论文部分内容阅读
摘要：目的：研究饮食和运动干预对高脂饮食性肥胖大鼠左心室心肌胶原纤维的影响，并对其可能的机制进行探讨。方法：将3周龄SD健康雄性大鼠随机分为正常组和高脂饮食组，后者在第8周时选取体重超出正常对照组平均体重20%的大鼠为肥胖大鼠，再分为肥胖对照组、饮食干预组与运动和饮食联合干预组，第16周时处死。用逆转录聚合酶链式反应（RT—PCR）法测定心肌AT1RmRNA表达；免疫组化法测定心肌ACE蛋白的表达；采用放射免疫法测定心肌组织中AngⅡ的含量；采用羟脯氨酸法测定心肌胶原含量；苦味酸—天狼星红染色大鼠心脏切片，并用医学图像分析系统检测大鼠左心室心肌胶原容积分数。结果：肥胖大鼠存在严重的血脂紊乱，心肌胶原含量、心肌组织AngⅡ含量、AT1RmRNA、ACE蛋白表达显著增加；饮食干预组大鼠血脂紊乱程度减轻，心肌胶原含量、心肌组织AngⅡ的含量、AT1RmRNA和ACE蛋白表达均有降低；运动和饮食联合干预组大鼠体重下降显著，心肌胶原含量、心肌组织AngⅡ的含量、AT1RmRNA、ACE蛋白表达下降更显著。结论：高脂饮食性肥胖大鼠存在心肌胶原纤维过度堆积的现象，并与心肌组织AngⅡ的含量、ACE、AT1RmRNA的表达改变有关。单纯性饮食疗法可以减缓心肌纤维化程度和进展，饮食和运动联合干预可以使心肌纤维化早期良性逆转。
关键词：干预性研究；肥胖；心肌胶原纤维；大鼠
中图分类号：G804.7 文献标识码：A 文章编号：1006—2076（2012）03—0055—05
Abstract：Objective：The purpuse of this study is to probe into the influence of diet and exercise training on myocardial interstitium remodeling in high—lipid diet rats， discussing possible mechanism.Method：SD rats （3 weeks old） were divided into the normal group and the high—lipid diet group randomly， 8 weeks later， fat rats （weight over 20% comparing with the average of normal group）
收稿日期：2011—06—29
基金项目：国家自然科学基金资助项目“运动和营养干预大鼠FTO基因表达在预防成年肥胖中的作用研究”（No.31160218）。
作者简介：陈平（1983— ），男，湖北郧县人，助教，研究方向体育保健与运动营养。
作者单位：1.吕梁学院体育系，山西 吕梁 033000；2.新疆师范大学体育学院，新疆 乌鲁木齐 830000；3.北京体育大学研究生院，北京 100084
1.Inst.of PE，Luliang College，Luliang 033000；2.Inst.of PE，Xinjiang Normal University，Urumqi 930000；3.School of Graduate，Beijing Sport University，Beijing 100084，China
were selected from the high—lipid diet group. Then fat rats were divided into 3 groups randomly：obese control group，diet intervention group and diet combined with exercise intervention groups. The fat rats were dead at the end of 16th week. Myocardial AT1RmRNA expression was determined by reverse transcriptase polymerase chain reaction（RT—PCR）；Radioimmunoassay measured myocardial tissue in Ang II Contents， Myocardial collagen content was measured by biochemical method； Collagen of the heart was stained by picric acid—sirius red； Myocardial ACE was determined by immunohistochemical method.Result：Lipids disorder，myocardial collagen content increase， AT1R—mRNA，AT1R and Ang II Contents expression growth happened in rats of obese control group. The degree of lipids disorder alleviated in rats of diet intervention group. At the same time， myocardial collagen content， expression of AT1RmRNAand ACE reduced in rats of