探讨ITIH4基因表达下调对卵巢上皮性癌 (卵巢癌) 细胞生物学功能的影响。
方法设计4对ITIH4基因小分子干扰RNA (siRNA) 片段,分别为ITIH4-546、ITIH4-795、ITIH4-917和ITIH4-1568,脂质体法瞬时转染ITIH4 mRNA高表达的卵巢癌细胞系HO8910pm细胞,荧光定量逆转录 (RT) PCR技术检测转染后HO8910pm细胞中ITIH4 mRNA的表达,选择最佳沉默效应的siRNA干扰片段 (即ITIH4-917),构建重组表达载体p GPU6/GFP/Neo-shRNA-ITIH4-917质粒,转染HO8910pm细胞,氨基糖苷类抗生素 (G418) 筛选,获得稳定转染细胞系pGPU6/GFP/Neosh RNA-ITIH4-917-HO8910pm细胞,用于以下实验。实验分为3组,即重组表达载体p GPU6/GFP/ Neo-shRNA-ITIH4-917质粒转染HO8910pm细胞组 (ITIH4-917转染组) 、空载体p GPU6/GFP/ Neo-shRNA质粒转染HO8910pm细胞组 (空载体组) 、阴性对照载体p GPU6/GFP/Neo-shRNAITIH4-NC质粒转染HO8910pm细胞组 (阴性对照组),采用荧光定量RT-PCR技术和蛋白印迹法分别检测3组细胞中ITIH4 mRNA和蛋白的表达,四甲基偶氮唑蓝 (MTT) 比色法检测3组细胞的增殖情况[以吸光度 (A) 值表示],流式细胞仪检测3组细胞的细胞周期比例,体外集落形成实验检测3组细胞的集落形成情况,穿膜 (transwell) 小室体外侵袭实验检测3组细胞的体外迁移、侵袭能力 (以A值表示) 。
结果荧光定量PCR技术检测显示,ITIH4-546、ITIH4-795、ITIH4-917和ITIH4-1568瞬时转染后,HO8910pm细胞中ITIH4 mRNA的表达水平分别为1.24±0.74、0.30±0.09、0.26±0.15和0.71±0.35,以ITIH4-917瞬时转染后HO8910pm细胞中ITIH4 mRNA表达水平最低,故选择ITIH4-917用于以下实验。荧光定量RT-PCR技术检测显示,ITIH4-917转染组细胞中ITIH4 mRNA的相对拷贝数为0.34±0.10,明显低于空载体组 (1.87±0.12,P=0.008) 和阴性对照组 (1.58±0.21,P=0.032) ;蛋白印迹法检测显示,ITIH4-917转染组细胞中ITIH4蛋白的相对表达水平为0.51,明显低于空载体组 (1.64,P=0.012) 和阴性对照组 (1.74,P=0.014) 。MTT比色法检测显示,ITIH4-917转染组细胞的增殖速度明显快于空载体组和阴性对照组,分别比较,差异均有统计学意义 (P=0.001) 。流式细胞仪检测显示,ITIH4-917转染组细胞S+ G2/M期细胞的比例为54.2%,明显高于空载体组和阴性对照组 (分别为26.3%和31.3%,P<0.05) 。体外集落形成实验检测显示,ITIH4-917转染组细胞的集落形成率为 (55.7±0.7) %,明显高于空载体组[ (29.7±0.9) %,P=0.037]和阴性对照组[ (31.4±0.3) %,P=0.043]。体外迁移和侵袭能力实验显示,ITIH4-917转染组细胞的迁移能力为0.40±0.18,明显高于阴性对照组 (0.30±0.03,P=0.031) 和空载体组 (0.25±0.03,P=0.028) ;ITIH4-917转染组细胞的侵袭能力为1.31±0.34,虽高于阴性对照组的1.05±0.68和空载体组的1.14±0.08,但差异无统计学意义 (P>0.05) 。
结论采用siRNA干扰片段对卵巢癌细胞中ITIH4基因进行干扰,有效地抑制其ITIH4基因的表达,并使卵巢癌细胞的增殖速度加快、迁移能力增强。