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摘 要 果胶裂解酶是炭疽菌在侵染寄主过程中降解寄主细胞壁的一类重要水解酶。本研究在杧果炭疽病菌中克隆获得了3个果胶裂解酶基因Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3，DNA全长分别为1 037、1 498、1 089 bp，cDNA全长分别为975、1 380、978 bp，分别编码324、459、325个氨基酸，均含1个果胶裂解酶保守结构域，均有典型的信号肽，不存在跨膜结构。其二级结构中α-螺旋分别占16.05%、20.26%、16.92%，延伸链分别占28.09%、21.79%、29.54%，β-转角分别占5.86%、8.93%、7.38%，无规则卷曲分别占50.00%、49.02%、46.15%。Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3的氨基酸序列分别与C. tofieldiae（KZL77240.1）、草莓炭疽菌（C. gloeosporioides）（XP-007274932.1）、C. incanum（KZL84476.1）果胶裂解酶序列相似度在93%以上。qRT-PCR分析发现，3个果胶裂解酶基因在整个侵染过程中均持续高效表达，但在漆酶基因Lac1敲除突变体中，表达均下降約90%。可见Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3是果胶裂解酶基因家族成员，序列差异较大，在侵染过程中起着重要的作用，且其表达受漆酶基因Lac1影响。
关键词 杧果;胶孢炭疽菌;果胶裂解酶基因;漆酶基因Lac1中图分类号 S432.1 文献标识码 A
DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.12.019
杧果（Mangifera indica L.）是重要的热带、亚热带果树，享有“热带果王”的盛誉，具有很高的经济价值[1]。杧果炭疽病是杧果生产上发生最普遍、为害最严重的一种病害，在世界杧果种植区内广泛发生，也是贮藏期的重要病害之一，发病重的果园减产达60%～70%，胶孢炭疽菌[Colle?totrichum gloeosporioides（Penz.）Sacc.]是其主要致病菌[2-3]。该病原菌寄主范围十分广泛，大多数热带亚热带果树是其重要寄主，还可侵染蔬菜、花卉、中草药及各种经济作物[4]。
炭疽菌主要靠黑色素化附着胞直接侵入寄主，再分泌大量细胞壁降解酶扩展[5]。DHN黑色素在植物病原真菌中普遍存在，它在附着胞膨压产生上起着关键的作用，其合成途径中有多个关键的酶基因，其中漆酶是催化最后一步黑色素合成的酶[6]。在杧果炭疽病菌中，漆酶Lac1在菌丝的生长、发育、分化、黑色素的沉着、产孢和漆酶的分泌以及对寄主的致病力等方面起着重要的调控作用[7]。
果胶酶是细胞壁降解酶中的一类，也是分解果胶质的酶总称，按其作用方式和底物类型可分为原果胶酶、果胶酯酶、裂解酶、多聚半乳糖醛酸酶[8]。许多病原真菌、细菌在侵染植物的过程中都可以产生果胶裂解酶（pel），裂解高度酯化的果胶，破坏植物组织的完整性，使薄壁细胞组织软化[9-10]，从而达到降解植物细胞壁的效果。Erwinia chrysanthemi strain 3937有5个Pel基因PLa～PLe，其中只有PLa、PLd和PLe对病原菌的致病力有影响，且PLe比PLa和PLd的作用更强，PLe突变后失去了侵染能力[11]。辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）的12个候选果胶裂解酶基因中只有Pcpel1、Pcpel16、Pcpel20能够明显影响致病力[9]。可见果胶裂解酶基因多以基因家族形式存在，同一病菌中不同的果胶裂解酶基因作用存在明显差异。将杧果炭疽病菌接种至PD培养液，28 ℃、160 r/min振荡培养12 d的过程中，均能检测到果胶酶活性[12]。有关果胶裂解酶基因的分子特征及其在杧果炭疽病菌侵染寄主过程中的作用尚未见报道。因此本研究拟利用同源克隆技术，从杧果炭疽病菌（C. gloeosporioides）中克隆pel，分析其在不同侵染时段的表达情况，及与另一个侵染关键基因漆酶基因Lac1的关系，为探究果胶裂解酶基因在杧果炭疽病菌致病过程中的作用、揭示杧果炭疽病菌的致病分子机制打下基础。
1.1 材料
