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摘要 [目的]为了提高中草药的有效成分含量及生物学效价。[方法]以复合益生菌（干酪乳杆菌、粪肠球菌、产朊假丝酵母）固态发酵复方中草药（王不留行和益母草），分别测定总黄酮、总生物碱、粗多糖和总皂苷的含量，研究复合益生菌发酵前后中草药成分的变化。[结果]中草药经微生物发酵后，可溶性总黄酮、总生物碱、粗多糖和总皂苷含量分别比未发酵组提高了55.14%、127.28%、55.42%和49.21%。[结论]复方中草药经过复合微生物发酵后其可溶性活性成分得到了显著提高，为中草药的深加工提供了依据。
关键词 复合益生菌；微生物发酵；中草药；活性成分
中图分类号 R284 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）34-0123-03
Abstract [Objective]In order to increase the effective components and biological value of Chinese herbs.[Methods]The compound probiotics such as Lactobacillus casei，Enterococcus faecalis and Candida utilis were used to ferment Chinese herbs （Semen vaccariae and Leonurus artemisia），the contents of total flavonoids，total alkaloids，crude polysaccharides and total saponins were determined，and the changes of Chinese herbal medicine components before and after fermentation were studied.[Result] The contents of soluble total flavonoids，total alkaloid，crude polysaccharide and total saponin in the fermented Chinese herbs were significantly increased by 55.14%，127.28%，55.42% and 49.21%，compared with the natural herbs.[Conclusion] The effective components of Chinese herbs are improved after probiotic fermentation，which can help the further processing and application of herbs.
Key words Compound probiotics；Microbial fermentation； Chinese herbs；Active ingredients
微生物发酵中草药集合了中草药、酶制剂、益生素3种物质优点，具有天然无毒、无副作用、无残留、安全和清洁的优势[1-2]。中草药的有效药用成分十分复杂，主要包括生物碱、皂苷类、挥发油、黄酮类、多糖类、有机酸以及矿物元素和维生素，这些活性成分有助于增强机体免疫功能、抗应激功能和抗菌等作用[3-5]。研究发现，王不留行的主要成分黄酮苷类具有促进乳腺上皮细胞增殖与分泌的功能[6]；通过优化超声法提取王不留行多糖后发现，王不留行多糖具有较强的抗氧化活性[7]。益母草所含的糖類、挥发油和生物碱类等有效成分，具有调经活血及利尿消肿之功效，对于兴奋子宫、降低血液黏度、改善肾脏功能等具有明显作用[8]。益生菌可在其代谢过程中，对中药中某些活性成分如有机酸、多糖类等进行分解，产生的分解产物可促进自身的繁殖[9-10]。很多中草药物由于自身结构不能被机体有效直接吸收利用，而是作为前体物，经肠道菌群的处理后，才能发挥药效[11-12]。研究表明，含苷类物质的中草药需要经微生物分泌的丰富酶类分解，成为具有药物活性的苷元后，才能发挥其药效[12]。为提高中草药中的活性成分，增加中草药的利用率，该试验采用产朊假丝酵母、粪肠球菌、干酪乳杆菌3种复合益生菌发酵益母草和王不留行，分别测定总黄酮、总生物碱、粗多糖和总皂苷的含量，进一步确定复合益生菌发酵前后中草药成分的变化，为中草药的深加工和实际应用提供依据。
1 材料与方法
1.1 试材
1.1.1 中草药。王不留行和益母草，由河南德邻生物制品有限公司提供，粉碎后过60目筛，装入密封袋备用。
1.1.2 试验菌种。产朊假丝酵母、干酪乳杆菌和粪肠球菌，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，由河南德邻生物制品有限公司保存和扩繁。
