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摘要 [目的] 得到清晰的特异性条带，更好地分析SRAP标记产物。[方法]对聚丙烯酰胺电泳的上样量、电压条件进行了梯度试验，同时就灌胶方式、银染时间、显影剂调配等各步骤的操作进行了详细地探讨。[结果] 上样量7 μl、电压1 000 V最合适，能得到 DNA条带清晰、特异性条带区分效果明显的条带。 [结论] 为后续电泳操作及分析过程奠定技术基础。
关键词 亚麻;聚丙烯酰胺凝胶电泳;银染
中图分类号 S563.2 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）33-11636-02
Considerations for Study in Polyacrylamide Gel Electrophoresis Process
WU Jian-zhong1， WANG Yu-ping2， XU Yuan-yuan2 et al
（1. Industrial Crops Institute of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences，Harbin， Heilongjiang 150086;2. College of Life Sciences of Harbin Normal University， Harbin， Heilongjiang 150025）
Abstract [Objective] The aim was to get clear specific bands， in order to better analyze SRAP markers. [Method] Sample amount and voltage condition of polyacrylamide electrophoresis were tested.at the same time， glue， silver dyeing time， the developer deployment and so on were made a detail discussion on the operation of the flash. [Result] 7 μl of sample amount， 1 000 V of voltage was the most appropriate， and could get clear DNA banding and specificity belt to distinguish the effect of belts. [Conclusion] The study laid a solid technical foundation for convenient operation and subsequent analyses process.
Key words Flax; Polyacrylamide gel electrophoresis; Silver staining
基金项目 哈尔滨市科技创新工程青年基金项目（2013RFQYJ010）;黑龙江省农科创新青年基金项目（2012QN009）;国家农业部科技支撑计划基金项目（2013BAD01B03）。
作者简介 吴建忠（1983- ），男，内蒙古乌兰察布人，助理研究员，在读博士，从事作物遗传育种方面的研究。
收稿日期 2014-10-20
聚丙烯酰胺凝胶电泳是由Raymond和Weintraub于1959年利用人工合成的凝胶作为支持介质创建的一种电泳方式，极大地提高了电泳技术的分辨率，开创了近代电泳的新时代[1]。聚丙烯酰胺凝胶电泳在生物化学和分子生物学中对蛋白质、多肽、核酸等生物大分子使用最普遍，被人们称为是对生物大分子进行分析鉴定的最后、最准确的手段，即“Last Check”。 聚丙烯酰胺凝膠具有可分离不同分子量的生物大分子、灵敏度高、化学惰性好、重复性好、透明度好等优点，目前尚无更好地支持介质能够取代它[2]，但其不足之处在于操作过程繁琐[3]。SRAP标记在亚麻基因型分析中使用普遍，该标记方法能产生大量特异性条带[4]，为了得到清晰的特异性条带，更好地分析SRAP标记产物，必须注意操纵过程中的每一个细节。笔者在亚麻SRAP标记分析中，对聚丙烯酰胺电泳的上样量、电压条件进行了梯度试验，同时就灌胶方式、银染时间、显影剂调配等各步骤的操作作了详细地探讨，为SRAP标记后续亚麻基因型分析奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料。
