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摘要：目的：通过检测I类整合子基因盒在多重耐药铜绿假单胞菌（PA）中的分布情况以及基因结构，研究其与细菌多重耐药的相关性。方法：筛选出临床分离的多重耐药铜绿假单胞菌60株作为研究对象，利用聚合酶链反应（PCR）法检测其中的I类整合子，并进一步应用PCR法扩增I类整合子检测阳性株耐药基因盒，并应用测序对其所携带的耐药基因进行分析。结果：Ⅰ类整合子在多重耐药铜绿假单胞菌中检出25株阳性株，检测阳性率为41.7%，经PCR进一步扩增所得I类整合子基因盒中发现5个730-2550bp大小的不同基因片段，主要包括氨基糖苷类抗生素抗性基因（包括aadA2、aadA2、aadB腺苷酰基转移酶、aac-6II乙酰基转移酶），编码PSE-1蛋白PSE-1基因，dfrA1二氢叶酸还原酶基因。结论：I类整合子在多重耐药铜绿假单胞茵中检出阳性率较高，并携带有多种耐药基因盒，提示铜绿假单胞茵多重耐药性与I类整合子密切相关。
关键词：铜绿假单胞茵；多重耐药；I类整合子；基因盒
Abstract：Objective：To integrate gene cassettes as well as the distribution of the genetic structure of multi-drug resistant Pseudomonas aeruginosa（PA）by detecting in Class I，multi-drug resistant bacteria studied the correlation.Methods：Screening of multi-drug resistant clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa 60 as the research object，the use of the polymerase chain reaction（PCR）assay in which the class I integron and further amplified by PCR detection of class I integrons positive strains resistant gene cassette and apply its resistance gene sequencing analysis carried.Results：class Ⅰ integron detected in multi-drug resistant Pseudomonas aeruginosa 25 positive strains was 41.7% tested positive by PCR amplification of the proceeds to further the integration of class I gene cassettes found five 730-2550bp size different gene fragments，including the aminoglycoside antibiotic resistance gene（including aadA2，aadA2，aadB adenylyl transferase，aac-6II acetyltransferase），PSE-1 protein encoding PSE-1 gene，dfrA1 dihydrofolate reductase gene.Conclusion：Class I integron detected in multi-drug resistant Pseudomonas aeruginosa Yin positive rate is higher，and carries a variety of drug-resistant gene cassette，suggesting Pseudomonas aeruginosa and multidrug resistance Yin class I integron closely related.
Key words：Pseudomonas aeruginosa；multidrug resistance；class I integron；gene cassettes
銅绿假单胞菌（PA）广泛分布于医院环境中，是院内感染的重要条件致病菌，具有多重耐药性，且易变异、定植，在世界范围内所有院内感染细菌中，PA占10% -15%左右[1]。近年来随着广谱抗生素的滥用，PA耐药性也逐渐提高，在临床各种感染性疾病中具有较高的检出率，尤其是全耐药（PDR）泛耐药（XDR）多重耐药（MDR）菌株的不断涌现，如何治疗PA感染问题已经成为临床治疗的重要课题[2]。在抗生素抗性基因水平转移中最为重要的部分为细菌整合子，其可经其位点特异整合系统识别、捕获各种耐药抗性基因盒，将其整合并表达，从而导致多重耐药产生。为进一步探讨I类整合子与PA多重耐药性的相关性，本文检测了临床分离的多重耐药PA菌株60株中I类整合子的分布情况，并扩增了其中的阳性检测菌株进行测序分析，先将具体分析进行如下报道。