diet intervention group. The weight of rats in diet combined with exercise intervention groups declined obviously. Myocardial collagen content， expression of AT1RmRNAand ACE reduced more distinctly.Conclusion：myocardial interstitium remodeling happened in high—lipid diet rats， in connection with change of AT1RmRNA，ACE，Ang II Contents expression. Single diet intervention can slow the development， diet combined with exercise intervention can reverse benignly myocardial interstitium remodeling in early time. Key words：intervention research； fat； myocardial remodeling； rats
随着经济的快速发展，人们的生活水平不断的提高，饮食结构也发生了很大的改变，肥胖症呈增多的趋势。研究发现，诸多肥胖患者存在着心脏结构和功能的改变，如心室肥厚、心腔变小、心功能降低等。本实验通过高脂饮食喂养建立肥胖大鼠模型，并进行饮食和运动联合干预，观察大鼠心肌胶原纤维形态学、胶原含量、AngⅡ含量、AT1RmRNA和ACE蛋白表达的变化，探讨饮食和运动联合治疗对肥胖大鼠心肌胶原纤维的影响。
1 材料与方法
1.1 试验动物及分组
将44只3周龄SD健康雄性大鼠随机分为2组：正常组8只，断乳后给予普通饲料喂养，在第8周时选取体重超出正常对照组平均体重为20%的大鼠24只，再随机分为肥胖对照组、饮食干预组和饮食与运动联合干预组，其中肥胖对照组继续给予高脂饲料喂养，饮食干预组改为普通饲料喂养，饮食和运动联合干预组不仅改为普通饲料喂养，每天采用无负重游泳运动1 h，每周5 d。所有大鼠均在实验第16周时处死。
山东体育学院学报
第28卷第3期
2012年6月 陈 平，等 饮食和运动干预对高脂饮食性肥胖大鼠心室肌胶原纤维的影响及可能机制探析
No.3 2012 普通饲料构成为常规配方。而高脂肪饲料配方如下：每100 g普通饲料中加入全脂奶粉15 g，猪油5 g，黄肚豆15 g，鸡蛋黄50 g，鱼肝油10滴，牛胆酸纳0.5 g[3]。大鼠自由饮食摄食，自然昼夜采光。
1.2 标本的采集
隔夜禁食后将大鼠称重（BW），麻醉，开胸取出心脏，剪除大血管，冰盐水冲洗，滤纸吸干水分，称心脏重量（HW），计算心脏重量指数（HBI）=[心脏重量（g）/体重（g）×l 000]；留取部分心肌置于—80℃冰箱保存，进行心肌胶原含量、AngⅡ含量、AT1RmRNA和ACE蛋白表达的测定。
1.3 血脂的测定
静脉自凝血离心后取上清，应用全自动生化分析仪测定总胆固醇（CHOL）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、极低密度脂蛋白和游离脂肪酸。
1.4 心肌胶原含量的测定
采用南京建成生物工程研究所所提够的羟脯氨酸测试盒（样本碱水解法）测得心肌组织羟脯氨酸含量。心肌胶原含量（CC）=羟脯氨酸/13.4%（mg/g心肌）。
1.5 心肌胶原纤维形态学观察及半定量分析
经固定的心肌组织，石蜡包埋，制片后，切片约5 um。常规脱蜡至水，0.1%饱和苦味酸天狼星红染色1小时，脱水、透明，中性树胶封片。制备好的切片用医学图像分析系统进行半定量分析：随机取4个视野，高倍镜下测量心室心肌胶原面积和统计场面积，用“心肌胶原容积分数（CVF）=左心室心肌胶原面积/统计场面积”来表示心室心肌胶原纤维分布情况。
1.6 逆转录聚合酶链式反应（RT—PCR）法测定心肌AT1RmRNA表达
1.6.1 总RNA的提取 总RNA的提取参照Trizol RNA提取试剂说明书的流程提取组织总RNA。
1.6.2 cDNA的合成及PCR扩增按照Promega公司M—MuLV Reverse Transcriptase说明书进行。
1.6.3 引物设计与合成 从NCBI的nucleotide中查得目的基因和内参照基因，联系上海博亚生物技术有限公司设计上下游引物。引物序列如下：ACE2上游序列：5’AAC ACC AAC ATT ACG GAG GAG 3’；ACE2下游序列：5’TGC TCT TGC CAT CTC ATT TT 3’；扩增片断长429bP。β—actin上游序列：5’GAA ATC GTG CGT GAC ATT A 3’；β—actin下游序列：5’TAG GAG CCA GGG CAG TAA 3’。扩增片断长349 bP。退火温度均为55.4℃。
1.6.4 PCR扩增产物半定量分析PCR扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统（美国BIO—RAD公司）扫描采图，用Quantity—one软件进行图像分析和半定量分析，结果以特异的DNA条带的灰度值与内参β—actin的DNA条带的灰度值之比表示。
1.7 心肌组织ACE蛋白表达的检测