1.1.1 材料和引物 杧果炭疽病菌胶孢炭疽菌[C. gloeosporioides（Penz.）Sacc.] A2菌株由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所热带果树课题组提供。台农芒嫩叶采自海南大学热带农林学院基地。漆酶基因Lac1敲除突变体由本实验室提供。本研究所用引物如表1所示。 1.1.2 主要试剂 真菌gDNA提取试剂盒和凝胶回收试剂盒购于Omaga公司;RNA提取试剂盒和TIANScript cDNA First-Stand Kit购于TIANG?ENE公司;E. coli DH5α、10× PCR Buffer、dNTPs、Taq DNA酶、2Taq-Mixture、DNA marker DL2000等均购于TaKaRa公司;荧光定量PCR试剂盒2xTransStart? Tip Green qPCR SuperMix购于北京全式金生物技术科技有限公司，其他试剂均为常规试剂。
1.2 方法
1.2.1 Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3基因DNA序列的扩增 根据橡胶树胶孢炭疽菌HBCg01全基因组信息查找果胶裂解酶基因序列，设计引物A2pel1-F1/R1、5A2pel2-F1/R1、3A2pel2-F1/R1、5A2pel3-F1/R1和3A2pel3-F1/R1（表1），用于扩增杧果炭疽病菌3个果胶裂解酶基因DNA序列。PCR体系为50 μL：10× PCR Buffer 5.0 μL，dNTPs 4.0 μL，引物（10 μmol/L）各1.0 μL，模板1.0 μL，Taq DNA酶1.0 μL，ddH2O 37 μL。PCR程序：94 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s，Tm 45 s，72 ℃ 2 min，35个
1.2.2 Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3基因cDNA的扩增 以杧果炭疽病菌gRNA反转录后的总cDNA为模板，用引物对Rpel1F1/R1、Rpel2F1/R1、Rpel3F1/R1（表1）扩增3个果胶裂解酶基因cDNA序列，其余同1.2.1节。
1.2.3 Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3序列特征分析 利用DNAssist 1.0软件比对分析所獲得的Cgpel1、Cgpel2、Cgpel3基因DNA和cDNA序列，拼接获得全长，并找出起始密码子、终止密码子、内含子、外显子。用Primer 5.0软件推测其编码的氨基酸序列。用ProtParam软件分析其理化性质，包括分子量、等电点等。用MEGA 4.1软件构建进化树。用Singal 3.0软件分析信号肽位置。用TMHMM软件分析跨膜区。用SOPMA软件分析二级结构。
1.2.4 Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3在杧果炭疽病菌侵染台农芒嫩叶过程中的表达分析 以SR作为内参基因，用扩增Rpel1、Rpel2和Rpel3的引物（表1）检测Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3在杧果炭疽病菌侵染台农芒嫩叶过程中的相对表达量。参考张贺等[13]的方法制备浓度为4×106个/mL的分生孢子悬浮液，用于接种嫩叶。用清水洗净嫩叶，浸泡于1% NaClO溶液中15 min后，用超纯水冲洗3次，置于保鲜盒中，保持RH 100%，用束针刺伤嫩叶后滴加20 ?L孢子悬浮液，28 ℃下恒温黑暗培养。接种后的取样时间点为0、6、12、24、36、48、72 h，以0 h的为对照。取样方法：用直径为1 cm的打孔器取12个接种点，按照不同的时间点取样后至于液氮速冻，-80 ℃保存、备用。每组处理重复3次。
参照Tiangen RNA Kit中的方法提取不同时间点的病原菌总RNA，参照TIANScript cDNA First-Stand Kit试剂盒完成第一链cDNA的合成，反转录后的cDNA稀释10倍，备用。实时荧光定量PCR反应体系为10 μL：ddH2O 2 μL，cDNA 1 μL，引物各1 μL，2xTransStart? Tip Green qPCR SuperMix 5 μL，Rotor-Gene Q型实时荧光PCR仪检测。数据分析运用2–ΔΔCt法进行数据计算，实时荧光定量PCR仪系统导出各样品的Ct值，以接菌0 h的为对照。
PCR反应程序为：94 ℃ 30 s;94 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，40个循环;在72 ℃时收集荧光信号。