1.2 培养基的制备及微生物培养
1.2.1 MRS液体培养基。胰蛋白胨15 g、葡萄糖20 g、酵母浸粉10 g、吐温-80 1 mL、硫酸镁0.2 g、乙酸钠2 g、磷酸氢二钾2 g、柠檬酸钠2 g、硫酸锰0.05 g，搅拌均匀后用蒸馏水定容至1 L，固体培养基可另外加入20 g 琼脂。在121 ℃、0.15 MPa高压蒸汽灭菌20 min后备用。干酪乳杆菌和粪肠球菌分别经过MRS固体培养基培养筛选纯化之后，分别接种至MRS液体培养基对其进行扩繁，37 ℃静置培养24 h，得到干酪乳杆菌和粪肠球菌的菌液，调整有效活菌数为1.0×109 cfu/mL。
1.2.2 YPD液体培养基。酵母浸粉10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g、蒸馏水定容至1 L，固体培养基可另外加入20 g 琼脂。在121 ℃、0.15 MPa高压蒸汽灭菌20 min备用。产朊假丝酵母菌经过YPD固体培养筛选纯化后，接种至YPD液体培养基中培养24 h，培养条件为28 ℃和200 r/min，得到产朊假丝酵母菌的菌液，调整有效活菌数为1.0×109 cfu/mL。 1.3 复合益生菌湿态发酵中草药 复合益生菌发酵中药配方如表1，各组分搅拌均匀后在37 ℃条件下发酵72 h，然后在湿态条件下取样分析。对照组不接种微生物，只加入相应比例的无菌培养基，其他配方和处理条件与试验组相同。
1.4 总黄酮的测定 首先利用已报道的试验方法及操作流程制作芦丁标准曲线[13]，然后进行黄酮含量的测定。具体方法如下：准确称取待测样品3.00 g，置于200 mL索氏抽提三角瓶中，加入90 mL 70%乙醇，65 ℃恒温浸提3 h，重复提取1次，定容于100 mL容量瓶作为样品液。取2 mL样品液，放入25 mL的比色管中，加入1 mL 5%亚硝酸钠溶液，摇匀后静置6 min；加入1.0 mL 5%硝酸铝溶液，摇匀后静置6 min；加入10.0 mL 4%氢氧化钠溶液，用30%乙醇溶液定容至25 mL，摇匀后放置15 min，在510 nm处测定吸光度。根据标准曲线换算样品液中总黄酮浓度，再进一步计算原料中总黄酮提取率。总黄酮含量（mg/g）=C×12.5/样品重量（g），其中，C为测试液中黄酮浓度（mg/mL），12.5为稀释倍数。
1.5 总生物碱的测定 样品中总生物碱含量的计算可参照付君叶等[14]的试验方法。生物碱的纯品不易单独分离得到，雷氏盐可以在酸性介质中与生物碱结合生成络合物沉淀，而沉淀在溶于丙酮后所形成的紫红色溶液在波长525 nm处有最大吸光度。总生物碱含量的计算公式为：W=A×M×V/ε，式中，W为总生物碱含量（mg/g），M=179.63为水苏碱盐酸盐相对分子质量，ε为雷氏盐在丙酮中的克分子吸收系数为106.5（单盐），V为所取丙酮的体积，A为525 nm处测得的吸光度。
1.6 粗多糖的测定 采用苯酚法-硫氨法进行粗多糖提取[15-16]。吸取提取液2 mL置于25 mL比色管中，取双馏水2 mL置于另一比色管中，分别加入新配置5%苯酚试剂1 mL，再迅速滴加5 mL浓硫酸，摇匀后室温放30 min。以双馏水作为空白对照组，于485 nm处测定吸光值。粗多糖浓度的计算方法为：W=（C×V1×n）/（V2×M×108.16），式中，W为可溶性粗多糖含量（%），C为标准方程求得的糖量，V1为提取液量，n为稀释倍数，V2为吸取样品液体积，M为样品重量，108.16为葡萄糖分子质量。
1.7 总皂苷的测定 参照洪奎等[17]方法进行总皂苷提取。吸取供试品溶液各1 mL，置于10 mL比色管中，70 ℃水浴蒸干，加入0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液和0.8 mL高氯酸，摇匀后置于70 ℃水浴中15 min，取出后流水冷却，加冰醋酸至5 mL，采用紫外分光光度计于540 nm测定吸光度。利用标准曲线计算总皂苷含量。总皂苷濃度（mg/g）=C2×A2/W，其中，C2为测试液中皂苷浓度（mg/mL），A2为稀释倍数，W为样品重量。
1.8 数据统计与分析 数据分析采用SPSS 20.0软件进行ANOVA方差统计分析，结果用平均数±标准差表示，以P<0.05表示差异显著。
2 结果与分析
从表2可以看出，发酵后中草药中的可溶性总黄酮、总生物碱、粗多糖和总皂苷含量分别较未发酵中药提高55.14%（P<0.05）、127.28%（P<0.05）、55.42%（P<0.05）、49.21%（P<0.05）。由此可知，中草药经复合益生菌发酵后，显著提高了可溶性有效活性成分的含量。
3 讨论与结论