采用免疫组化SABC法，DAB棕黄色反应呈色。实验操作步骤参照实际和进行，并设立阴性对照组。阳性标准胞膜或胞浆染成棕黄色。对表达结果进行半定量分析：应用成都金盘病理多媒体图像分析系统计算每个视野中阳性表达面积占整个视野面积的比值。
1.8 心肌组织血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）含量的测定
采用放射免疫分析法。具体操作步骤参照AngⅡ放射免疫分析试剂盒（北京博奥森试剂有限公司）说明书进行。
1.9 统计学方法
采用SPSS 10.0软件分析，全部数据均以均数±标准差（±SD）表示，各组间均数比较采用单因素方差分析（one—way ANOVA），选择Homogeneity—of—variance显示方差齐性，选择Turkey比较各组间差异，P<0.05表示组间差异具有显著性。
2 结果
2.1 血脂的改变
与正常组对比，肥胖对照组大鼠CHOL、TG、LDL、VLDL显著升高，HDL明显降低；在饮食干预组和饮食与运动联合干预组上述指标显著的改善，除CHOL仍明显高于正常组外，其余指标接近于正常，且此两组之间差异具有显著性。联合干预组大鼠TG明显低于肥胖对照组。
2.2 体重、心脏重量及心脏重量指数的比较
与正常对照组比较，肥胖对照组大鼠体重、心重明显增加，心脏重量指数无显著的变化；饮食干预组大鼠体重、心重显著低于肥胖对照组；联合干预组体重下降更明显，而心脏重量高于正常组和肥胖对照组，心脏重量指数明显高于其他各组。 2.3 心肌胶原含量的变化
与正常组相比，肥胖对照组大鼠的心肌胶原含量显著增加，饮食干预组轻度下降，联合干预组下降明显，但与正常组比较，饮食干预组差异没有统计学意义。
2.4 心肌胶原纤维形态学的变化
正常组大鼠心肌胶原纤维分布均匀，对心肌实质细胞起到了很好的连接、支持和保护作用；与正常组相比，肥胖对照组大鼠心肌胶原纤维明显增多、粗大呈束，有过度增生的现象，并且分布紊乱，部分胶原纤维甚至插入肌纤维中，形成心室肌纤维化；饮食干预组大鼠心室肌胶原纤维较肥胖对照组大鼠降低，胶原纤维的过度增生和纤维化现象明显减轻；饮食与运动联合干预组大鼠较肥胖组大鼠心室肌胶原纤维下降更显著，心肌胶原纤维表现出与正常组几乎相同的分布规律。
2.5 心肌组织ACE蛋白表达
与正常组相比，肥胖对照组大鼠ACE蛋白表达明显增高，可见到大量的阳性细胞表达，饮食干预组和饮食与运动联合干预组大鼠ACE蛋白表达明显降低，其中联合干预组下降更显著。
2.6 心肌AT1RmRNA的表达
与正常组相比，肥胖对照组大鼠AT1RmRNA表达明显增高，灰度值明显高于对照组，饮食干预组和联合干预组大鼠下降显著，其中联合干预组下降更显著
心肌AT1RmRNA的表达。
以100 bpDNALadder的Marker为标志，于441bp，349bp处可见扩增产物条带，分别为心肌AT1R基因及其β–actin内参基因片段。各基因的RT—PCR产物电泳条带的位置与理论值相符。
和正常组比较，肥胖对照组大鼠心脏AT1RmRNA的表达显著升高（P<0.05）。饮食干预组大鼠AT1Rm
RNA的表达显著降低（P<0.05），而联合干预组心脏AT1RmRNA的表达降低更显著（P<0.01）。
2.7 心肌组织AngⅡ含量
与正常组相比，肥胖对照组大鼠心肌组织AngⅡ含量显著升高（P<0.05）；在饮食干预组和饮食与运动联合干预组心肌组织AngⅡ含量显著降低（P<0.05），其中联合干预组大鼠心肌组织AngⅡ含量下降更显著（P<0.01）。
3 讨论
心肌组织包括心肌细胞和非心肌细胞（心肌间质），非心肌细胞又主要包括成纤维母细胞、血管平滑肌细胞和内皮细胞，心肌细胞与非心肌细胞通过结缔组织和细胞外基质相互连接。细胞外基质成分包括胶原、蛋白多糖、糖蛋白、肽生长因子及蛋白酶。心肌间质的主要成分是由心肌间隙中成纤维母细胞产生和分泌的胶原纤维组成。研究表明，心的功能不仅取决于心肌本身的收缩功能，同时与心肌细胞外间质成分（ EMG） ，特别是心肌胶原纤维有密切的联系，其不仅具有支持、连接作用，而且在协调心肌力的传递、营养物质的输送、信息的传导等方面都起着非常重要的作用。它与心肌细胞共同维持着心脏结构和功能的完整性。心肌胶原含量、生化分型和形态的变化，是心脏在不同条件下产生的一种适应性或（和）代偿性生理、病理变化。研究表明，在病理刺激因素作用下，心肌成纤维细胞大量增殖，胶原纤维粗大呈束、呈波浪状、框格型广泛分布，成团成块堆积，心肌的僵硬度升高、顺应性降低，心功能下降。
本实验给予高脂膳食喂养SD大鼠建立肥胖动物模型，发现肥胖大鼠不仅存在严重的血脂紊乱，同时发现心肌胶原纤维明显增多、粗大呈束，有过度增生的现象，并且分布紊乱，部分胶原纤维甚至插入肌纤维中，并且心肌胶原容积分数、胶原含量显著增加，存在心肌纤维化现象。通过控制食谱、控制食谱联合有氧运动对高脂饮食性肥胖大鼠进行干预，发现大鼠血脂紊乱程度显著下降、心肌组织中胶原沉积下降，胶原容积分数降低，其中饮食干预联合运动则使体重下降更明显，接近于正常，而心脏重量增加，心脏重量指数升高，心肌胶原含量、心肌胶原容积分数显著下降，提示控制饮食和运动是治疗单纯性肥胖的主要措施。
