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摘要[目的]考察微波预处理对油菜秸秆纤维素糖化的影响并优化处理工艺。[方法]以油菜秸秆为材料,采用单因素试验研究了微波处理功率、时间、液固比、pH及纤维素酶酶量、酶解时间等处理条件对产糖率的影响,并应用响应面分析法就预处理工艺进行优化,利用Design Expert 8.0.5b软件分析试验数据建立纤维素转化条件的二次项数学模型。[结果]试验表明,产糖率的模型均极显著(P<0000 1),拟合度良好。微波预处理对油菜秸秆纤维素糖化的适宜工艺条件:微波功率560 W,微波时间7.00 min,液固比24.15∶1 ml/g,pH 5.95,酶量6 640 IU/g。在此条件下,产糖率为25.339 4%。[结论]研究可为油菜秸秆的综合利用提供技术支持。
关键词关键词
中图分类号S509.9文献标识码A文章编号0517-6611(2015)29-287-05
油菜是我国重要的油料作物,种植面积和产量常年居于世界首位。油菜秸秆木质部分的纤维组织发达,其纤维素含量为43.6%~47.3%。目前,国内油菜秸秆的利用率极低,除了少数作为肥料、饲料、沼气、食用菌等的原料外,绝大部分没有得到有效利用,或是野外任意丢弃,或是田间焚烧,不仅浪费了宝贵的有机质资源,而且污染了环境。因此,对于利用开发油菜秸秆生产燃料乙醇的研究显得尤为重要,也是实现农作物秸秆资源化利用的有效途径。笔者以产糖率为指标,采用微波对油菜秸秆预处理工艺进行初步研究,并应用响应面分析法就预处理工艺进行优化,以期为油菜秸秆的综合利用提供技术支持。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1原料。油菜秸秆,采集于湖南农业大学耘园教学基地。纤维素酶,10 000 IU/g,由湖南鸿鹰翔生物工程有限公司提供。
1.1.2主要仪器与药品。器材:EG720FA4NR微波炉,美的集团;FW100型高速万能粉碎机,天津泰斯特仪器有限公司;HH60型数显恒温搅拌循环水箱,常州市华普达教学仪器有限公司;TH298台式恒温振荡器,常州诺基仪器有限公司;DHG9070型电热恒温鼓风干燥箱,上海精密实验设备有限公司;PL303电子天平,上海梅特勒-托利多集团;旋转蒸发仪,上海实验仪器总厂;722型分光光度计,北京科瑞海科学仪器公司。
药品:葡萄糖、硫酸、3,5二硝基水杨酸、酒石酸钾钠、亚硫酸钠,分析纯AR,国药集团化学试剂有限公司;无水乙醇,分析纯AR,天津市恒兴化学试剂制造有限公司。
1.2方法
1.2.1油菜秸秆的前处理。将采集的油菜秸秆剪成2~3 cm的小段,于50 ℃烘干后,粉碎成20目左右。备用。
1.2.2油菜秸秆的微波处理条件研究。称取10 g油菜秸秆粉置于500 ml烧杯中,分别改变微波功率(70、210、350、560、700 W)、微波处理时间(6、7、8、9、10 min)、液固比(15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1 ml/g)、溶液pH(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)等条件处理后,调节pH 5.0,按油菜秸秆干重加入3 000 IU/g纤维素酶,50 ℃下恒温处理24 h,测定糖含量,并计算产糖率。考察不同预处理条件对产糖率的影响,重复3次。
1.2.3酶解条件的确定。调节上述经微波处理后的油菜秸秆粉溶液pH至5.0,分别加入不同量的纤维素酶(2 000、3 000、4 000、5 000、6 000、7 000 IU/g),于50 ℃水浴酶解不同的时间(8、16、24、32、40 h),抽滤,测定滤液的含糖量,计算其产糖率。
1.2.4油菜秸秆糖化条件的响应面优化。根据BoxBehnken中心组合试验设计原则,基于单因素试验结果,选取微波处理时间、液固比、微波处理pH和加酶量,设计4因素3水平试验优化油菜秸秆糖化条件。各因素水平的编码表见表1。