发酵技术是中药材的传统炮制方法，其起源可追溯至古老的酿酒技术，在我国有悠久的历史。发酵中药在民间的应用极其广泛，对于多种疾病具有良好的预防与治疗作用。现代微生物发酵研究表明，微生物及其所分泌的多种酶类，可解除植物细胞壁对中药有效成分释放的抑制作用，使释放出活性成分的含量得到大幅度提高，同时发酵过程中还能产生新的生物活性成分。据报道，中药制剂经微生物发酵后，通过HPLC法检测分析，一些成分含量增加1～4倍，而且有新的特征峰产生[18]。黄芪经M-9菌株发酵后多糖含量及得率分别提高84.92%和59.34%[19]。宗凯等[20]采用根霉、枯草芽孢杆菌、黑曲霉等发酵蒲公英，测得发酵后提取液中总黄酮浓度为0.097 mg/mL，约为蒲公英发酵前水提液中总黄酮浓度（0.025 mg/mL）的4倍。另据报道，经白腐菌和纤维素分解菌发酵的甘草渣，发酵后黄酮得率分别为0.89%和0.87%，分别比发酵前提高了34.85%和31.82%[21]；人参经植物乳杆菌发酵后，产物中总皂苷含量提高了32%[22]。此外，杜晨晖等[23]利用酿酒酵母ATCC9763和酿酒酵母GIM2.9对葛根芩连汤进行发酵，结果表明发酵后总生物碱含量分别提高24.91%和30.89%。该研究利用复合益生菌发酵复方中草药，提高了中草药中总黄酮、生物碱、粗多糖和总皂苷等生物活性物质的有效含量，取得了与前人研究相似的结果，为中草药功效的提高奠定了基础。
参考文献
[1] 陈娟娟.发酵中草药在动物生产方面的应用展望[J].山西农业（畜牧兽医），2007，13（8）：12-14.
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[7] 李芸达，颜祖弟，黄涛，等.王不留行多糖的提取工艺及其抗氧化活性研究[J].天然产物研究与开发，2015（3）：446-450.
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[14] 付君叶，宋秋华.利用超声法从益母草中提取总生物碱的研究[J].江西理工大学学报，2012，33（1）：18-20.
[15] 蔡文燕，吴水金，蔡欣.益母草多糖提取工艺的研究[J].热带农业科学，2008，28（6）：39-42.
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[22] 陈旸，王义，孙亮，等.植物乳杆菌发酵转化人参皂苷的研究[J].中国中药杂志，2014， 39（8）：1435-1440.
[23] 杜晨晖，闫艳，冯前进，等.葛根芩连汤发酵前后总黄酮和总生物碱含量变化研究[J].中华中医药杂志，2016，31（11）：4850-4853.
关键词 复合益生菌；微生物发酵；中草药；活性成分
中图分类号 R284 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）34-0123-03
Abstract [Objective]In order to increase the effective components and biological value of Chinese herbs.[Methods]The compound probiotics such as Lactobacillus casei，Enterococcus faecalis and Candida utilis were used to ferment Chinese herbs （Semen vaccariae and Leonurus artemisia），the contents of total flavonoids，total alkaloids，crude polysaccharides and total saponins were determined，and the changes of Chinese herbal medicine components before and after fermentation were studied.[Result] The contents of soluble total flavonoids，total alkaloid，crude polysaccharide and total saponin in the fermented Chinese herbs were significantly increased by 55.14%，127.28%，55.42% and 49.21%，compared with the natural herbs.[Conclusion] The effective components of Chinese herbs are improved after probiotic fermentation，which can help the further processing and application of herbs.