供试植物材料均由黑龙江省农业科学院经济作物研究所提供，采用改良过的 CTAB 法提取亚麻全基因组 DNA[5]，紫外分光光度计测定DNA浓度分析纯度后，置于-20 ℃冰箱备用。
1.1.2 化学试剂。
丙烯酰胺、甲叉-丙烯酰胺、硫酸铵、尿素、硼酸、TRIS-base、EDTA、TEMED、75%乙醇、亲和硅烷、玻璃硅烷、硝酸银、氢氧化钠、无水碳酸钠、甲醛、去离子水，其他用试剂纯。
1.2 方法
采用已经建立并优化的SRAP标记技术体系进行亚麻PCR扩增点样基因型分析[6-7]。
对面板和背板分别擦板后，采用适量6%PAGE溶液灌胶，制作胶板。点样前先80 W预热30 min，60 W进行正式电泳80 min。用质量浓度0.3%的硝酸银溶液银染8 min，取出后用去离子水冲洗3遍，每次1 min;再置于显影液（由2%NaOH、0.06%NaHCO3、4.4%HCHO混合而成的）中，时间约为5 min，以DNA条带清晰可辨为准，取出后用去离子水漂洗3遍，每次3 min，沥干，在观察灯下人工读带、记录，并照相留底。 2 结果与分析
2.1 上样量梯度分析
上样量分别为4、7、10 μl，检测不同上样量对电泳结果产生的影响。结果见图1。
图1 上样量影响
由图1可知，不同上样量对电泳结果产生影响。上样量4 μl时，DNA条带颜色淡，易缺带，影响读带;上样量7 μl时，DNA条带清晰，颜色深，易读带;上样量10 μl时，DNA条带清晰度、颜色深浅与上样量为7 μl时基本一致。因此上样量为7 μl最合适，用最少的上样量得到最清晰的电泳结果以避免浪费样品。
点样孔内充满缓冲液，若上样量为4 μl，样品体积相对点样孔内缓冲液的体积小，点样时样品受到缓冲液的阻力大，易被挡在点样孔外，样品不易进入点样孔或者全部被缓冲液挡在点样孔外，结果出现DNA条带颜色浅或者缺带现象;若上样量为10 μl，样品进入点样孔时所受阻力相对较小，易进入点样孔。由于阻力依然存在，一部分样品被留在点样孔外，污染缓冲液，这部分样品还易落入相邻点样孔内，造成窜样，影响读带;若上样量为7 μl，样品可以全部进入点样孔，不会被留在点样孔外。
2.2 电压梯度分析
设置电压分别为600、800和1 000 V，检测不同电压值对电泳结果的产生影响，不同电压条件下的电泳图谱见图2。
图2 电压梯度分析
由图2可知，3种电压条件下所得到的电泳结果基本一致，DNA条带直，颜色深，清晰可辨。虽然3种电压对电泳图谱影响不明显，但DNA条带电泳至同一位置所耗时不同。DNA条带电泳至玻璃板的3/4处，电压1 000 V需要1.5 h，电压800 V需要2.5 h，而电压600 V则需要3 h以上。为了缩短试验时间，选择电压1 000 V最合适。
3 讨论
在聚丙烯酰胺凝胶电泳操作过程中，电泳结果受到诸多因素的影响。正确的灌胶方式可以避免气泡的产生，若胶内有气泡，会使DNA带弯曲，影响成像美观。当气泡位于点样孔内，DNA所受到的阻力小，其电泳速度比其他DNA快，导致DNA带弯曲。气泡位置及大小不同，DNA带弯曲程度也不同：气泡位于DNA电泳路径内，气泡越大，气泡长度与路径长度的比值越大，DNA弯带曲程度越大。气泡越小，气泡长度与路径长度的比值越小，DNA带弯曲程度越小;气泡位于DNA电泳路径外，DNA在其电泳路径内所受阻力基本相同，DNA带不弯曲，可视为无影响。點样孔内的气泡，灌胶时易产生，插入梳子时也易带入。如果整个聚丙烯酰胺凝胶薄厚不均或点样孔处的胶发生下移，会导致整条DNA带不再一条水平线上。这是由于胶液下移导致的，只需灌胶后，调整玻璃板与水平台即可。