1.2.5分析方法。糖含量的测定参照文献提供的方法进行。试验结果采用统计软件SPSS17.0进行Duncan氏多重比较检验均值的差异显著性。
2 结果与分析
2.1微波功率对产糖率的影响分别称取10 g油菜秸秆粉置于500 ml烧杯中,按液固比20∶1 ml/g加入水,调节pH到5.5,采用70、210、350、560、700 W的输出功率进行微波处理后,测定处理液中糖的含量,并计算产糖率,结果见图1。
由图1可知,随着微波处理功率增加,产糖率也随之增加,当微波处理功率为560 W时,产糖率最高,达27.13%。但加大微波功率,产糖率下降。
2.2微波处理时间对产糖率的影响改变微波处理时间,其他条件不变,分别探讨不同的微波处理时间对产糖率的影响,结果见图2。
从图2可以看出,当微波处理时间为7 min时,产糖率达29.26%。但随着处理时间延长,产糖率下降,原因为处理时间过长微波加热会使溶液温度过高,导致纤维素分子间发生部分团聚,反而聚合度增加,糖化速度变慢。
2.3液固比对产糖率的影响分别改变液固比为15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1 ml/g,其他条件不变,考察不同液固比对产糖率的影响,结果见图3。
由图3可见,随着液固比的增加,产糖率增加,当液固比为25∶1 ml/g时,产糖率为22.15%。但当液固比超过25∶1 ml/g时,随液固比的增加产糖率缓慢降低。原因是提高液固比,有利于分散物料,使物料能充分受到微波处理,充分与酶接触。但液固比过高时,水量增加,微波效率降低,同时底物浓度降低,酶解效率也降低,从而导致产糖率降低。
2.4微波处理pH对产糖率的影响用稀酸或稀碱调节油菜秸秆液pH为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0,其他条件不变,探讨不同的pH条件下对微波预处理油菜秸秆产糖率的影响,结果见图4。 酸性条件下有利于纤维素晶体结构的破坏,降低纤维素的结晶度,从而有利于纤维素的水解,但pH过低时半纤维素结构破坏产生抑制物。由图4可见,随着pH的提高,产糖率增加。当pH为6.0时,产糖率为23.23%;但当pH超过6.0时,产糖率下降。
2.5纤维素酶酶量对产糖率影响在得到适宜预处理条件的基础上,按油菜秸秆干重分别加入2 000、3 000、4 000、5 000、6 000、7 000 IU/g的纤维素酶,其他条件不变,探讨纤维素酶量对产糖率的影响,结果见图5。
由图5可知,随着酶量的增加,产糖率显著增加,当酶量达到6 000 IU/g时,产糖率为30.43%。但当酶量超过6 000 IU/g时,产糖率增长不明显。
2.6酶解时间对产糖率的影响将油菜秸秆处理液加酶后,置于50 ℃条件下恒温处理8 h开始第1次取样,以后每隔8 h取样一次,测定处理液中糖含量,并计算产糖率,考察酶解时间对产糖率的影响,结果见图6。
由图6可以看出,随着酶解时间的延长,产糖率上升。当酶解时间达到32 h时,产糖率为29.61%。但当酶解时间超过32 h,产糖率略有下降。原因为酶解产物积累到一定浓度,会产生反馈抑制,而且处理时间长,微生物大量生长而消耗部分糖进而导致酶解液中糖的下降。
2.7响应面处理条件优化
2.7.1响应面试验设计及结果。参照文献进行4因素3水平的试验分析,共27个试验点,其中24个为分析因子,3个为零点,零点试验重复3次,以估计误差。以产糖率(R1)为响应值,试验设计及结果见表2。
2.7.2产糖率的方差分析。根据表2试验结果,采用DesignExpert 8.0.5b软件对试验结果进行二次多项回归拟合获得以产糖率为响应值的回归方程:R1=24.43+0.41A-0.19B-0.24C+1.82D+0.087AB-0.56AC-0.37AD-0.59BC-0.11BD-0.44CD-1.10A2-0.85B2-1.48C2-0.51D2。
