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目的：探讨成簇的、规律间隔的短回文重复序列-相关核酸酶9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated protein-9 nuclease, CRISPR-Cas9)技术的抗乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)作用。方法：通过生物信息学筛选，获得12条靶向HBV基因组不同区域的sgRNA（single- guide RNA, sgRNA）并分别构建pspCas9-sgRNA质粒，与HBV1.3倍体复制质粒共转染至HepG2细胞，通过荧光定量PCR筛选能够有效抑制HBV复制的sgRNA，并使用Southern blot验证获得的sgRNA功能；使用最新报道的重组共价闭合环状DNA(recombinant covalently closed circular DNA, rcccDNA)模型评估 CRISPR-Cas9对HBV共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA, cccDNA)的抑制水平，并通过克隆测序检测rcccDNA的突变状况；对C57小鼠进行尾静脉高压水动力注射(hydrodynamic injection, HDI)rcccDNA质粒与pspCas9-sgRNA，检测不同时间点外周血中乙型肝炎病毒s抗原(hepatitis B virus surface antigen, HBsAg)及e抗原(hepatitis B virus e antigen, HBeAg)水平，通过免疫组化技术观察CRISPR-Cas9处理后肝脏中乙型肝炎病毒核心抗原(hepatitis B virus core antigen, HBcAg)水平，在动物水平评估CRISPR-Cas9对HBV复制的抑制作用。结果：所筛选的靶向乙型肝炎病毒基因组聚合酶编码区以及衣壳蛋白编码区的sgRNA5及sgRNA9能有效抑制细胞中HBV复制，分别使细胞复制模型中rcDNA降低至对照组的(43.64±4.66)%(P=0.000)和(44.86±2.25)%(P=0.000)；在rCCCDNA细胞模型中证实2组sgRNA分别使cccDNA降低至对照组的(29.39±3.18)%(P=0.000)及(26.83±1.76)%(P=0.000)；CRISPR-Cas9系统主要使rcccDNA的靶点区域发生以短片段缺失为主的突变，突变率位50%~60%。CRISPR-Cas9系统能够有效降低HBV水动力小鼠模型血清HBsAg(sgRNA5：P=0.000；sgRNA9：P=0.001)及HBeAg浓度(sgRNA5：P=0.000；sgRNA9：P=0.000)；小鼠血清HBV DNA水平与对照组相比降低约1个lg值(sgRNA5：P=0.000；sgRNA9：P=0.001)，肝脏免疫组化结果显示CRISPR-Cas9系统能够降低组织HBcAg表达。结论：CRISPR-Cas9系统作为一种基因编辑技术，能够在细胞水平及动物模型中发挥抗HBV作用，可以作为一种新型的抗病毒策略并为HBV感染的治疗提供了一个新的方向。