Key words Compound probiotics；Microbial fermentation； Chinese herbs；Active ingredients
微生物发酵中草药集合了中草药、酶制剂、益生素3种物质优点，具有天然无毒、无副作用、无残留、安全和清洁的优势[1-2]。中草药的有效药用成分十分复杂，主要包括生物碱、皂苷类、挥发油、黄酮类、多糖类、有机酸以及矿物元素和维生素，这些活性成分有助于增强机体免疫功能、抗应激功能和抗菌等作用[3-5]。研究发现，王不留行的主要成分黄酮苷类具有促进乳腺上皮细胞增殖与分泌的功能[6]；通过优化超声法提取王不留行多糖后发现，王不留行多糖具有较强的抗氧化活性[7]。益母草所含的糖類、挥发油和生物碱类等有效成分，具有调经活血及利尿消肿之功效，对于兴奋子宫、降低血液黏度、改善肾脏功能等具有明显作用[8]。益生菌可在其代谢过程中，对中药中某些活性成分如有机酸、多糖类等进行分解，产生的分解产物可促进自身的繁殖[9-10]。很多中草药物由于自身结构不能被机体有效直接吸收利用，而是作为前体物，经肠道菌群的处理后，才能发挥药效[11-12]。研究表明，含苷类物质的中草药需要经微生物分泌的丰富酶类分解，成为具有药物活性的苷元后，才能发挥其药效[12]。为提高中草药中的活性成分，增加中草药的利用率，该试验采用产朊假丝酵母、粪肠球菌、干酪乳杆菌3种复合益生菌发酵益母草和王不留行，分别测定总黄酮、总生物碱、粗多糖和总皂苷的含量，进一步确定复合益生菌发酵前后中草药成分的变化，为中草药的深加工和实际应用提供依据。
1 材料与方法
1.1 试材
1.1.1 中草药。王不留行和益母草，由河南德邻生物制品有限公司提供，粉碎后过60目筛，装入密封袋备用。
1.1.2 试验菌种。产朊假丝酵母、干酪乳杆菌和粪肠球菌，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，由河南德邻生物制品有限公司保存和扩繁。
1.2 培养基的制备及微生物培养
1.2.1 MRS液体培养基。胰蛋白胨15 g、葡萄糖20 g、酵母浸粉10 g、吐温-80 1 mL、硫酸镁0.2 g、乙酸钠2 g、磷酸氢二钾2 g、柠檬酸钠2 g、硫酸锰0.05 g，搅拌均匀后用蒸馏水定容至1 L，固体培养基可另外加入20 g 琼脂。在121 ℃、0.15 MPa高压蒸汽灭菌20 min后备用。干酪乳杆菌和粪肠球菌分别经过MRS固体培养基培养筛选纯化之后，分别接种至MRS液体培养基对其进行扩繁，37 ℃静置培养24 h，得到干酪乳杆菌和粪肠球菌的菌液，调整有效活菌数为1.0×109 cfu/mL。
1.2.2 YPD液体培养基。酵母浸粉10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g、蒸馏水定容至1 L，固体培养基可另外加入20 g 琼脂。在121 ℃、0.15 MPa高压蒸汽灭菌20 min备用。产朊假丝酵母菌经过YPD固体培养筛选纯化后，接种至YPD液体培养基中培养24 h，培养条件为28 ℃和200 r/min，得到产朊假丝酵母菌的菌液，调整有效活菌数为1.0×109 cfu/mL。 1.3 复合益生菌湿态发酵中草药 复合益生菌发酵中药配方如表1，各组分搅拌均匀后在37 ℃条件下发酵72 h，然后在湿态条件下取样分析。对照组不接种微生物，只加入相应比例的无菌培养基，其他配方和处理条件与试验组相同。
1.4 总黄酮的测定 首先利用已报道的试验方法及操作流程制作芦丁标准曲线[13]，然后进行黄酮含量的测定。具体方法如下：准确称取待测样品3.00 g，置于200 mL索氏抽提三角瓶中，加入90 mL 70%乙醇，65 ℃恒温浸提3 h，重复提取1次，定容于100 mL容量瓶作为样品液。取2 mL样品液，放入25 mL的比色管中，加入1 mL 5%亚硝酸钠溶液，摇匀后静置6 min；加入1.0 mL 5%硝酸铝溶液，摇匀后静置6 min；加入10.0 mL 4%氢氧化钠溶液，用30%乙醇溶液定容至25 mL，摇匀后放置15 min，在510 nm处测定吸光度。根据标准曲线换算样品液中总黄酮浓度，再进一步计算原料中总黄酮提取率。总黄酮含量（mg/g）=C×12.5/样品重量（g），其中，C为测试液中黄酮浓度（mg/mL），12.5为稀释倍数。