而胶原纤维的变化又涉及一系列的调控因素，肾素—血管紧张素系统（RAS）在心脏局部是独立的系统，它是以心肌细胞局部自分泌、旁分泌和胞内分泌为形式；以肾素、血管紧张素原、血管紧张素转换酶（ACE）、 AngⅡ及其受体为物质基础的一个独立的系统，是心血管细胞生长、增殖和功能调控的一个重要的调节系统。而在RAS系统当中，AngⅡ是最重要的活性介质，其通过与体内细胞膜上的相应受体结合发挥作用，从而产生生物学效应；而AngⅡ发挥生物学效应主要是通过AT1R的介导，从而促进心肌细胞的增生和心肌成纤维细胞的增殖，进而影响到胶原纤维的重塑。
于学军等研究发现，SHR心肌心肌组织内ACE活性明显升高，且与代表心肌间质纤维化的参数同步变化。进一步的研究发现，利用ACE抑制剂西拉普利抑制ACE的活性后，代表左心室心肌肥厚及心肌纤维化的指标的参数恢复至对照组水平，提示心肌间质纤维化的发生可能与ACE的增生有关。Paradis等研究发现，AT1R过度表达的转基因大鼠可发生心肌重构，提示AngⅡ通过AT1R可直接诱导心肌重构的发生。
本实验研究结果显示，肥胖组大鼠ACE、AT1RmRNA的表达、AngⅡ的含量均高于正常对照组，提示肥胖大鼠心肌组织中ACE、AT1RmRNA、AngⅡ的含量的高表达可能是肥胖大鼠心肌中胶原过度沉积的原因之一，而饮食干预组大鼠和联合干预组大鼠的ACE、AT1R的表达明显低于对照组，提示饮食干预和运动联合干预在一定程度上通过下调大鼠心肌组织中ACE、AT1RmRNA、AngⅡ含量的表达来抑制心肌胶原纤维的增生和胶原的沉积。
以上研究表明，单纯限制高脂摄入也可以减缓肥胖大鼠的肥胖进展，从而减轻心肌胶原含量的沉积以及胶原纤维的堆积，并进一步减轻其对心功能的不利影响；饮食与运动联合干预则进一步减轻其肥胖度。本研究结果发现，饮食与运动联合干预组大鼠心脏重量指数较正常组和饮食干预组显著升高，胶原含量、胶原容积分数略有升高，胶原纤维增粗，存在心脏肥大的现象。但是，这一改变与肥胖所致的心脏肥大有明显的不同：肥胖使心肌细胞和间质胶原不成比例增长，造成胶原纤维过度增生，增加心肌的僵硬度，降低心肌的顺应性，从而导致心肌的舒张功能障碍；运动则使心肌细胞和间质胶原协调增长，使心肌结构朝增加能量供应和收缩能力储备的方向发展，心脏的舒缩功能进一步提高，在更大程度上满足机体的需要，为适应心肌肥厚。饮食和运动联合干预以后大鼠心肌胶原含量并没有显著变化，说明心肌间质胶原增多并未引起过多聚积造成心肌间质纤维化，其增加与心肌细胞运动性肥大相一致。 综上所述，高脂饮食性肥胖大鼠心脏重量及心脏重量指数增加，心肌胶原含量增多，心肌胶原容积分数增高，心肌胶原纤维明显堆积，存在心肌纤维化现象，并与AngⅡ的含量、AT1RmRNA、ACE的表达水平升高有关。单纯饮食疗法可减缓心肌纤维化的进展，饮食与运动联合干预可使心肌纤维化早期发生良性逆转。但饮食疗法和饮食与运动联合干预具体经什么途径抑制AngⅡ的含量、AT1RmRNA、ACE蛋白的表达，从而减缓心肌纤维化的程度，目前尚不清楚，有待于进一步深入研究。
参考文献：
[1]Daniels SR.Obesity in the pediatric patient：cardiovascular compications[J].Prog Pediol Cardiol，2001，12（2）： 161—167.
[2]李倩，汪翼，李燕，等.饮食和运动干预对高脂饮食性肥胖大鼠心肌间质重构及MMP—2活性的影响[J].临床儿科杂志，2009，27（1）：72—76.
[3]李世称，邵雄杰，刘军，等.运动对肥胖大鼠脂肪细胞脂联素mRNA表达的影响[J].西安体育学院学报，2009，26（2）：206—213.
[4]刘玉梅，王保和.心室重构时心肌胶原纤维的变化及基质金属蛋白酶对其的影响[J].中国康复，2007，22（3）：208—209.
[5]赵冰，马玉峰，宋高晴.心肌胶原纤维的作用及对心脏机能的影响[J].武汉体育学院学报，2006，40（1）：177—181.
[6]黎文，王远虹. 大鼠缺血再灌注心肌间质胶原含量和形态学变化的定量研究[J].现代中西医结合杂志，2004，20（20）：543—558.
[7]汪祥海，伍卫，杨军，等. Rho激酶在血管紧张素Ⅱ刺激大鼠心肌成纤维细胞增殖和胶原合成中的作用[J].中国病理生理杂志，2007，6（3）：123—127.
[8]郑澜，潘珊珊.心肌局部RAS与运动心脏重塑的关系[J].上海体育学院学报，2000，24（3）：33—36.
[9]Tian B，et al.AngⅡstimulates the syntheses of DNA，RNA，protein and collagen in isolated cardiomycytes and cultured cardiac fibroblasts from hyperophied rat heart.Chin J pathophysiol，1995，11（5）：450—453.
[10]Suzuki j，et al. Rat angiotensinⅡ（typeiA） receptor mRNA regulation and subtype expression in myocardial growth and hypertrophy[J].Circulation Research，1993，73（3）：439—447.
[11]王巍巍，张金元，陈劲.丹参对马兜铃酸肾损害大鼠肾组织病理学改变及ACE、ACE2表达的影响[J].中国中西医结合肾病杂志，2009，10（2）：109—116.
[12]于学军，何作云，戚文航.心肌组织内血管紧张素转换酶活性的变化及西拉普利的作用[J]. 高血压杂志，2010，9（3）：256—262.
