产生π-π作用，故使得该手性固定相对盐酸异丙嗪具有较强的对映体选择性。由特非那丁和马来酸非尼拉敏的结构式可知，特非那定手性碳原子的α位仅连有1个苯环，与盐酸异丙嗪和盐酸西替利嗪相比，其与固定相的苯环产生的π-π作用较小；且由于其结构式中有较大的空间位阻，减小了分子与固定相之间空间适应性，而在马来酸非尼拉敏的手性碳原子的β位连有叔胺基团，形成空间位阻，使得该固定相对特非那定和马来酸非尼拉敏的手性选择性较小。
综上所述，本试验建立的方法简单、快速，且分离效果好，不仅能够拓展纤维素涂覆型手性固定相的应用范围，还可作为盐酸西替利嗪、盐酸异丙嗪、特非那定和马来酸非尼拉敏对映体分离的新方法，并在立体选择性代谢研究、手性药物质量控制等方面具有一定的参考价值。
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（收稿日期：2018-08-14 修回日期：2018-10-10）
（编辑：唐晓莲）