响应面结果方差分析显示:F模型=64.30,P模型<0000 1**;FA=30.16,PA<0.000 1**;FB=6.26,PB=0.027 8;FC=10.10,PC=0.008 0**;FD=583.20,PD<0.000 1**;FAB=0.45,PAB=0.514 8;FAC=18.79,PAC=0.001 0**;FAD=7.95,PAD=0.015 5;FBC=20.49,PBC=0.000 7**;FBD=0.68,PBD=0.425 6;FCD=1126,PCD=0.005 7**;FA2=94.51,PA2<0.000 1**;FB2=57.03,PB2<0.000 1**;FC2=171.58,PC2<0.000 1**;FD2=20.51,PD2=0.000 7;F失拟=0.83,P失拟=0.661 5。由此可知,A、C、D、AC、BC、CD、A2、B2、C2对产糖率的影响极显著(P<0.01),说明微波处理时间、pH和酶量是纤维素糖化处理过程中的重要因素,表明回归方程的一次项、交互项和二次项的影响都是高度显著的。该模型回归显著(P<0.000 1),且失拟项不显著(P>0.05),说明数据中没有异常点,模型适当,回归方程拟合度良好。
采用DesignExpert 8.0.5b软件分析模型的可信度,结果见表3。由表3可见,回归方程的复相关系数为0.986 8,表明98.68%的产糖率变化可由此模型解释,与实际试验拟合较好;校正相关系数为0.971 5,预测相关系数为0.933 2,两者极为相近,说明其他因素的干扰较少。产糖率变异系数为1.15%,信噪比为25.508,说明该模型的可信度高。因此,可以用上述模型代替真实试验点对纤维素的糖化处理进行分析和预测。
2.7.3产糖率的响应曲面分析。响应面分析的图形是特定的响应值对应自变量构成的一个三维空间图,可以直观地反映出各自变量对响应值的影响[12]。采用DesignExpert 8.0.5b软件对产糖率的回归模型进行分析,微波处理时间、液固比、微波处理pH和酶量4个因素交互影响产糖率的响应面图和等高线图见图7~12。
从图7~12可知,微波处理时间和液固比、微波处理时间和pH、液固比与pH对产糖率的交互作用显著,而微波处理时间和酶量、液固比和酶量、微波处理pH和酶量对产糖率的交互作用不显著。
2.7.4显著因素水平优化。由图7~12给出的回归方程的三维响应面及等高线图可知,回归模型存在稳定度,即最大值。并对产糖率的回归方程分别求一阶偏导等于零,得到模型的最佳因素编码为:A=-0.121 4,B=0.216 3,C=-0.067 3,D=1.880 7,将其代入产糖率回归方程,得到预测糖产率为26.167 8%。各编码所对应的A、B、C、D的实际取值为:微波处理时间为7.00 min,液固比为24.15∶1 ml/g,pH为5.95,酶量为6 640 IU/g。
2.7.5验证试验。按照优化试验所得的各因素优化值,即微波处理时间为7.00 min,液固比为24.15∶1 ml/g,pH为5.95,酶量为6 640 IU/g进行验证试验,重复3次,产糖率依次为25.924 2%、25.336 8%、25.387 2%,平均产糖率为25.339 4%,与理论预测值25.428 3%的相对误差为0.35%,可见该模型能较好地预测油菜秸秆纤维素糖化的工艺条件。
3结论与讨论
由于农作物秸秆中纤维素分子形成结构紧密的晶状结构,且被难以分解的木质素缠绕包围,使得纤维素酶对其可及性差,酶解糖化用酶量大且作用时间长、效率低、成本高[13-14]。因此,酶水解之前的预处理是秸秆纤维素转化为可发酵糖的关键技术[15-16]。预处理技术主要有物理处理、化学处理和生物处理法。伦晓中等应用膨化技术对玉米秸秆进行预处理,在温度48 ℃,pH 4.5,液固比8∶1 ml/g,酶浓度36.0 U/g,酶解时间25 h的条件下,还原糖的转化率为28.98%[17]。张木明等采用酸处理、碱处理和机械粉碎法对稻草秸秆进行预处理后,酶解产糖率分别为9.25%, 33.16%和10.64%[18]。吴国杰等以稻草秸杆为原料,经2%氢氧化钠预处理后,获得糖化率达40%的结果[19]。该研究在利用响应面法得到油菜秸秆纤维素转化生物乙醇的最优条件为:微波处理功率560 W,微波处理7.00 min,液固比24.15∶1 ml/g,pH 5.95,酶量6 640 IU/g,在此条件下的理论产糖率为25.428 3%。通过验证试验,测得平均产糖率为25.339 4%,与理论预测值相比,相对误差为0.35%,说明该模型能较好地预测分析油菜秸秆纤维素微波预处理糖化的实际情况,可为油菜秸秆的综合利用提供技术支持。 参考文献