1.材料与方法
1.1 菌株以及药敏试验
60株多重耐药铜绿假单胞菌均来自我院住院患者的非重复临床标本分离所得，对所有收集的菌株的检测、鉴定均采用VITEK Compact全自动鉴定系统，及其所配套的GN卡。在卫生部临床检验中心购置ATCC27853铜绿假单胞菌以及ATCC25922大肠埃希菌作为质控菌株。多重耐药铜绿单胞菌对12种抗生素敏感性采用K-B法（由CLSI推荐）进行测定，以2013年制定的CLSI标准判断药敏试验的结果。
1.2细菌DNA模板提取
细菌NDA模板主要采用细菌基因组DNA提取试剂盒（上海英骏生物技术公司）提取，将配置好的菌悬液放置在水浴（100℃）中，10min后进行离心，取其上层清液保存在-20℃环境中备用。 1.3 I类整合子检测以及可变区扩增
参照文献[4]设计的引物，I类整合子可变区下游引物：5'-GGTGTGGCGGGCTTCGTG-3'，上游引物：5'-GCATCCTCGGTTTTCTGG -3'。由上海英骏生物技术公司完成引物合成。利用聚合酶链反应（PCR）法检测其中的I类整合子，仪器采用Mastercycler gradientPCR扩增仪（由Eppendorf公司生产），检测体系应用50ul反应体系，PCR 条件：DNA3ul模板，各种引物1ul，1ul Taq，4 ul dNTPs，5ul×PCR Buffer，加入无菌蒸馏水至50ul。PCR检测I类整合子的程序为：在94℃环境下进行5 min预变性，在98℃进行1 min变性，55℃下进行30s退火，加温至72℃继续延伸50s，共反应循环35个，最后在72℃温度下延伸5-10 min。应用1%琼脂糖凝胶电泳（加入Gelred）对PCR整合子可变区扩增产物进行分析。
1.4整合子可变区扩增产物测序分析
委托北京诺赛基因组研究中心有限公司对PCR产物进行纯化，并进行双向测序，测序结果应用SeqMan软件（来自DNAStar 软件包）进行拼接，在NCBI数据库中应用BLAST工具对测序拼接结果用进行序列比对分析，分析、确定整合子可变区携带的基因盒种类以及基因盒的排列顺序。
2.结 果
2.1多重耐药铜绿假单胞菌的药物试验结果。60株多重耐药铜绿假单胞菌对12种抗生素的耐药率从高至低依次为氨曲南（88.3%）环丙沙星（68.3%）头孢他啶（56.7%）头孢吡肟（56.7%）庆大霉素（53.3%）哌拉西林（53.3%）妥布霉素（51.7%）哌拉西林/他唑巴坦（41.7%）亚胺培南（38.3%）头孢哌酮/舒巴坦（36.7%）左氧氟沙星（33.3%）阿米卡星（26.7%），如表1所示。
2.2整合子检测结果。Ⅰ类整合子在多重耐药铜绿假单胞菌中检出25株阳性株，检测阳性率为41.7%。经PCR进一步扩增所得I类整合子基因盒中发现730 bp、990 bp、1350 bp、1910 bp、2550bp 5种大小的不同基因片段，主要包括氨基糖苷类抗生素抗性基因（包括aadA2、aadA2、aadB腺苷酰基转移酶、aac-6II乙酰基转移酶），编码PSE-1蛋白PSE-1基因，dfrA1二氢叶酸还原酶基因。
3.讨 论
近年来随着抗菌药物的大量使用，一些医院条件致病菌的耐药性逐渐提高，病原生物感染性疾病的发病率也随之增加，其中铜绿假单胞菌是最为常见的一种医院感染条件菌，多重耐药铜绿假单胞菌的感染问题已经成为困扰广大临床医生最棘手的问题[5-6]。本组研究表明，60株临床分离的多重耐药PA对12种抗生素耐药率中，对于在β-内酰胺类抗生素的耐药率较高，其中主要以氨曲南为代表（88.3%），其次为环丙沙星68.3%，而耐药率最低的阿米卡星——氨基糖苷类抗生素也有26.7%，与大多数文献报道基本一致。由此可见，我国国内铜绿假单胞菌对一些常用抗生素的耐药情况非常严峻。为此，各级医院应加强医院感染控制措施，比如应合理使用抗生素，避免滥用，加强监测细菌的耐药性，加强对医院环境的消毒以及医护人员手的消毒等，尽可能减少多重耐药条件菌株的产生以及传播，有效控制院内感染情况。据相关文献报道[4]，根据整合子-基因盒系统理论分析，铜绿假单胞菌的多重耐药性可能与携带有整合子密切相关。本组研究表明，60株多重耐药铜绿假单胞菌经PCR检测出25株I类整合子阳性株，检测阳性率为41.7%。对25 I类整合子阳性株进一步进行扩增，发现730 bp、990 bp、1350 bp、1910 bp、2550bp 5种大小的不同基因片段，其中以990 bp多见。将扩增产物进行纯化测序分析，730 bp、990 bp、1350 bp中分别携带有aadB、aadA2、aadA6单一耐药基因盒，而1910 bp中分布有aadA2、dfrA1、aadB多种基因盒，2550bp中也分布有PSE-1、aac-6II、aadB多种基因盒。其中aadA2、dfrA1、aadB主要编码的是氨基糖苷类抗生素抗性基因——腺苷酰基转移酶，主要对大观霉素、链霉素具有耐药性；PSE-1基因主要编码PSE-1蛋白，对于头孢盂多、哌拉西林、氨苄西林等具有耐药性；aac-6II主要编码氨基糖苷类抗生素抗性基因——乙酰基转移酶，对卡那霉素、妥布霉素、庆大霉素等具有耐药性；dfrA1编码二氢叶酸还原酶，对甲氧苄啶具有较高的耐药性。本组研究表明多重耐药铜绿假单胞菌对庆大霉素（53.3%）妥布霉素（51.7%）等耐药性均在50%以上，在整合子可变区携带有aac-6II、aadA2、aadA6、aadB等耐药基因盒，可以很好解释铜绿假单胞菌对氨基糖具有较高耐药率的原因。本组药敏试验中表明，铜绿假单胞菌耐药率最高的是氨曲南，但整合子基因盒测序中并未发现与之相关的耐药基因盒，考虑可能有金属酶、AmpC、ESBLs等多种β-内酰胺酶产生有一定联系，是否可能存在其他耐药机制需要临床深入探究。