若DNA条带颜色浅或DNA条带颜色与背景色差别小，会影响读带。银染和显影过程中一些细节需要注意。银染液由5 g硝酸银、1 500 ml去离子水调配而成。用摇床摇15～30 min后即可使用。若时间少于15 min，硝酸银没有完全溶解，银染效果不好。银染时间为8 min左右，少于8 min，银染不彻底，DNA条带颜色浅;多于15 min，银离子富集在胶内，显影时面板会全部变黑，无法读带。显影液由0.9 g无水碳酸钠、30 g氢氧化钠、6 ml甲醛、1 500 ml去离子水配置而成。甲醛现用现加，加入甲醛后，在摇床上摇2 min后即可使用。如果甲醛没有摇匀，显影时局部高浓度的甲醛迅速还原银离子，局部面板变黑，DNA条带和背景颜色一样深，无法读带。若提前加入甲醛，甲醛在空气中易挥发，实际操作时溶液中甲醛浓度不够，影响显影效果。若加入甲醛较晚，依然由于甲醛浓度分布不均引起局部胶面迅速变黑，无法读带。若不加甲醛，由于缺少还原银离子的还原剂，DNA条带不会显现出来。甲醛是具有特殊刺激性气味的液体，对人体有强烈的致癌和促癌作用，在嗅觉、过敏，肝、肺、免疫功能等方面也有影响，显影过程必须在通风橱内进行，使空气中的甲醛及时排到室外，减少对人体的危害[8]。面板染色不均匀，与银染液和显影液的使用次数有关，由于重复使用，银染液中银离子浓度降低，银染液内残留胶块和DNA染色剂，影响银染效果。为了避免染色不均，银染液和显影液一般在使用3次后重新配制。
若胶面脱落或损坏，导致数据缺失，原因有2个：一是亲和硅烷和玻璃硅烷擦得不均匀，导致面板与背板不易分开，若用力撬开，胶面可能脱离面板，粘到背板上，也可能从胶中间分开，粘到2个板上。若胶粘到背板上，由于胶面缺失，不仅损失部分数据，也影响成像美观;若胶粘到2个板上，在面板上的胶由于表面凹凸不平，银染时就会由于银离子大量进入而导致颜色变深，显影时不仅会迅速变黑，而且影响其周围1 cm范围内的胶也变黑，无法读带，所损失的数据范围比粘掉的胶面面积大;二是显影后，去离子水冲洗不彻底。显影液中含有氢氧化钠，若胶内残留氢氧化钠，胶面易脱落。因此，为使胶面完整，在擦板时，亲和硅烷和玻璃硅烷可以均擦2遍，显影后，漂洗时间一定要长，防止氢氧化钠残留，腐蚀胶面[9]。
若同一水平线上的DNA条带，形状颜色都一致，只有一条DNA条带长度是其他DNA条带长度的50%，很难判断这半条带的准确性，因为很有可能是窜样造成的，需要进一步判断。为防止窜样，点样时，不同样品要更换枪头。由于用不同引物扩增DNA，所以PCR产物中DNA浓度不同，若样品内DNA浓度高，会产生一条颜色浅、凝胶状的杂带，DNA在这里凝聚导致条带无法分开，影响读带，上样量为7 μl可有效防止杂带的产生。
若凝胶时间长，会增加试验耗时。配胶时，10%AP与TEMED用量越多，胶凝固速度越快。在50 ml PAGE溶液中分别加750 μl和75 μl的AP、TEMED，凝胶时间仅需5 min;若分别加入450 μl和45 μl的AP、TEMED，凝胶时间需要30 min以上，因此，可以根据用时调整两者用量。
4 结论
聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率高，能分辨分子量较小的DNA片段，但其操作步骤多，用时长，因此每个操作细节都会影响最终成像结果。只有注意每个操作步骤，才能使DNA条带清晰、特异性条带区分效果明显，从而得到准确的试验结果，为研究DNA分子标记分析提供基础数据。
参考文献
[1] RAYMOND S，WEINTRAUB L.Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis[J].Science，1959，130（3377）：711.
[2] 潘尚领，龙桂芳，陈萍，等.DNA直接银染测序法的建立和优化[J].广西医科大学学报，2001，18（3）：447-448.
[3] 李虹业，范树国，刘玉乐，等.改良聚丙烯酰胺凝胶电泳检测DNA[J].细胞生物学杂志，1999，21（4）：201-203.
[4] 吴建忠，赵东升，黄文功，等.12个亚麻品种亲缘关系的SRAP 分析[J].中国麻业科学，2012（3）：153-156，189.
[5] 吴建忠.亚麻全基因组 DNA 的提取及分析[J].黑龙江农业科学，2011（7）：18-19.
[6] 吴建忠，黄文功，赵东升，等.亚麻 SRAP反应体系的优化和多态性标记筛选[J].中国麻业科学，2011（6）：281-284.
[7] 何庆元，吴萍，张晓红.不同秋眠性苜蓿SRAP体系优化及遗传多样性分析[J].草业学报，2011，20（2）：201-209.
[8] 高凌云，陈丽红，李一伟.PCR-SSCP中聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染法的探讨[J].福建医科大学学报，2001，35（4）：413-414.