1.2.5 Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3基因在漆酶基因Lac1敲除突变体的表达分析 提取漆酶基因Lac1敲除突变体和野生型A2总RNA，以在野生型A2中的表达量为对照，以SR作为内参基因，分析Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3在漆酶基因Lac1敲除突变体中的相对表达量。其余参照1.2.4节。每组处理重复3次。
2.1 Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3基因DNA片段的扩增 以杧果炭疽病菌gDNA为模板，扩增获得约2 000 bp Cgpel1基因的DNA片段（图1-A）、约1 300 bp和1 400 bp的Cgpel2兩段DNA片段（图1-B），以及约1 400 bp和1 000 bp的Cgpel3两段DNA片段（图1-C）。克隆测序后，用DNAssist软件比对查找重叠部分后拼接，结果表明Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3基因的DNA全长分别为2 009、2 430、2 065 bp，从起始密码子至终止密码子的大小分别是1 037、1 498、1 089 bp。获得序列与参考数据库橡胶树胶孢炭疽菌HBCg01全基因组相应果胶裂解酶基因序列碱基差异位点分别有62、0、67个。
2.2 Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3基因cDNA片段的扩增
以总cDNA为模板，扩增获得Cgpel1、Cgpel2、Cgpel3基因的cDNA片段大小约750（图2-A）、1 200（图2-B）、750 bp（图2-C）。测序显示大小分别为764、1 209、727 bp。
2.3 Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3序列特征分析
2.3.1 Cgpel1、Cgpel2、Cgpel3基因全长DNA与cDNA序列分析 用DNAssist 1.0软件比对分析Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3的DNA和cDNA序列，拼接获得Cgpel1、Cgpel2、Cgpel3全长cDNA分为975、1 380和978 bp，发现Cgpel1基因编码区含1个62 bp的内含子，Cgpel2含52和66 bp的2个内含子，Cgpel3含56和55 bp的2个内含子，它们的核苷酸分子量大小分别为632.561、840.366和663.680 ku，（G+C） mol%分别是62.10、56.09、58.86（表2）。Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3基因序列已提交在GenBank上，登录号为分别为MH395929.1、MH410608.1和MH423503.1。
2.3.2 Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3基因推定氨基酸序列分析 推测发现Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3的CDS序列分别编码324、459、325个氨基酸（aa），分子量分别为33.09、49.02、33.71 ku，等电点（PI）分别为6.99、6.01、6.70。Cgpel1序列包括206个极性氨基酸，118个非极性氨基酸;Cgpel2包括274个极性氨基酸，185个非极性氨基酸;Cgpel3包括197个极性氨基酸，128个非极性氨基酸。Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3的信号肽长度分别为前24个aa、前19个aa、前15个aa。二级结构中分别含有16.05%、20.26%、16.92%的α-螺旋，28.09%、21.79%、29.54%的延伸链，5.86%、8.93%、7.38%的β-转角，50.00%、49.02%、46.15%的无规则卷曲（表3）。可见3个果胶裂解酶序列差异很大。
与C. tofieldiae果胶裂解酶（KZL77240.1）相似度达93%，Cgpel2与草莓炭疽病菌（C. gloeosporioides Nara gc5）果胶裂解酶（XP_007274?932.1）相似度达97%，Cgpel3与C. incanum（KZL84476.1）相似度达100%。利用NCBI的Blastp软件分析Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3预测蛋白的结构域（图4），发现3个预测的果胶裂解酶蛋白中都含有一个果胶裂解酶特定的保守结构域PL-6或Pectate-lysae，说明Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3都是果胶裂解酶基因。