综上所述，整合子序列中具有可以移动的DNA片段，随着抗生素大量应用，会不断识别、获取、整合、表达各种耐药基因盒，促进多重耐药菌产生。可利用接合性质粒、转座子等促进细菌间多重耐药基因的水平传播，临床医师应对细菌多重耐药性的整合子耐药机制进行深入研究，应合理控制抗生素使用，有效控制医院感染。
参考文献：
[1]顾兵，童明庆，赵文君，等.铜绿假单胞菌多重耐药机制研究[J].中华检验医学杂志，2012，29（12）：1097—1102.
[2]沈继录，朱德妹，王明贵，等.泛耐药铜绿假单胞菌耐药机制研究[J].中华医学杂志，2012，88（26）：1859—1862.
[3]赵祝香，陈惠玲，魏树全，赵子文，叶惠芬. 多药耐药铜绿假单胞菌耐药性及相关耐药基因分析[J]. 中国实验诊断学，2011，7：1159-1162.
[4]李琼，彭喜松.258株铜绿假单胞菌耐药性分析[J].中国感染控制杂志，2011，6（3）：192-193.
[5]黄宏耀，杨宏伟，侯玲俐，莫非.医院感染铜绿假单胞菌耐消毒剂基因研究[J].中华实用诊断与治疗杂志.2010（10）：256-284.
[6]李丰良，韩妮萍，杜廷义，刘海云，郑瑞，黄莹，曾光雄.铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药性的动态变化特征及分析[J].中国药房.2006（10）：189-192.
作者簡介：陈中湘（1978～），男，湖南邵阳人，医学硕士，主管检验师，主要从事临床微生物检验工作。
关键词：铜绿假单胞茵；多重耐药；I类整合子；基因盒
Abstract：Objective：To integrate gene cassettes as well as the distribution of the genetic structure of multi-drug resistant Pseudomonas aeruginosa（PA）by detecting in Class I，multi-drug resistant bacteria studied the correlation.Methods：Screening of multi-drug resistant clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa 60 as the research object，the use of the polymerase chain reaction（PCR）assay in which the class I integron and further amplified by PCR detection of class I integrons positive strains resistant gene cassette and apply its resistance gene sequencing analysis carried.Results：class Ⅰ integron detected in multi-drug resistant Pseudomonas aeruginosa 25 positive strains was 41.7% tested positive by PCR amplification of the proceeds to further the integration of class I gene cassettes found five 730-2550bp size different gene fragments，including the aminoglycoside antibiotic resistance gene（including aadA2，aadA2，aadB adenylyl transferase，aac-6II acetyltransferase），PSE-1 protein encoding PSE-1 gene，dfrA1 dihydrofolate reductase gene.Conclusion：Class I integron detected in multi-drug resistant Pseudomonas aeruginosa Yin positive rate is higher，and carries a variety of drug-resistant gene cassette，suggesting Pseudomonas aeruginosa and multidrug resistance Yin class I integron closely related.