[13] Phatharajaree W ，Phrommintikul A，Chattipakom N.Matrix metalloproteinases and myocardial infarction [J].Can J Cardiol，2007，23（9）：727—733.
[14]赵斌，文小军. 不同运动负荷对大鼠心肌胶原纤维的影响[J].新乡医学院学报，2005，22（2）：177—181.
[15]马宇峰.不同运动负荷大鼠心肌胶原纤维的组织学变化[J].山东体育学院学报，2005，21（5）：57—61.
[16]Paul Poirier，MD， PhD， FCRPC；，Thomas D. Obesity and Cardiovascular Disease：Pathophysiol—ogy， Evaluation， and Effect of Weight Loss[J].Circulation， 2010，51（8）： 2405—2412.第28卷第3期2012年6月
山东体育学院学报Journal of Shandong Institute of Physical Education and Sports
关键词：干预性研究；肥胖；心肌胶原纤维；大鼠
中图分类号：G804.7 文献标识码：A 文章编号：1006—2076（2012）03—0055—05
Abstract：Objective：The purpuse of this study is to probe into the influence of diet and exercise training on myocardial interstitium remodeling in high—lipid diet rats， discussing possible mechanism.Method：SD rats （3 weeks old） were divided into the normal group and the high—lipid diet group randomly， 8 weeks later， fat rats （weight over 20% comparing with the average of normal group）
收稿日期：2011—06—29
基金项目：国家自然科学基金资助项目“运动和营养干预大鼠FTO基因表达在预防成年肥胖中的作用研究”（No.31160218）。
作者简介：陈平（1983— ），男，湖北郧县人，助教，研究方向体育保健与运动营养。
作者单位：1.吕梁学院体育系，山西 吕梁 033000；2.新疆师范大学体育学院，新疆 乌鲁木齐 830000；3.北京体育大学研究生院，北京 100084
1.Inst.of PE，Luliang College，Luliang 033000；2.Inst.of PE，Xinjiang Normal University，Urumqi 930000；3.School of Graduate，Beijing Sport University，Beijing 100084，China
were selected from the high—lipid diet group. Then fat rats were divided into 3 groups randomly：obese control group，diet intervention group and diet combined with exercise intervention groups. The fat rats were dead at the end of 16th week. Myocardial AT1RmRNA expression was determined by reverse transcriptase polymerase chain reaction（RT—PCR）；Radioimmunoassay measured myocardial tissue in Ang II Contents， Myocardial collagen content was measured by biochemical method； Collagen of the heart was stained by picric acid—sirius red； Myocardial ACE was determined by immunohistochemical method.Result：Lipids disorder，myocardial collagen content increase， AT1R—mRNA，AT1R and Ang II Contents expression growth happened in rats of obese control group. The degree of lipids disorder alleviated in rats of diet intervention group. At the same time， myocardial collagen content， expression of AT1RmRNAand ACE reduced in rats of diet intervention group. The weight of rats in diet combined with exercise intervention groups declined obviously. Myocardial collagen content， expression of AT1RmRNAand