2.4 Cgpel1， Cgpel2和Cgpel3在杧果炭疽病菌侵染台农芒嫩叶过程中的表达分析
图5表明，Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3在整个侵染过程中均持续高效表达，各个时间点的表达量高于0 h的4倍以上。其中Cgpel1在6 h时表达量最高，Cgpel2在48 h时表达量最高，Cgpel3在各个时间点时表达量都较高。可见3个果胶裂解酶在侵染的不同阶段均发挥着重要的作用，但彼此之间存在差异。 2.5 Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3基因在漆酶基因Lac1敲除突变体中的表达分析
图6表明，在杧果炭疽病菌漆酶基因Lac1敲除突变体中，用实时荧光定量PCR方法分析发现，与野生型相比，Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3的表達量分别下降至0.09、0.114、0.09，下降了90%左右。说明Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3的表达受漆酶Lac1影响。
迄今为止，果胶裂解酶基因的功能已在近10个病原菌中得到了功能鉴定。Shih等在C. gloeo?sporioides f. sp. malvae中克隆了2个pel基因，在侵染过程中表达相似，都与坏死现象有关，有趣的是该研究还发现pel2对葡萄糖类培养基具有依赖性[14];苹果树腐烂病菌（Valsa mali）果胶裂解酶基因Vmpl4突变后，致病力显著降低[15]，番茄炭疽病菌（C. coccodes）果胶裂解酶基因CcpelA 突变后，侵染力和果胶裂解酶的分泌和胞外活性均降低[16];芸苔生链格孢菌（Alternaria brassicicola）的果胶裂解酶基因PL1332突变后，毒力比野生型降低了约30%[17];鳄梨炭疽菌（C. gloeosporioides）果胶裂解酶基因pelB被敲除后，突变体在果实上的致病力较野生菌株下降了36%～45%[18];更为明显的是鞭毛藻丛赤壳菌（Nectria hematococca），其2个PL基因被双敲后，致病性完全丧失[19]。但也有例外，禾谷镰孢菌（Fusarium graminearum）果胶裂解酶PelA基因被敲除后，突变体在侵染小麦胚芽鞘时毒力与野生菌株无差异[20]。果胶裂解酶基因家族中的各成员致病功能差异较大。辣椒疫霉（P. capsici）的12个果胶裂解酶基因中，只有3个基因（Pcpel1、Pcpel16、Pcpel20）能够明显影响辣椒疫霉菌的致病力，其中Pcpel1对致病作用影响最大[9];Erwinia chrysanthemi strain 3937的5个Pel基因中，PLa、PLd和PLe对致病力有影响，且PLe影响最大，PLb和PLc没有影响[11]。可见，植物病原真菌果胶裂解酶基因多以基因家族形式存在，在影响病原菌对糖类的利用、果胶裂解酶活性及对寄主的侵染力、致病性等方面起重要作用，但来源不同或同一来源不同果胶裂解酶基因成员的功能存在明显差异。
本文在前期研究中测定了PD培养液中具有果胶裂解酶的活性，而果胶裂解酶基因家族有多个候选基因，如辣椒疫霉菌有12个家族成员，其中的3个基因与果胶裂解酶的活性有关[9]。本文参照其研究思路，通过实时荧光定量PCR法测定了杧果炭疽菌中3个果胶裂解酶基因在侵染过程中的差异表达，发现3个基因在病原菌侵染杧果叶片6～72 h之间高效表达，从而推测3个果胶裂解酶基因与其活性相关。可以初步确定它们是胶孢炭疽菌的重要致病因子之一。从聚类分析来看，3个果胶裂解酶基因被分布在了3个分支上，且在二级结构上差异很大，在侵染过程的不同阶段表达也存在差异;究竟哪个在杧果炭疽病菌致病力中发挥着更重要的作用、有望成为今后开发农药作用的新靶标，这有待通过基因敲除的方法鉴定。炭疽菌侵入寄主时，不仅要靠菌丝前端黑色素化附着胞借助膨压直接穿透寄主表皮细胞，也需要菌丝前端分泌的细胞壁降解酶辅助分解表皮细胞的组分，如果胶层[5]。漆酶是催化DHN黑色素合成途径上的最后一个酶，理论上推测应该只影响黑色素的合成，与下游细胞壁降解酶如果胶裂解酶的合成和分泌无关，但本研究发现漆酶Lac1对Cgpel1、Cgpel2和 Cgpel3的表达影响很大，这是一个很有趣的新现象。本研究推测二者之间可能存在反馈性抑制，但有待后续敲除3个果胶裂解酶基因后，再通过分析Lac1在pel突变体中的表达情况来证实。
参考文献
关键词 杧果;胶孢炭疽菌;果胶裂解酶基因;漆酶基因Lac1中图分类号 S432.1 文献标识码 A
DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.12.019
杧果（Mangifera indica L.）是重要的热带、亚热带果树，享有“热带果王”的盛誉，具有很高的经济价值[1]。杧果炭疽病是杧果生产上发生最普遍、为害最严重的一种病害，在世界杧果种植区内广泛发生，也是贮藏期的重要病害之一，发病重的果园减产达60%～70%，胶孢炭疽菌[Colle?totrichum gloeosporioides（Penz.）Sacc.]是其主要致病菌[2-3]。该病原菌寄主范围十分广泛，大多数热带亚热带果树是其重要寄主，还可侵染蔬菜、花卉、中草药及各种经济作物[4]。
炭疽菌主要靠黑色素化附着胞直接侵入寄主，再分泌大量细胞壁降解酶扩展[5]。DHN黑色素在植物病原真菌中普遍存在，它在附着胞膨压产生上起着关键的作用，其合成途径中有多个关键的酶基因，其中漆酶是催化最后一步黑色素合成的酶[6]。在杧果炭疽病菌中，漆酶Lac1在菌丝的生长、发育、分化、黑色素的沉着、产孢和漆酶的分泌以及对寄主的致病力等方面起着重要的调控作用[7]。
果胶酶是细胞壁降解酶中的一类，也是分解果胶质的酶总称，按其作用方式和底物类型可分为原果胶酶、果胶酯酶、裂解酶、多聚半乳糖醛酸酶[8]。许多病原真菌、细菌在侵染植物的过程中都可以产生果胶裂解酶（pel），裂解高度酯化的果胶，破坏植物组织的完整性，使薄壁细胞组织软化[9-10]，从而达到降解植物细胞壁的效果。Erwinia chrysanthemi strain 3937有5个Pel基因PLa～PLe，其中只有PLa、PLd和PLe对病原菌的致病力有影响，且PLe比PLa和PLd的作用更强，PLe突变后失去了侵染能力[11]。辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）的12个候选果胶裂解酶基因中只有Pcpel1、Pcpel16、Pcpel20能够明显影响致病力[9]。可见果胶裂解酶基因多以基因家族形式存在，同一病菌中不同的果胶裂解酶基因作用存在明显差异。将杧果炭疽病菌接种至PD培养液，28 ℃、160 r/min振荡培养12 d的过程中，均能检测到果胶酶活性[12]。有关果胶裂解酶基因的分子特征及其在杧果炭疽病菌侵染寄主过程中的作用尚未见报道。因此本研究拟利用同源克隆技术，从杧果炭疽病菌（C. gloeosporioides）中克隆pel，分析其在不同侵染时段的表达情况，及与另一个侵染关键基因漆酶基因Lac1的关系，为探究果胶裂解酶基因在杧果炭疽病菌致病过程中的作用、揭示杧果炭疽病菌的致病分子机制打下基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料和引物 杧果炭疽病菌胶孢炭疽菌[C. gloeosporioides（Penz.）Sacc.] A2菌株由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所热带果树课题组提供。台农芒嫩叶采自海南大学热带农林学院基地。漆酶基因Lac1敲除突变体由本实验室提供。本研究所用引物如表1所示。 1.1.2 主要试剂 真菌gDNA提取试剂盒和凝胶回收试剂盒购于Omaga公司;RNA提取试剂盒和TIANScript cDNA First-Stand Kit购于TIANG?ENE公司;E. coli DH5α、10× PCR Buffer、dNTPs、Taq DNA酶、2Taq-Mixture、DNA marker DL2000等均购于TaKaRa公司;荧光定量PCR试剂盒2xTransStart? Tip Green qPCR SuperMix购于北京全式金生物技术科技有限公司，其他试剂均为常规试剂。
1.2 方法
1.2.1 Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3基因DNA序列的扩增 根据橡胶树胶孢炭疽菌HBCg01全基因组信息查找果胶裂解酶基因序列，设计引物A2pel1-F1/R1、5A2pel2-F1/R1、3A2pel2-F1/R1、5A2pel3-F1/R1和3A2pel3-F1/R1（表1），用于扩增杧果炭疽病菌3个果胶裂解酶基因DNA序列。PCR体系为50 μL：10× PCR Buffer 5.0 μL，dNTPs 4.0 μL，引物（10 μmol/L）各1.0 μL，模板1.0 μL，Taq DNA酶1.0 μL，ddH2O 37 μL。PCR程序：94 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s，Tm 45 s，72 ℃ 2 min，35个