Key words：Pseudomonas aeruginosa；multidrug resistance；class I integron；gene cassettes
銅绿假单胞菌（PA）广泛分布于医院环境中，是院内感染的重要条件致病菌，具有多重耐药性，且易变异、定植，在世界范围内所有院内感染细菌中，PA占10% -15%左右[1]。近年来随着广谱抗生素的滥用，PA耐药性也逐渐提高，在临床各种感染性疾病中具有较高的检出率，尤其是全耐药（PDR）泛耐药（XDR）多重耐药（MDR）菌株的不断涌现，如何治疗PA感染问题已经成为临床治疗的重要课题[2]。在抗生素抗性基因水平转移中最为重要的部分为细菌整合子，其可经其位点特异整合系统识别、捕获各种耐药抗性基因盒，将其整合并表达，从而导致多重耐药产生。为进一步探讨I类整合子与PA多重耐药性的相关性，本文检测了临床分离的多重耐药PA菌株60株中I类整合子的分布情况，并扩增了其中的阳性检测菌株进行测序分析，先将具体分析进行如下报道。
1.材料与方法
1.1 菌株以及药敏试验
60株多重耐药铜绿假单胞菌均来自我院住院患者的非重复临床标本分离所得，对所有收集的菌株的检测、鉴定均采用VITEK Compact全自动鉴定系统，及其所配套的GN卡。在卫生部临床检验中心购置ATCC27853铜绿假单胞菌以及ATCC25922大肠埃希菌作为质控菌株。多重耐药铜绿单胞菌对12种抗生素敏感性采用K-B法（由CLSI推荐）进行测定，以2013年制定的CLSI标准判断药敏试验的结果。
1.2细菌DNA模板提取
细菌NDA模板主要采用细菌基因组DNA提取试剂盒（上海英骏生物技术公司）提取，将配置好的菌悬液放置在水浴（100℃）中，10min后进行离心，取其上层清液保存在-20℃环境中备用。 1.3 I类整合子检测以及可变区扩增
参照文献[4]设计的引物，I类整合子可变区下游引物：5'-GGTGTGGCGGGCTTCGTG-3'，上游引物：5'-GCATCCTCGGTTTTCTGG -3'。由上海英骏生物技术公司完成引物合成。利用聚合酶链反应（PCR）法检测其中的I类整合子，仪器采用Mastercycler gradientPCR扩增仪（由Eppendorf公司生产），检测体系应用50ul反应体系，PCR 条件：DNA3ul模板，各种引物1ul，1ul Taq，4 ul dNTPs，5ul×PCR Buffer，加入无菌蒸馏水至50ul。PCR检测I类整合子的程序为：在94℃环境下进行5 min预变性，在98℃进行1 min变性，55℃下进行30s退火，加温至72℃继续延伸50s，共反应循环35个，最后在72℃温度下延伸5-10 min。应用1%琼脂糖凝胶电泳（加入Gelred）对PCR整合子可变区扩增产物进行分析。
1.4整合子可变区扩增产物测序分析
委托北京诺赛基因组研究中心有限公司对PCR产物进行纯化，并进行双向测序，测序结果应用SeqMan软件（来自DNAStar 软件包）进行拼接，在NCBI数据库中应用BLAST工具对测序拼接结果用进行序列比对分析，分析、确定整合子可变区携带的基因盒种类以及基因盒的排列顺序。
2.结 果
2.1多重耐药铜绿假单胞菌的药物试验结果。60株多重耐药铜绿假单胞菌对12种抗生素的耐药率从高至低依次为氨曲南（88.3%）环丙沙星（68.3%）头孢他啶（56.7%）头孢吡肟（56.7%）庆大霉素（53.3%）哌拉西林（53.3%）妥布霉素（51.7%）哌拉西林/他唑巴坦（41.7%）亚胺培南（38.3%）头孢哌酮/舒巴坦（36.7%）左氧氟沙星（33.3%）阿米卡星（26.7%），如表1所示。
2.2整合子检测结果。Ⅰ类整合子在多重耐药铜绿假单胞菌中检出25株阳性株，检测阳性率为41.7%。经PCR进一步扩增所得I类整合子基因盒中发现730 bp、990 bp、1350 bp、1910 bp、2550bp 5种大小的不同基因片段，主要包括氨基糖苷类抗生素抗性基因（包括aadA2、aadA2、aadB腺苷酰基转移酶、aac-6II乙酰基转移酶），编码PSE-1蛋白PSE-1基因，dfrA1二氢叶酸还原酶基因。
3.讨 论