[9] 陈香玲，李杨瑞，杨丽涛，等.cDNA-SCOT基因差异表达两种电泳方法的比较研究[J].生物技术通报，2010（10）：93-95.
关键词 亚麻;聚丙烯酰胺凝胶电泳;银染
中图分类号 S563.2 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）33-11636-02
Considerations for Study in Polyacrylamide Gel Electrophoresis Process
WU Jian-zhong1， WANG Yu-ping2， XU Yuan-yuan2 et al
（1. Industrial Crops Institute of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences，Harbin， Heilongjiang 150086;2. College of Life Sciences of Harbin Normal University， Harbin， Heilongjiang 150025）
Abstract [Objective] The aim was to get clear specific bands， in order to better analyze SRAP markers. [Method] Sample amount and voltage condition of polyacrylamide electrophoresis were tested.at the same time， glue， silver dyeing time， the developer deployment and so on were made a detail discussion on the operation of the flash. [Result] 7 μl of sample amount， 1 000 V of voltage was the most appropriate， and could get clear DNA banding and specificity belt to distinguish the effect of belts. [Conclusion] The study laid a solid technical foundation for convenient operation and subsequent analyses process.
Key words Flax; Polyacrylamide gel electrophoresis; Silver staining
基金项目 哈尔滨市科技创新工程青年基金项目（2013RFQYJ010）;黑龙江省农科创新青年基金项目（2012QN009）;国家农业部科技支撑计划基金项目（2013BAD01B03）。
作者简介 吴建忠（1983- ），男，内蒙古乌兰察布人，助理研究员，在读博士，从事作物遗传育种方面的研究。
收稿日期 2014-10-20
聚丙烯酰胺凝胶电泳是由Raymond和Weintraub于1959年利用人工合成的凝胶作为支持介质创建的一种电泳方式，极大地提高了电泳技术的分辨率，开创了近代电泳的新时代[1]。聚丙烯酰胺凝胶电泳在生物化学和分子生物学中对蛋白质、多肽、核酸等生物大分子使用最普遍，被人们称为是对生物大分子进行分析鉴定的最后、最准确的手段，即“Last Check”。 聚丙烯酰胺凝膠具有可分离不同分子量的生物大分子、灵敏度高、化学惰性好、重复性好、透明度好等优点，目前尚无更好地支持介质能够取代它[2]，但其不足之处在于操作过程繁琐[3]。SRAP标记在亚麻基因型分析中使用普遍，该标记方法能产生大量特异性条带[4]，为了得到清晰的特异性条带，更好地分析SRAP标记产物，必须注意操纵过程中的每一个细节。笔者在亚麻SRAP标记分析中，对聚丙烯酰胺电泳的上样量、电压条件进行了梯度试验，同时就灌胶方式、银染时间、显影剂调配等各步骤的操作作了详细地探讨，为SRAP标记后续亚麻基因型分析奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料。