1.2.2 Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3基因cDNA的扩增 以杧果炭疽病菌gRNA反转录后的总cDNA为模板，用引物对Rpel1F1/R1、Rpel2F1/R1、Rpel3F1/R1（表1）扩增3个果胶裂解酶基因cDNA序列，其余同1.2.1节。
1.2.3 Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3序列特征分析 利用DNAssist 1.0软件比对分析所獲得的Cgpel1、Cgpel2、Cgpel3基因DNA和cDNA序列，拼接获得全长，并找出起始密码子、终止密码子、内含子、外显子。用Primer 5.0软件推测其编码的氨基酸序列。用ProtParam软件分析其理化性质，包括分子量、等电点等。用MEGA 4.1软件构建进化树。用Singal 3.0软件分析信号肽位置。用TMHMM软件分析跨膜区。用SOPMA软件分析二级结构。
1.2.4 Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3在杧果炭疽病菌侵染台农芒嫩叶过程中的表达分析 以SR作为内参基因，用扩增Rpel1、Rpel2和Rpel3的引物（表1）检测Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3在杧果炭疽病菌侵染台农芒嫩叶过程中的相对表达量。参考张贺等[13]的方法制备浓度为4×106个/mL的分生孢子悬浮液，用于接种嫩叶。用清水洗净嫩叶，浸泡于1% NaClO溶液中15 min后，用超纯水冲洗3次，置于保鲜盒中，保持RH 100%，用束针刺伤嫩叶后滴加20 ?L孢子悬浮液，28 ℃下恒温黑暗培养。接种后的取样时间点为0、6、12、24、36、48、72 h，以0 h的为对照。取样方法：用直径为1 cm的打孔器取12个接种点，按照不同的时间点取样后至于液氮速冻，-80 ℃保存、备用。每组处理重复3次。
参照Tiangen RNA Kit中的方法提取不同时间点的病原菌总RNA，参照TIANScript cDNA First-Stand Kit试剂盒完成第一链cDNA的合成，反转录后的cDNA稀释10倍，备用。实时荧光定量PCR反应体系为10 μL：ddH2O 2 μL，cDNA 1 μL，引物各1 μL，2xTransStart? Tip Green qPCR SuperMix 5 μL，Rotor-Gene Q型实时荧光PCR仪检测。数据分析运用2–ΔΔCt法进行数据计算，实时荧光定量PCR仪系统导出各样品的Ct值，以接菌0 h的为对照。
PCR反应程序为：94 ℃ 30 s;94 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，40个循环;在72 ℃时收集荧光信号。
1.2.5 Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3基因在漆酶基因Lac1敲除突变体的表达分析 提取漆酶基因Lac1敲除突变体和野生型A2总RNA，以在野生型A2中的表达量为对照，以SR作为内参基因，分析Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3在漆酶基因Lac1敲除突变体中的相对表达量。其余参照1.2.4节。每组处理重复3次。
2 结果与分析
2.1 Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3基因DNA片段的扩增 以杧果炭疽病菌gDNA为模板，扩增获得约2 000 bp Cgpel1基因的DNA片段（图1-A）、约1 300 bp和1 400 bp的Cgpel2兩段DNA片段（图1-B），以及约1 400 bp和1 000 bp的Cgpel3两段DNA片段（图1-C）。克隆测序后，用DNAssist软件比对查找重叠部分后拼接，结果表明Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3基因的DNA全长分别为2 009、2 430、2 065 bp，从起始密码子至终止密码子的大小分别是1 037、1 498、1 089 bp。获得序列与参考数据库橡胶树胶孢炭疽菌HBCg01全基因组相应果胶裂解酶基因序列碱基差异位点分别有62、0、67个。
2.2 Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3基因cDNA片段的扩增
以总cDNA为模板，扩增获得Cgpel1、Cgpel2、Cgpel3基因的cDNA片段大小约750（图2-A）、1 200（图2-B）、750 bp（图2-C）。测序显示大小分别为764、1 209、727 bp。