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关键词关键词
中图分类号S509.9文献标识码A文章编号0517-6611(2015)29-287-05
油菜是我国重要的油料作物,种植面积和产量常年居于世界首位。油菜秸秆木质部分的纤维组织发达,其纤维素含量为43.6%~47.3%。目前,国内油菜秸秆的利用率极低,除了少数作为肥料、饲料、沼气、食用菌等的原料外,绝大部分没有得到有效利用,或是野外任意丢弃,或是田间焚烧,不仅浪费了宝贵的有机质资源,而且污染了环境。因此,对于利用开发油菜秸秆生产燃料乙醇的研究显得尤为重要,也是实现农作物秸秆资源化利用的有效途径。笔者以产糖率为指标,采用微波对油菜秸秆预处理工艺进行初步研究,并应用响应面分析法就预处理工艺进行优化,以期为油菜秸秆的综合利用提供技术支持。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1原料。油菜秸秆,采集于湖南农业大学耘园教学基地。纤维素酶,10 000 IU/g,由湖南鸿鹰翔生物工程有限公司提供。
1.1.2主要仪器与药品。器材:EG720FA4NR微波炉,美的集团;FW100型高速万能粉碎机,天津泰斯特仪器有限公司;HH60型数显恒温搅拌循环水箱,常州市华普达教学仪器有限公司;TH298台式恒温振荡器,常州诺基仪器有限公司;DHG9070型电热恒温鼓风干燥箱,上海精密实验设备有限公司;PL303电子天平,上海梅特勒-托利多集团;旋转蒸发仪,上海实验仪器总厂;722型分光光度计,北京科瑞海科学仪器公司。
药品:葡萄糖、硫酸、3,5二硝基水杨酸、酒石酸钾钠、亚硫酸钠,分析纯AR,国药集团化学试剂有限公司;无水乙醇,分析纯AR,天津市恒兴化学试剂制造有限公司。
1.2方法
1.2.1油菜秸秆的前处理。将采集的油菜秸秆剪成2~3 cm的小段,于50 ℃烘干后,粉碎成20目左右。备用。
1.2.2油菜秸秆的微波处理条件研究。称取10 g油菜秸秆粉置于500 ml烧杯中,分别改变微波功率(70、210、350、560、700 W)、微波处理时间(6、7、8、9、10 min)、液固比(15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1 ml/g)、溶液pH(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)等条件处理后,调节pH 5.0,按油菜秸秆干重加入3 000 IU/g纤维素酶,50 ℃下恒温处理24 h,测定糖含量,并计算产糖率。考察不同预处理条件对产糖率的影响,重复3次。
1.2.3酶解条件的确定。调节上述经微波处理后的油菜秸秆粉溶液pH至5.0,分别加入不同量的纤维素酶(2 000、3 000、4 000、5 000、6 000、7 000 IU/g),于50 ℃水浴酶解不同的时间(8、16、24、32、40 h),抽滤,测定滤液的含糖量,计算其产糖率。
1.2.4油菜秸秆糖化条件的响应面优化。根据BoxBehnken中心组合试验设计原则,基于单因素试验结果,选取微波处理时间、液固比、微波处理pH和加酶量,设计4因素3水平试验优化油菜秸秆糖化条件。各因素水平的编码表见表1。
1.2.5分析方法。糖含量的测定参照文献提供的方法进行。试验结果采用统计软件SPSS17.0进行Duncan氏多重比较检验均值的差异显著性。
2 结果与分析
2.1微波功率对产糖率的影响分别称取10 g油菜秸秆粉置于500 ml烧杯中,按液固比20∶1 ml/g加入水,调节pH到5.5,采用70、210、350、560、700 W的输出功率进行微波处理后,测定处理液中糖的含量,并计算产糖率,结果见图1。
