蛋白质/多肽类药物因分子量相对较大、结构复杂,传统的理化分析方法(如LC-MS/MS)并不适用这类生物制剂的药代动力学研究;而根据其所具有的免疫学特性,可采用标记的免疫测定方法(如放射免疫测定、酶联免疫吸附试验等)对其进行药代动力学研究。放射免疫测定因标记物放射性同位素易衰变导致的试剂盒有效期短、对环境带来的不可避免的污染以及对实验人员一定程度的辐射伤害的缺点,在实际应用上有一定的局限性。而酶联免疫吸附试验不具有这些缺点,且同样具备放射免疫测定特异性强、灵敏度高的优点,因而有着更为广泛的应用前景。蛋白质/多肽类药物按其免疫学特性可分为抗原或抗体两大类。对于具备抗原特性的蛋白质/多肽类药物,通常可采用双抗体夹心法来测定生物基质中药物的浓度,但当某一类蛋白质/多肽类药物分子量较小,不具备多个抗原表位时,可采用竞争法来进行测定。对于具备抗体特性的蛋白质/多肽类药物,通常采用间接法来测定生物基质中药物的浓度。通常应优先考虑购买商品试剂盒来用于蛋白质/多肽类药物研究,当商品试剂盒不可获得时,可自行构建酶联免疫吸附试验方法用于测定。因蛋白质/多肽类药物研发的最终目的是应用于临床,而药代动力学试验是在动物体内进行,因此在应用酶联免疫吸附试验进行这类药物的药代动力学研究时,应充分考虑这一点,在检测之间应对所使用的方法进行验证。酶联免疫吸附试验方法学验证过程中,应考察标准曲线的线性范围、分析的准确性和精密度、基质效应、标本的稳定性、回收率等。标准曲线的线性范围不宜太窄,否则将不利于药代动力学标本的检测;精密度考察时应同时考察批内精密度和批间精密度;标本稳定性考察应根据实际研究中的标本量和检测时间设置相应的稳定性考察周期,如一周的短期稳定性考察或一月及以上的长期稳定性考察。在应用酶联免疫吸附试验进行药代动力学标本检测时,应充分考虑不同采集时间标本最适检测稀释度的差别,最适检测稀释度的选择与动物的给药途径和剂量密切相关,可在正式检测前有针对性地选择个别动物部分采集时间点的标本预设数个不同稀释度进行预试验以确定正式试验中所实际应用的最适检测稀释度。在进行酶联免疫吸附试验时,应在每一块酶标板上都设置空白孔、标准曲线孔、质控孔。酶联免疫吸附试验的标准曲线应设置至少5个不同浓度点,质控也应设置至少2个不同浓度点,最好能设置高、中、低3个浓度点,浓度值涵盖于标准曲线的线性范围之内。考虑到酶联免疫吸附试验的特点,质控的可接受标准应设置在理论值的80%～120%范围内。酶联免疫吸附实验由于步骤多、时间长,影响检测质量的因素多,因此在检测过程中应严格按操作程序进行操作并做好相应记录。另外也要注意内源性物质对测定的干扰以及给药后动物体内可能出现的中和抗体所导致的药代动力学参数特征的改变。