ACE reduced more distinctly.Conclusion：myocardial interstitium remodeling happened in high—lipid diet rats， in connection with change of AT1RmRNA，ACE，Ang II Contents expression. Single diet intervention can slow the development， diet combined with exercise intervention can reverse benignly myocardial interstitium remodeling in early time. Key words：intervention research； fat； myocardial remodeling； rats
随着经济的快速发展，人们的生活水平不断的提高，饮食结构也发生了很大的改变，肥胖症呈增多的趋势。研究发现，诸多肥胖患者存在着心脏结构和功能的改变，如心室肥厚、心腔变小、心功能降低等。本实验通过高脂饮食喂养建立肥胖大鼠模型，并进行饮食和运动联合干预，观察大鼠心肌胶原纤维形态学、胶原含量、AngⅡ含量、AT1RmRNA和ACE蛋白表达的变化，探讨饮食和运动联合治疗对肥胖大鼠心肌胶原纤维的影响。
1 材料与方法
1.1 试验动物及分组
将44只3周龄SD健康雄性大鼠随机分为2组：正常组8只，断乳后给予普通饲料喂养，在第8周时选取体重超出正常对照组平均体重为20%的大鼠24只，再随机分为肥胖对照组、饮食干预组和饮食与运动联合干预组，其中肥胖对照组继续给予高脂饲料喂养，饮食干预组改为普通饲料喂养，饮食和运动联合干预组不仅改为普通饲料喂养，每天采用无负重游泳运动1 h，每周5 d。所有大鼠均在实验第16周时处死。
山东体育学院学报
第28卷第3期
2012年6月 陈 平，等 饮食和运动干预对高脂饮食性肥胖大鼠心室肌胶原纤维的影响及可能机制探析
No.3 2012 普通饲料构成为常规配方。而高脂肪饲料配方如下：每100 g普通饲料中加入全脂奶粉15 g，猪油5 g，黄肚豆15 g，鸡蛋黄50 g，鱼肝油10滴，牛胆酸纳0.5 g[3]。大鼠自由饮食摄食，自然昼夜采光。
1.2 标本的采集
隔夜禁食后将大鼠称重（BW），麻醉，开胸取出心脏，剪除大血管，冰盐水冲洗，滤纸吸干水分，称心脏重量（HW），计算心脏重量指数（HBI）=[心脏重量（g）/体重（g）×l 000]；留取部分心肌置于—80℃冰箱保存，进行心肌胶原含量、AngⅡ含量、AT1RmRNA和ACE蛋白表达的测定。
1.3 血脂的测定
静脉自凝血离心后取上清，应用全自动生化分析仪测定总胆固醇（CHOL）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、极低密度脂蛋白和游离脂肪酸。
1.4 心肌胶原含量的测定
采用南京建成生物工程研究所所提够的羟脯氨酸测试盒（样本碱水解法）测得心肌组织羟脯氨酸含量。心肌胶原含量（CC）=羟脯氨酸/13.4%（mg/g心肌）。
1.5 心肌胶原纤维形态学观察及半定量分析
经固定的心肌组织，石蜡包埋，制片后，切片约5 um。常规脱蜡至水，0.1%饱和苦味酸天狼星红染色1小时，脱水、透明，中性树胶封片。制备好的切片用医学图像分析系统进行半定量分析：随机取4个视野，高倍镜下测量心室心肌胶原面积和统计场面积，用“心肌胶原容积分数（CVF）=左心室心肌胶原面积/统计场面积”来表示心室心肌胶原纤维分布情况。
1.6 逆转录聚合酶链式反应（RT—PCR）法测定心肌AT1RmRNA表达
1.6.1 总RNA的提取 总RNA的提取参照Trizol RNA提取试剂说明书的流程提取组织总RNA。
1.6.2 cDNA的合成及PCR扩增按照Promega公司M—MuLV Reverse Transcriptase说明书进行。
1.6.3 引物设计与合成 从NCBI的nucleotide中查得目的基因和内参照基因，联系上海博亚生物技术有限公司设计上下游引物。引物序列如下：ACE2上游序列：5’AAC ACC AAC ATT ACG GAG GAG 3’；ACE2下游序列：5’TGC TCT TGC CAT CTC ATT TT 3’；扩增片断长429bP。β—actin上游序列：5’GAA ATC GTG CGT GAC ATT A 3’；β—actin下游序列：5’TAG GAG CCA GGG CAG TAA 3’。扩增片断长349 bP。退火温度均为55.4℃。
1.6.4 PCR扩增产物半定量分析PCR扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统（美国BIO—RAD公司）扫描采图，用Quantity—one软件进行图像分析和半定量分析，结果以特异的DNA条带的灰度值与内参β—actin的DNA条带的灰度值之比表示。
1.7 心肌组织ACE蛋白表达的检测
采用免疫组化SABC法，DAB棕黄色反应呈色。实验操作步骤参照实际和进行，并设立阴性对照组。阳性标准胞膜或胞浆染成棕黄色。对表达结果进行半定量分析：应用成都金盘病理多媒体图像分析系统计算每个视野中阳性表达面积占整个视野面积的比值。
1.8 心肌组织血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）含量的测定
采用放射免疫分析法。具体操作步骤参照AngⅡ放射免疫分析试剂盒（北京博奥森试剂有限公司）说明书进行。
1.9 统计学方法