由图1可知,随着微波处理功率增加,产糖率也随之增加,当微波处理功率为560 W时,产糖率最高,达27.13%。但加大微波功率,产糖率下降。
2.2微波处理时间对产糖率的影响改变微波处理时间,其他条件不变,分别探讨不同的微波处理时间对产糖率的影响,结果见图2。
从图2可以看出,当微波处理时间为7 min时,产糖率达29.26%。但随着处理时间延长,产糖率下降,原因为处理时间过长微波加热会使溶液温度过高,导致纤维素分子间发生部分团聚,反而聚合度增加,糖化速度变慢。
2.3液固比对产糖率的影响分别改变液固比为15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1 ml/g,其他条件不变,考察不同液固比对产糖率的影响,结果见图3。
由图3可见,随着液固比的增加,产糖率增加,当液固比为25∶1 ml/g时,产糖率为22.15%。但当液固比超过25∶1 ml/g时,随液固比的增加产糖率缓慢降低。原因是提高液固比,有利于分散物料,使物料能充分受到微波处理,充分与酶接触。但液固比过高时,水量增加,微波效率降低,同时底物浓度降低,酶解效率也降低,从而导致产糖率降低。
2.4微波处理pH对产糖率的影响用稀酸或稀碱调节油菜秸秆液pH为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0,其他条件不变,探讨不同的pH条件下对微波预处理油菜秸秆产糖率的影响,结果见图4。 酸性条件下有利于纤维素晶体结构的破坏,降低纤维素的结晶度,从而有利于纤维素的水解,但pH过低时半纤维素结构破坏产生抑制物。由图4可见,随着pH的提高,产糖率增加。当pH为6.0时,产糖率为23.23%;但当pH超过6.0时,产糖率下降。
2.5纤维素酶酶量对产糖率影响在得到适宜预处理条件的基础上,按油菜秸秆干重分别加入2 000、3 000、4 000、5 000、6 000、7 000 IU/g的纤维素酶,其他条件不变,探讨纤维素酶量对产糖率的影响,结果见图5。
由图5可知,随着酶量的增加,产糖率显著增加,当酶量达到6 000 IU/g时,产糖率为30.43%。但当酶量超过6 000 IU/g时,产糖率增长不明显。
2.6酶解时间对产糖率的影响将油菜秸秆处理液加酶后,置于50 ℃条件下恒温处理8 h开始第1次取样,以后每隔8 h取样一次,测定处理液中糖含量,并计算产糖率,考察酶解时间对产糖率的影响,结果见图6。
由图6可以看出,随着酶解时间的延长,产糖率上升。当酶解时间达到32 h时,产糖率为29.61%。但当酶解时间超过32 h,产糖率略有下降。原因为酶解产物积累到一定浓度,会产生反馈抑制,而且处理时间长,微生物大量生长而消耗部分糖进而导致酶解液中糖的下降。
2.7响应面处理条件优化
2.7.1响应面试验设计及结果。参照文献进行4因素3水平的试验分析,共27个试验点,其中24个为分析因子,3个为零点,零点试验重复3次,以估计误差。以产糖率(R1)为响应值,试验设计及结果见表2。
2.7.2产糖率的方差分析。根据表2试验结果,采用DesignExpert 8.0.5b软件对试验结果进行二次多项回归拟合获得以产糖率为响应值的回归方程:R1=24.43+0.41A-0.19B-0.24C+1.82D+0.087AB-0.56AC-0.37AD-0.59BC-0.11BD-0.44CD-1.10A2-0.85B2-1.48C2-0.51D2。
响应面结果方差分析显示:F模型=64.30,P模型<0000 1**;FA=30.16,PA<0.000 1**;FB=6.26,PB=0.027 8;FC=10.10,PC=0.008 0**;FD=583.20,PD<0.000 1**;FAB=0.45,PAB=0.514 8;FAC=18.79,PAC=0.001 0**;FAD=7.95,PAD=0.015 5;FBC=20.49,PBC=0.000 7**;FBD=0.68,PBD=0.425 6;FCD=1126,PCD=0.005 7**;FA2=94.51,PA2<0.000 1**;FB2=57.03,PB2<0.000 1**;FC2=171.58,PC2<0.000 1**;FD2=20.51,PD2=0.000 7;F失拟=0.83,P失拟=0.661 5。由此可知,A、C、D、AC、BC、CD、A2、B2、C2对产糖率的影响极显著(P<0.01),说明微波处理时间、pH和酶量是纤维素糖化处理过程中的重要因素,表明回归方程的一次项、交互项和二次项的影响都是高度显著的。该模型回归显著(P<0.000 1),且失拟项不显著(P>0.05),说明数据中没有异常点,模型适当,回归方程拟合度良好。