供试植物材料均由黑龙江省农业科学院经济作物研究所提供，采用改良过的 CTAB 法提取亚麻全基因组 DNA[5]，紫外分光光度计测定DNA浓度分析纯度后，置于-20 ℃冰箱备用。
1.1.2 化学试剂。
丙烯酰胺、甲叉-丙烯酰胺、硫酸铵、尿素、硼酸、TRIS-base、EDTA、TEMED、75%乙醇、亲和硅烷、玻璃硅烷、硝酸银、氢氧化钠、无水碳酸钠、甲醛、去离子水，其他用试剂纯。
1.2 方法
采用已经建立并优化的SRAP标记技术体系进行亚麻PCR扩增点样基因型分析[6-7]。
对面板和背板分别擦板后，采用适量6%PAGE溶液灌胶，制作胶板。点样前先80 W预热30 min，60 W进行正式电泳80 min。用质量浓度0.3%的硝酸银溶液银染8 min，取出后用去离子水冲洗3遍，每次1 min;再置于显影液（由2%NaOH、0.06%NaHCO3、4.4%HCHO混合而成的）中，时间约为5 min，以DNA条带清晰可辨为准，取出后用去离子水漂洗3遍，每次3 min，沥干，在观察灯下人工读带、记录，并照相留底。 2 结果与分析
2.1 上样量梯度分析
上样量分别为4、7、10 μl，检测不同上样量对电泳结果产生的影响。结果见图1。
图1 上样量影响
由图1可知，不同上样量对电泳结果产生影响。上样量4 μl时，DNA条带颜色淡，易缺带，影响读带;上样量7 μl时，DNA条带清晰，颜色深，易读带;上样量10 μl时，DNA条带清晰度、颜色深浅与上样量为7 μl时基本一致。因此上样量为7 μl最合适，用最少的上样量得到最清晰的电泳结果以避免浪费样品。
点样孔内充满缓冲液，若上样量为4 μl，样品体积相对点样孔内缓冲液的体积小，点样时样品受到缓冲液的阻力大，易被挡在点样孔外，样品不易进入点样孔或者全部被缓冲液挡在点样孔外，结果出现DNA条带颜色浅或者缺带现象;若上样量为10 μl，样品进入点样孔时所受阻力相对较小，易进入点样孔。由于阻力依然存在，一部分样品被留在点样孔外，污染缓冲液，这部分样品还易落入相邻点样孔内，造成窜样，影响读带;若上样量为7 μl，样品可以全部进入点样孔，不会被留在点样孔外。
2.2 电压梯度分析
设置电压分别为600、800和1 000 V，检测不同电压值对电泳结果的产生影响，不同电压条件下的电泳图谱见图2。
图2 电压梯度分析
由图2可知，3种电压条件下所得到的电泳结果基本一致，DNA条带直，颜色深，清晰可辨。虽然3种电压对电泳图谱影响不明显，但DNA条带电泳至同一位置所耗时不同。DNA条带电泳至玻璃板的3/4处，电压1 000 V需要1.5 h，电压800 V需要2.5 h，而电压600 V则需要3 h以上。为了缩短试验时间，选择电压1 000 V最合适。
3 讨论
在聚丙烯酰胺凝胶电泳操作过程中，电泳结果受到诸多因素的影响。正确的灌胶方式可以避免气泡的产生，若胶内有气泡，会使DNA带弯曲，影响成像美观。当气泡位于点样孔内，DNA所受到的阻力小，其电泳速度比其他DNA快，导致DNA带弯曲。气泡位置及大小不同，DNA带弯曲程度也不同：气泡位于DNA电泳路径内，气泡越大，气泡长度与路径长度的比值越大，DNA弯带曲程度越大。气泡越小，气泡长度与路径长度的比值越小，DNA带弯曲程度越小;气泡位于DNA电泳路径外，DNA在其电泳路径内所受阻力基本相同，DNA带不弯曲，可视为无影响。點样孔内的气泡，灌胶时易产生，插入梳子时也易带入。如果整个聚丙烯酰胺凝胶薄厚不均或点样孔处的胶发生下移，会导致整条DNA带不再一条水平线上。这是由于胶液下移导致的，只需灌胶后，调整玻璃板与水平台即可。
若DNA条带颜色浅或DNA条带颜色与背景色差别小，会影响读带。银染和显影过程中一些细节需要注意。银染液由5 g硝酸银、1 500 ml去离子水调配而成。用摇床摇15～30 min后即可使用。若时间少于15 min，硝酸银没有完全溶解，银染效果不好。银染时间为8 min左右，少于8 min，银染不彻底，DNA条带颜色浅;多于15 min，银离子富集在胶内，显影时面板会全部变黑，无法读带。显影液由0.9 g无水碳酸钠、30 g氢氧化钠、6 ml甲醛、1 500 ml去离子水配置而成。甲醛现用现加，加入甲醛后，在摇床上摇2 min后即可使用。如果甲醛没有摇匀，显影时局部高浓度的甲醛迅速还原银离子，局部面板变黑，DNA条带和背景颜色一样深，无法读带。