采用SPSS 10.0软件分析，全部数据均以均数±标准差（±SD）表示，各组间均数比较采用单因素方差分析（one—way ANOVA），选择Homogeneity—of—variance显示方差齐性，选择Turkey比较各组间差异，P<0.05表示组间差异具有显著性。
2 结果
2.1 血脂的改变
与正常组对比，肥胖对照组大鼠CHOL、TG、LDL、VLDL显著升高，HDL明显降低；在饮食干预组和饮食与运动联合干预组上述指标显著的改善，除CHOL仍明显高于正常组外，其余指标接近于正常，且此两组之间差异具有显著性。联合干预组大鼠TG明显低于肥胖对照组。
2.2 体重、心脏重量及心脏重量指数的比较
与正常对照组比较，肥胖对照组大鼠体重、心重明显增加，心脏重量指数无显著的变化；饮食干预组大鼠体重、心重显著低于肥胖对照组；联合干预组体重下降更明显，而心脏重量高于正常组和肥胖对照组，心脏重量指数明显高于其他各组。 2.3 心肌胶原含量的变化
与正常组相比，肥胖对照组大鼠的心肌胶原含量显著增加，饮食干预组轻度下降，联合干预组下降明显，但与正常组比较，饮食干预组差异没有统计学意义。
2.4 心肌胶原纤维形态学的变化
正常组大鼠心肌胶原纤维分布均匀，对心肌实质细胞起到了很好的连接、支持和保护作用；与正常组相比，肥胖对照组大鼠心肌胶原纤维明显增多、粗大呈束，有过度增生的现象，并且分布紊乱，部分胶原纤维甚至插入肌纤维中，形成心室肌纤维化；饮食干预组大鼠心室肌胶原纤维较肥胖对照组大鼠降低，胶原纤维的过度增生和纤维化现象明显减轻；饮食与运动联合干预组大鼠较肥胖组大鼠心室肌胶原纤维下降更显著，心肌胶原纤维表现出与正常组几乎相同的分布规律。
2.5 心肌组织ACE蛋白表达
与正常组相比，肥胖对照组大鼠ACE蛋白表达明显增高，可见到大量的阳性细胞表达，饮食干预组和饮食与运动联合干预组大鼠ACE蛋白表达明显降低，其中联合干预组下降更显著。
2.6 心肌AT1RmRNA的表达
与正常组相比，肥胖对照组大鼠AT1RmRNA表达明显增高，灰度值明显高于对照组，饮食干预组和联合干预组大鼠下降显著，其中联合干预组下降更显著
心肌AT1RmRNA的表达。
以100 bpDNALadder的Marker为标志，于441bp，349bp处可见扩增产物条带，分别为心肌AT1R基因及其β–actin内参基因片段。各基因的RT—PCR产物电泳条带的位置与理论值相符。
和正常组比较，肥胖对照组大鼠心脏AT1RmRNA的表达显著升高（P<0.05）。饮食干预组大鼠AT1Rm
RNA的表达显著降低（P<0.05），而联合干预组心脏AT1RmRNA的表达降低更显著（P<0.01）。
2.7 心肌组织AngⅡ含量
与正常组相比，肥胖对照组大鼠心肌组织AngⅡ含量显著升高（P<0.05）；在饮食干预组和饮食与运动联合干预组心肌组织AngⅡ含量显著降低（P<0.05），其中联合干预组大鼠心肌组织AngⅡ含量下降更显著（P<0.01）。
3 讨论
心肌组织包括心肌细胞和非心肌细胞（心肌间质），非心肌细胞又主要包括成纤维母细胞、血管平滑肌细胞和内皮细胞，心肌细胞与非心肌细胞通过结缔组织和细胞外基质相互连接。细胞外基质成分包括胶原、蛋白多糖、糖蛋白、肽生长因子及蛋白酶。心肌间质的主要成分是由心肌间隙中成纤维母细胞产生和分泌的胶原纤维组成。研究表明，心的功能不仅取决于心肌本身的收缩功能，同时与心肌细胞外间质成分（ EMG） ，特别是心肌胶原纤维有密切的联系，其不仅具有支持、连接作用，而且在协调心肌力的传递、营养物质的输送、信息的传导等方面都起着非常重要的作用。它与心肌细胞共同维持着心脏结构和功能的完整性。心肌胶原含量、生化分型和形态的变化，是心脏在不同条件下产生的一种适应性或（和）代偿性生理、病理变化。研究表明，在病理刺激因素作用下，心肌成纤维细胞大量增殖，胶原纤维粗大呈束、呈波浪状、框格型广泛分布，成团成块堆积，心肌的僵硬度升高、顺应性降低，心功能下降。
本实验给予高脂膳食喂养SD大鼠建立肥胖动物模型，发现肥胖大鼠不仅存在严重的血脂紊乱，同时发现心肌胶原纤维明显增多、粗大呈束，有过度增生的现象，并且分布紊乱，部分胶原纤维甚至插入肌纤维中，并且心肌胶原容积分数、胶原含量显著增加，存在心肌纤维化现象。通过控制食谱、控制食谱联合有氧运动对高脂饮食性肥胖大鼠进行干预，发现大鼠血脂紊乱程度显著下降、心肌组织中胶原沉积下降，胶原容积分数降低，其中饮食干预联合运动则使体重下降更明显，接近于正常，而心脏重量增加，心脏重量指数升高，心肌胶原含量、心肌胶原容积分数显著下降，提示控制饮食和运动是治疗单纯性肥胖的主要措施。
而胶原纤维的变化又涉及一系列的调控因素，肾素—血管紧张素系统（RAS）在心脏局部是独立的系统，它是以心肌细胞局部自分泌、旁分泌和胞内分泌为形式；以肾素、血管紧张素原、血管紧张素转换酶（ACE）、 AngⅡ及其受体为物质基础的一个独立的系统，是心血管细胞生长、增殖和功能调控的一个重要的调节系统。而在RAS系统当中，AngⅡ是最重要的活性介质，其通过与体内细胞膜上的相应受体结合发挥作用，从而产生生物学效应；而AngⅡ发挥生物学效应主要是通过AT1R的介导，从而促进心肌细胞的增生和心肌成纤维细胞的增殖，进而影响到胶原纤维的重塑。
于学军等研究发现，SHR心肌心肌组织内ACE活性明显升高，且与代表心肌间质纤维化的参数同步变化。进一步的研究发现，利用ACE抑制剂西拉普利抑制ACE的活性后，代表左心室心肌肥厚及心肌纤维化的指标的参数恢复至对照组水平，提示心肌间质纤维化的发生可能与ACE的增生有关。Paradis等研究发现，AT1R过度表达的转基因大鼠可发生心肌重构，提示AngⅡ通过AT1R可直接诱导心肌重构的发生。