1.5 总生物碱的测定 样品中总生物碱含量的计算可参照付君叶等[14]的试验方法。生物碱的纯品不易单独分离得到，雷氏盐可以在酸性介质中与生物碱结合生成络合物沉淀，而沉淀在溶于丙酮后所形成的紫红色溶液在波长525 nm处有最大吸光度。总生物碱含量的计算公式为：W=A×M×V/ε，式中，W为总生物碱含量（mg/g），M=179.63为水苏碱盐酸盐相对分子质量，ε为雷氏盐在丙酮中的克分子吸收系数为106.5（单盐），V为所取丙酮的体积，A为525 nm处测得的吸光度。
1.6 粗多糖的测定 采用苯酚法-硫氨法进行粗多糖提取[15-16]。吸取提取液2 mL置于25 mL比色管中，取双馏水2 mL置于另一比色管中，分别加入新配置5%苯酚试剂1 mL，再迅速滴加5 mL浓硫酸，摇匀后室温放30 min。以双馏水作为空白对照组，于485 nm处测定吸光值。粗多糖浓度的计算方法为：W=（C×V1×n）/（V2×M×108.16），式中，W为可溶性粗多糖含量（%），C为标准方程求得的糖量，V1为提取液量，n为稀释倍数，V2为吸取样品液体积，M为样品重量，108.16为葡萄糖分子质量。
1.7 总皂苷的测定 参照洪奎等[17]方法进行总皂苷提取。吸取供试品溶液各1 mL，置于10 mL比色管中，70 ℃水浴蒸干，加入0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液和0.8 mL高氯酸，摇匀后置于70 ℃水浴中15 min，取出后流水冷却，加冰醋酸至5 mL，采用紫外分光光度计于540 nm测定吸光度。利用标准曲线计算总皂苷含量。总皂苷濃度（mg/g）=C2×A2/W，其中，C2为测试液中皂苷浓度（mg/mL），A2为稀释倍数，W为样品重量。
1.8 数据统计与分析 数据分析采用SPSS 20.0软件进行ANOVA方差统计分析，结果用平均数±标准差表示，以P<0.05表示差异显著。
2 结果与分析
从表2可以看出，发酵后中草药中的可溶性总黄酮、总生物碱、粗多糖和总皂苷含量分别较未发酵中药提高55.14%（P<0.05）、127.28%（P<0.05）、55.42%（P<0.05）、49.21%（P<0.05）。由此可知，中草药经复合益生菌发酵后，显著提高了可溶性有效活性成分的含量。
3 讨论与结论
发酵技术是中药材的传统炮制方法，其起源可追溯至古老的酿酒技术，在我国有悠久的历史。发酵中药在民间的应用极其广泛，对于多种疾病具有良好的预防与治疗作用。现代微生物发酵研究表明，微生物及其所分泌的多种酶类，可解除植物细胞壁对中药有效成分释放的抑制作用，使释放出活性成分的含量得到大幅度提高，同时发酵过程中还能产生新的生物活性成分。据报道，中药制剂经微生物发酵后，通过HPLC法检测分析，一些成分含量增加1～4倍，而且有新的特征峰产生[18]。黄芪经M-9菌株发酵后多糖含量及得率分别提高84.92%和59.34%[19]。宗凯等[20]采用根霉、枯草芽孢杆菌、黑曲霉等发酵蒲公英，测得发酵后提取液中总黄酮浓度为0.097 mg/mL，约为蒲公英发酵前水提液中总黄酮浓度（0.025 mg/mL）的4倍。另据报道，经白腐菌和纤维素分解菌发酵的甘草渣，发酵后黄酮得率分别为0.89%和0.87%，分别比发酵前提高了34.85%和31.82%[21]；人参经植物乳杆菌发酵后，产物中总皂苷含量提高了32%[22]。此外，杜晨晖等[23]利用酿酒酵母ATCC9763和酿酒酵母GIM2.9对葛根芩连汤进行发酵，结果表明发酵后总生物碱含量分别提高24.91%和30.89%。该研究利用复合益生菌发酵复方中草药，提高了中草药中总黄酮、生物碱、粗多糖和总皂苷等生物活性物质的有效含量，取得了与前人研究相似的结果，为中草药功效的提高奠定了基础。
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