若提前加入甲醛，甲醛在空气中易挥发，实际操作时溶液中甲醛浓度不够，影响显影效果。若加入甲醛较晚，依然由于甲醛浓度分布不均引起局部胶面迅速变黑，无法读带。若不加甲醛，由于缺少还原银离子的还原剂，DNA条带不会显现出来。甲醛是具有特殊刺激性气味的液体，对人体有强烈的致癌和促癌作用，在嗅觉、过敏，肝、肺、免疫功能等方面也有影响，显影过程必须在通风橱内进行，使空气中的甲醛及时排到室外，减少对人体的危害[8]。面板染色不均匀，与银染液和显影液的使用次数有关，由于重复使用，银染液中银离子浓度降低，银染液内残留胶块和DNA染色剂，影响银染效果。为了避免染色不均，银染液和显影液一般在使用3次后重新配制。
若胶面脱落或损坏，导致数据缺失，原因有2个：一是亲和硅烷和玻璃硅烷擦得不均匀，导致面板与背板不易分开，若用力撬开，胶面可能脱离面板，粘到背板上，也可能从胶中间分开，粘到2个板上。若胶粘到背板上，由于胶面缺失，不仅损失部分数据，也影响成像美观;若胶粘到2个板上，在面板上的胶由于表面凹凸不平，银染时就会由于银离子大量进入而导致颜色变深，显影时不仅会迅速变黑，而且影响其周围1 cm范围内的胶也变黑，无法读带，所损失的数据范围比粘掉的胶面面积大;二是显影后，去离子水冲洗不彻底。显影液中含有氢氧化钠，若胶内残留氢氧化钠，胶面易脱落。因此，为使胶面完整，在擦板时，亲和硅烷和玻璃硅烷可以均擦2遍，显影后，漂洗时间一定要长，防止氢氧化钠残留，腐蚀胶面[9]。
若同一水平线上的DNA条带，形状颜色都一致，只有一条DNA条带长度是其他DNA条带长度的50%，很难判断这半条带的准确性，因为很有可能是窜样造成的，需要进一步判断。为防止窜样，点样时，不同样品要更换枪头。由于用不同引物扩增DNA，所以PCR产物中DNA浓度不同，若样品内DNA浓度高，会产生一条颜色浅、凝胶状的杂带，DNA在这里凝聚导致条带无法分开，影响读带，上样量为7 μl可有效防止杂带的产生。
若凝胶时间长，会增加试验耗时。配胶时，10%AP与TEMED用量越多，胶凝固速度越快。在50 ml PAGE溶液中分别加750 μl和75 μl的AP、TEMED，凝胶时间仅需5 min;若分别加入450 μl和45 μl的AP、TEMED，凝胶时间需要30 min以上，因此，可以根据用时调整两者用量。
4 结论
聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率高，能分辨分子量较小的DNA片段，但其操作步骤多，用时长，因此每个操作细节都会影响最终成像结果。只有注意每个操作步骤，才能使DNA条带清晰、特异性条带区分效果明显，从而得到准确的试验结果，为研究DNA分子标记分析提供基础数据。
参考文献
[1] RAYMOND S，WEINTRAUB L.Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis[J].Science，1959，130（3377）：711.
[2] 潘尚领，龙桂芳，陈萍，等.DNA直接银染测序法的建立和优化[J].广西医科大学学报，2001，18（3）：447-448.
[3] 李虹业，范树国，刘玉乐，等.改良聚丙烯酰胺凝胶电泳检测DNA[J].细胞生物学杂志，1999，21（4）：201-203.
[4] 吴建忠，赵东升，黄文功，等.12个亚麻品种亲缘关系的SRAP 分析[J].中国麻业科学，2012（3）：153-156，189.
[5] 吴建忠.亚麻全基因组 DNA 的提取及分析[J].黑龙江农业科学，2011（7）：18-19.
[6] 吴建忠，黄文功，赵东升，等.亚麻 SRAP反应体系的优化和多态性标记筛选[J].中国麻业科学，2011（6）：281-284.
[7] 何庆元，吴萍，张晓红.不同秋眠性苜蓿SRAP体系优化及遗传多样性分析[J].草业学报，2011，20（2）：201-209.
[8] 高凌云，陈丽红，李一伟.PCR-SSCP中聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染法的探讨[J].福建医科大学学报，2001，35（4）：413-414.
[9] 陈香玲，李杨瑞，杨丽涛，等.cDNA-SCOT基因差异表达两种电泳方法的比较研究[J].生物技术通报，2010（10）：93-95.