近年来随着抗菌药物的大量使用，一些医院条件致病菌的耐药性逐渐提高，病原生物感染性疾病的发病率也随之增加，其中铜绿假单胞菌是最为常见的一种医院感染条件菌，多重耐药铜绿假单胞菌的感染问题已经成为困扰广大临床医生最棘手的问题[5-6]。本组研究表明，60株临床分离的多重耐药PA对12种抗生素耐药率中，对于在β-内酰胺类抗生素的耐药率较高，其中主要以氨曲南为代表（88.3%），其次为环丙沙星68.3%，而耐药率最低的阿米卡星——氨基糖苷类抗生素也有26.7%，与大多数文献报道基本一致。由此可见，我国国内铜绿假单胞菌对一些常用抗生素的耐药情况非常严峻。为此，各级医院应加强医院感染控制措施，比如应合理使用抗生素，避免滥用，加强监测细菌的耐药性，加强对医院环境的消毒以及医护人员手的消毒等，尽可能减少多重耐药条件菌株的产生以及传播，有效控制院内感染情况。据相关文献报道[4]，根据整合子-基因盒系统理论分析，铜绿假单胞菌的多重耐药性可能与携带有整合子密切相关。本组研究表明，60株多重耐药铜绿假单胞菌经PCR检测出25株I类整合子阳性株，检测阳性率为41.7%。对25 I类整合子阳性株进一步进行扩增，发现730 bp、990 bp、1350 bp、1910 bp、2550bp 5种大小的不同基因片段，其中以990 bp多见。将扩增产物进行纯化测序分析，730 bp、990 bp、1350 bp中分别携带有aadB、aadA2、aadA6单一耐药基因盒，而1910 bp中分布有aadA2、dfrA1、aadB多种基因盒，2550bp中也分布有PSE-1、aac-6II、aadB多种基因盒。其中aadA2、dfrA1、aadB主要编码的是氨基糖苷类抗生素抗性基因——腺苷酰基转移酶，主要对大观霉素、链霉素具有耐药性；PSE-1基因主要编码PSE-1蛋白，对于头孢盂多、哌拉西林、氨苄西林等具有耐药性；aac-6II主要编码氨基糖苷类抗生素抗性基因——乙酰基转移酶，对卡那霉素、妥布霉素、庆大霉素等具有耐药性；dfrA1编码二氢叶酸还原酶，对甲氧苄啶具有较高的耐药性。本组研究表明多重耐药铜绿假单胞菌对庆大霉素（53.3%）妥布霉素（51.7%）等耐药性均在50%以上，在整合子可变区携带有aac-6II、aadA2、aadA6、aadB等耐药基因盒，可以很好解释铜绿假单胞菌对氨基糖具有较高耐药率的原因。本组药敏试验中表明，铜绿假单胞菌耐药率最高的是氨曲南，但整合子基因盒测序中并未发现与之相关的耐药基因盒，考虑可能有金属酶、AmpC、ESBLs等多种β-内酰胺酶产生有一定联系，是否可能存在其他耐药机制需要临床深入探究。
综上所述，整合子序列中具有可以移动的DNA片段，随着抗生素大量应用，会不断识别、获取、整合、表达各种耐药基因盒，促进多重耐药菌产生。可利用接合性质粒、转座子等促进细菌间多重耐药基因的水平传播，临床医师应对细菌多重耐药性的整合子耐药机制进行深入研究，应合理控制抗生素使用，有效控制医院感染。
参考文献：
[1]顾兵，童明庆，赵文君，等.铜绿假单胞菌多重耐药机制研究[J].中华检验医学杂志，2012，29（12）：1097—1102.
[2]沈继录，朱德妹，王明贵，等.泛耐药铜绿假单胞菌耐药机制研究[J].中华医学杂志，2012，88（26）：1859—1862.
[3]赵祝香，陈惠玲，魏树全，赵子文，叶惠芬. 多药耐药铜绿假单胞菌耐药性及相关耐药基因分析[J]. 中国实验诊断学，2011，7：1159-1162.
[4]李琼，彭喜松.258株铜绿假单胞菌耐药性分析[J].中国感染控制杂志，2011，6（3）：192-193.
[5]黄宏耀，杨宏伟，侯玲俐，莫非.医院感染铜绿假单胞菌耐消毒剂基因研究[J].中华实用诊断与治疗杂志.2010（10）：256-284.
[6]李丰良，韩妮萍，杜廷义，刘海云，郑瑞，黄莹，曾光雄.铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药性的动态变化特征及分析[J].中国药房.2006（10）：189-192.
作者簡介：陈中湘（1978～），男，湖南邵阳人，医学硕士，主管检验师，主要从事临床微生物检验工作。