采用DesignExpert 8.0.5b软件分析模型的可信度,结果见表3。由表3可见,回归方程的复相关系数为0.986 8,表明98.68%的产糖率变化可由此模型解释,与实际试验拟合较好;校正相关系数为0.971 5,预测相关系数为0.933 2,两者极为相近,说明其他因素的干扰较少。产糖率变异系数为1.15%,信噪比为25.508,说明该模型的可信度高。因此,可以用上述模型代替真实试验点对纤维素的糖化处理进行分析和预测。
2.7.3产糖率的响应曲面分析。响应面分析的图形是特定的响应值对应自变量构成的一个三维空间图,可以直观地反映出各自变量对响应值的影响[12]。采用DesignExpert 8.0.5b软件对产糖率的回归模型进行分析,微波处理时间、液固比、微波处理pH和酶量4个因素交互影响产糖率的响应面图和等高线图见图7~12。
从图7~12可知,微波处理时间和液固比、微波处理时间和pH、液固比与pH对产糖率的交互作用显著,而微波处理时间和酶量、液固比和酶量、微波处理pH和酶量对产糖率的交互作用不显著。
2.7.4显著因素水平优化。由图7~12给出的回归方程的三维响应面及等高线图可知,回归模型存在稳定度,即最大值。并对产糖率的回归方程分别求一阶偏导等于零,得到模型的最佳因素编码为:A=-0.121 4,B=0.216 3,C=-0.067 3,D=1.880 7,将其代入产糖率回归方程,得到预测糖产率为26.167 8%。各编码所对应的A、B、C、D的实际取值为:微波处理时间为7.00 min,液固比为24.15∶1 ml/g,pH为5.95,酶量为6 640 IU/g。
2.7.5验证试验。按照优化试验所得的各因素优化值,即微波处理时间为7.00 min,液固比为24.15∶1 ml/g,pH为5.95,酶量为6 640 IU/g进行验证试验,重复3次,产糖率依次为25.924 2%、25.336 8%、25.387 2%,平均产糖率为25.339 4%,与理论预测值25.428 3%的相对误差为0.35%,可见该模型能较好地预测油菜秸秆纤维素糖化的工艺条件。
3结论与讨论
由于农作物秸秆中纤维素分子形成结构紧密的晶状结构,且被难以分解的木质素缠绕包围,使得纤维素酶对其可及性差,酶解糖化用酶量大且作用时间长、效率低、成本高[13-14]。因此,酶水解之前的预处理是秸秆纤维素转化为可发酵糖的关键技术[15-16]。预处理技术主要有物理处理、化学处理和生物处理法。伦晓中等应用膨化技术对玉米秸秆进行预处理,在温度48 ℃,pH 4.5,液固比8∶1 ml/g,酶浓度36.0 U/g,酶解时间25 h的条件下,还原糖的转化率为28.98%[17]。张木明等采用酸处理、碱处理和机械粉碎法对稻草秸秆进行预处理后,酶解产糖率分别为9.25%, 33.16%和10.64%[18]。吴国杰等以稻草秸杆为原料,经2%氢氧化钠预处理后,获得糖化率达40%的结果[19]。该研究在利用响应面法得到油菜秸秆纤维素转化生物乙醇的最优条件为:微波处理功率560 W,微波处理7.00 min,液固比24.15∶1 ml/g,pH 5.95,酶量6 640 IU/g,在此条件下的理论产糖率为25.428 3%。通过验证试验,测得平均产糖率为25.339 4%,与理论预测值相比,相对误差为0.35%,说明该模型能较好地预测分析油菜秸秆纤维素微波预处理糖化的实际情况,可为油菜秸秆的综合利用提供技术支持。 参考文献
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