本实验研究结果显示，肥胖组大鼠ACE、AT1RmRNA的表达、AngⅡ的含量均高于正常对照组，提示肥胖大鼠心肌组织中ACE、AT1RmRNA、AngⅡ的含量的高表达可能是肥胖大鼠心肌中胶原过度沉积的原因之一，而饮食干预组大鼠和联合干预组大鼠的ACE、AT1R的表达明显低于对照组，提示饮食干预和运动联合干预在一定程度上通过下调大鼠心肌组织中ACE、AT1RmRNA、AngⅡ含量的表达来抑制心肌胶原纤维的增生和胶原的沉积。
以上研究表明，单纯限制高脂摄入也可以减缓肥胖大鼠的肥胖进展，从而减轻心肌胶原含量的沉积以及胶原纤维的堆积，并进一步减轻其对心功能的不利影响；饮食与运动联合干预则进一步减轻其肥胖度。本研究结果发现，饮食与运动联合干预组大鼠心脏重量指数较正常组和饮食干预组显著升高，胶原含量、胶原容积分数略有升高，胶原纤维增粗，存在心脏肥大的现象。但是，这一改变与肥胖所致的心脏肥大有明显的不同：肥胖使心肌细胞和间质胶原不成比例增长，造成胶原纤维过度增生，增加心肌的僵硬度，降低心肌的顺应性，从而导致心肌的舒张功能障碍；运动则使心肌细胞和间质胶原协调增长，使心肌结构朝增加能量供应和收缩能力储备的方向发展，心脏的舒缩功能进一步提高，在更大程度上满足机体的需要，为适应心肌肥厚。饮食和运动联合干预以后大鼠心肌胶原含量并没有显著变化，说明心肌间质胶原增多并未引起过多聚积造成心肌间质纤维化，其增加与心肌细胞运动性肥大相一致。 综上所述，高脂饮食性肥胖大鼠心脏重量及心脏重量指数增加，心肌胶原含量增多，心肌胶原容积分数增高，心肌胶原纤维明显堆积，存在心肌纤维化现象，并与AngⅡ的含量、AT1RmRNA、ACE的表达水平升高有关。单纯饮食疗法可减缓心肌纤维化的进展，饮食与运动联合干预可使心肌纤维化早期发生良性逆转。但饮食疗法和饮食与运动联合干预具体经什么途径抑制AngⅡ的含量、AT1RmRNA、ACE蛋白的表达，从而减缓心肌纤维化的程度，目前尚不清楚，有待于进一步深入研究。
参考文献：
[1]Daniels SR.Obesity in the pediatric patient：cardiovascular compications[J].Prog Pediol Cardiol，2001，12（2）： 161—167.
[2]李倩，汪翼，李燕，等.饮食和运动干预对高脂饮食性肥胖大鼠心肌间质重构及MMP—2活性的影响[J].临床儿科杂志，2009，27（1）：72—76.
[3]李世称，邵雄杰，刘军，等.运动对肥胖大鼠脂肪细胞脂联素mRNA表达的影响[J].西安体育学院学报，2009，26（2）：206—213.
[4]刘玉梅，王保和.心室重构时心肌胶原纤维的变化及基质金属蛋白酶对其的影响[J].中国康复，2007，22（3）：208—209.
[5]赵冰，马玉峰，宋高晴.心肌胶原纤维的作用及对心脏机能的影响[J].武汉体育学院学报，2006，40（1）：177—181.
[6]黎文，王远虹. 大鼠缺血再灌注心肌间质胶原含量和形态学变化的定量研究[J].现代中西医结合杂志，2004，20（20）：543—558.
[7]汪祥海，伍卫，杨军，等. Rho激酶在血管紧张素Ⅱ刺激大鼠心肌成纤维细胞增殖和胶原合成中的作用[J].中国病理生理杂志，2007，6（3）：123—127.
[8]郑澜，潘珊珊.心肌局部RAS与运动心脏重塑的关系[J].上海体育学院学报，2000，24（3）：33—36.
[9]Tian B，et al.AngⅡstimulates the syntheses of DNA，RNA，protein and collagen in isolated cardiomycytes and cultured cardiac fibroblasts from hyperophied rat heart.Chin J pathophysiol，1995，11（5）：450—453.
[10]Suzuki j，et al. Rat angiotensinⅡ（typeiA） receptor mRNA regulation and subtype expression in myocardial growth and hypertrophy[J].Circulation Research，1993，73（3）：439—447.
[11]王巍巍，张金元，陈劲.丹参对马兜铃酸肾损害大鼠肾组织病理学改变及ACE、ACE2表达的影响[J].中国中西医结合肾病杂志，2009，10（2）：109—116.
[12]于学军，何作云，戚文航.心肌组织内血管紧张素转换酶活性的变化及西拉普利的作用[J]. 高血压杂志，2010，9（3）：256—262.
[13] Phatharajaree W ，Phrommintikul A，Chattipakom N.Matrix metalloproteinases and myocardial infarction [J].Can J Cardiol，2007，23（9）：727—733.
[14]赵斌，文小军. 不同运动负荷对大鼠心肌胶原纤维的影响[J].新乡医学院学报，2005，22（2）：177—181.
[15]马宇峰.不同运动负荷大鼠心肌胶原纤维的组织学变化[J].山东体育学院学报，2005，21（5）：57—61.
[16]Paul Poirier，MD， PhD， FCRPC；，Thomas D. Obesity and Cardiovascular Disease：Pathophysiol—ogy， Evaluation， and Effect of Weight Loss[J].Circulation， 2010，51（8）： 2405—2412.第28卷第3期2012年6月
山东体育学院学报Journal of Shandong Institute of Physical Education and Sports