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摘要：湖羊是中国南方唯一的绵羊品种，耐湿热是其重要的特色性状之一。但目前关于其耐湿热机制尚不清楚。本研究以湖羊为研究对象，通过转录组测序技术鉴定热应激前后下丘脑组织中的新基因及其差异表达，并通过不同数据库比对和分析，进行新基因功能注释。结果表明，热应激前后在湖羊下丘脑组织中共检测到1990个新转录本，通过功能注释，发现1344個新基因。在热应激组和对照组湖羊中，差异表达新基因186个，其中130个新基因表达上调，56个新基因表达下调，通过比对发现这些基因分别与细胞免疫、繁殖、生长代谢及相关信号通路相关。Real-time PCR验证试验结果表明，10个热应激前后表达差异基因中有9个与转录组测序结果一致。这些结果为绵羊基因组的进一步完善及基因功能的挖掘提供了一定的数据基础，为全面解析绵羊热应激的分子机制提供更多的依据。
关键词：湖羊;热应激;下丘脑;转录组测序;real-time PCR
中图分类号：Q781
文献标识码：A
文章编号：1000-4440（2019）02-0363-07
热应激是指高温环境下，动物机体对热环境刺激产生的非特异性生理反应的总称。研究结果表明，影响家畜生产性能的主要环境因素有温度、湿度、太阳辐射和风速[2]，在以高太阳辐射和高温著称的热带地区，热应激是一个限制动物发育和生产的主要因素[3]。研究结果表明，急性热应激使鸡生长性能下降，营养成分重分配，脂肪沉积增加[4-5];高温环境破坏蛋鸡内分泌系统进而妨碍生殖活动[6];热应激影响绵羊的产奶量和繁殖性能[7-8]。
热应激原因很简单，但其影响和调控机制到目前为止尚不清楚。通过垂体将神经系统和内分泌系统连接起来的下丘脑组织是一个调节体温的关键中枢[9]。众所周知，下丘脑的前视区（POA）和前下丘脑区（AH）是体温调节中心，下丘脑区域如室旁下丘脑核（PVN）、视神经核（SO）和外侧下丘脑在热应激状态下被激活。热应激状态下，下丘脑通过下丘脑-垂体-肾上腺轴、交感神经系统和其他神经内分泌途径保存或者消散热量，从而调节动物体温[10]。
湖羊是中国南方主要的绵羊品种，具有非常重要的优良特性，在中国低繁殖力绵羊品种遗传改良和新品系培育中做出了一定的贡献，其中耐湿热是众多优良特性之一。本研究以湖羊下丘脑组织为研究对象，在热应激状态和非热应激状态下，通过转录组测序技术、参考基因组比对技术挖掘湖羊新转录本，解析调控湖羊热应激的差异表达新基因，并进行功能注释，为进一步解析热应激调控的分子机制提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验动物与试验设计
一周岁健康、体质量[（33.00 1.58）kg]相近的湖羊母羊6只，急性热应激组和对照组各3只，自由采食和饮水。急性热应激组温度42℃ 左右4 h，热应激模型和温度参照文献[11];对照组温度22℃ 左右。基础饲料组成及营养水平见文献[12]。
1.2 样品采集及RNA提取
热应激组和对照组湖羊处理后立即屠宰，取完整的下丘脑组织置于液氮中贮存。在液氮中将整个下丘脑组织研磨完全，用Trizol 法提取总RNA，并分别采用Nanodrop、Qubit 2.0和Agilent 2100方法检测RNA样品的纯度、浓度和完整度等，符合测序要求的RNA送往北京百迈客生物科技有限公司进行转录组测序。
1.3 cDNA文库构建和测序
使用NEBNext UltraTM RNA文库试剂盒（NEB，美国），按照其说明书进行文库构建，具体步骤参照文献[13]。应用llumina Hiseq 2500高通量测序平台对构建的eDNA文库进行测序，测序读取长度为125 bp（双末端测序）。
1.4 RNA-seq分析
将原始数据进行数据过滤获得高质量的Cleandata，利用TopHat2将Clean reads 与参考基因组进行序列比对，并统计比对效率。使用Cufflinks软件对新转录本和新基因的表达水平进行定量。同时对差异表达基因（DEG）进行统计，以差异倍数（FC）≥2且错误发现率（FDR）
关键词：湖羊;热应激;下丘脑;转录组测序;real-time PCR
中图分类号：Q781
文献标识码：A
文章编号：1000-4440（2019）02-0363-07
热应激是指高温环境下，动物机体对热环境刺激产生的非特异性生理反应的总称。研究结果表明，影响家畜生产性能的主要环境因素有温度、湿度、太阳辐射和风速[2]，在以高太阳辐射和高温著称的热带地区，热应激是一个限制动物发育和生产的主要因素[3]。研究结果表明，急性热应激使鸡生长性能下降，营养成分重分配，脂肪沉积增加[4-5];高温环境破坏蛋鸡内分泌系统进而妨碍生殖活动[6];热应激影响绵羊的产奶量和繁殖性能[7-8]。
热应激原因很简单，但其影响和调控机制到目前为止尚不清楚。通过垂体将神经系统和内分泌系统连接起来的下丘脑组织是一个调节体温的关键中枢[9]。众所周知，下丘脑的前视区（POA）和前下丘脑区（AH）是体温调节中心，下丘脑区域如室旁下丘脑核（PVN）、视神经核（SO）和外侧下丘脑在热应激状态下被激活。热应激状态下，下丘脑通过下丘脑-垂体-肾上腺轴、交感神经系统和其他神经内分泌途径保存或者消散热量，从而调节动物体温[10]。
湖羊是中国南方主要的绵羊品种，具有非常重要的优良特性，在中国低繁殖力绵羊品种遗传改良和新品系培育中做出了一定的贡献，其中耐湿热是众多优良特性之一。本研究以湖羊下丘脑组织为研究对象，在热应激状态和非热应激状态下，通过转录组测序技术、参考基因组比对技术挖掘湖羊新转录本，解析调控湖羊热应激的差异表达新基因，并进行功能注释，为进一步解析热应激调控的分子机制提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验动物与试验设计
一周岁健康、体质量[（33.00 1.58）kg]相近的湖羊母羊6只，急性热应激组和对照组各3只，自由采食和饮水。急性热应激组温度42℃ 左右4 h，热应激模型和温度参照文献[11];对照组温度22℃ 左右。基础饲料组成及营养水平见文献[12]。
1.2 样品采集及RNA提取
热应激组和对照组湖羊处理后立即屠宰，取完整的下丘脑组织置于液氮中贮存。在液氮中将整个下丘脑组织研磨完全，用Trizol 法提取总RNA，并分别采用Nanodrop、Qubit 2.0和Agilent 2100方法检测RNA样品的纯度、浓度和完整度等，符合测序要求的RNA送往北京百迈客生物科技有限公司进行转录组测序。
1.3 cDNA文库构建和测序
使用NEBNext UltraTM RNA文库试剂盒（NEB，美国），按照其说明书进行文库构建，具体步骤参照文献[13]。应用llumina Hiseq 2500高通量测序平台对构建的eDNA文库进行测序，测序读取长度为125 bp（双末端测序）。
1.4 RNA-seq分析
将原始数据进行数据过滤获得高质量的Cleandata，利用TopHat2将Clean reads 与参考基因组进行序列比对，并统计比对效率。使用Cufflinks软件对新转录本和新基因的表达水平进行定量。同时对差异表达基因（DEG）进行统计，以差异倍数（FC）≥2且错误发现率（FDR）