2.3 Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3序列特征分析
2.3.1 Cgpel1、Cgpel2、Cgpel3基因全长DNA与cDNA序列分析 用DNAssist 1.0软件比对分析Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3的DNA和cDNA序列，拼接获得Cgpel1、Cgpel2、Cgpel3全长cDNA分为975、1 380和978 bp，发现Cgpel1基因编码区含1个62 bp的内含子，Cgpel2含52和66 bp的2个内含子，Cgpel3含56和55 bp的2个内含子，它们的核苷酸分子量大小分别为632.561、840.366和663.680 ku，（G+C） mol%分别是62.10、56.09、58.86（表2）。Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3基因序列已提交在GenBank上，登录号为分别为MH395929.1、MH410608.1和MH423503.1。
2.3.2 Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3基因推定氨基酸序列分析 推测发现Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3的CDS序列分别编码324、459、325个氨基酸（aa），分子量分别为33.09、49.02、33.71 ku，等电点（PI）分别为6.99、6.01、6.70。Cgpel1序列包括206个极性氨基酸，118个非极性氨基酸;Cgpel2包括274个极性氨基酸，185个非极性氨基酸;Cgpel3包括197个极性氨基酸，128个非极性氨基酸。Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3的信号肽长度分别为前24个aa、前19个aa、前15个aa。二级结构中分别含有16.05%、20.26%、16.92%的α-螺旋，28.09%、21.79%、29.54%的延伸链，5.86%、8.93%、7.38%的β-转角，50.00%、49.02%、46.15%的无规则卷曲（表3）。可见3个果胶裂解酶序列差异很大。
与C. tofieldiae果胶裂解酶（KZL77240.1）相似度达93%，Cgpel2与草莓炭疽病菌（C. gloeosporioides Nara gc5）果胶裂解酶（XP_007274?932.1）相似度达97%，Cgpel3与C. incanum（KZL84476.1）相似度达100%。利用NCBI的Blastp软件分析Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3预测蛋白的结构域（图4），发现3个预测的果胶裂解酶蛋白中都含有一个果胶裂解酶特定的保守结构域PL-6或Pectate-lysae，说明Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3都是果胶裂解酶基因。
2.4 Cgpel1， Cgpel2和Cgpel3在杧果炭疽病菌侵染台农芒嫩叶过程中的表达分析
图5表明，Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3在整个侵染过程中均持续高效表达，各个时间点的表达量高于0 h的4倍以上。其中Cgpel1在6 h时表达量最高，Cgpel2在48 h时表达量最高，Cgpel3在各个时间点时表达量都较高。可见3个果胶裂解酶在侵染的不同阶段均发挥着重要的作用，但彼此之间存在差异。 2.5 Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3基因在漆酶基因Lac1敲除突变体中的表达分析
图6表明，在杧果炭疽病菌漆酶基因Lac1敲除突变体中，用实时荧光定量PCR方法分析发现，与野生型相比，Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3的表達量分别下降至0.09、0.114、0.09，下降了90%左右。说明Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3的表达受漆酶Lac1影响。
3 讨论
迄今为止，果胶裂解酶基因的功能已在近10个病原菌中得到了功能鉴定。Shih等在C. gloeo?sporioides f. sp. malvae中克隆了2个pel基因，在侵染过程中表达相似，都与坏死现象有关，有趣的是该研究还发现pel2对葡萄糖类培养基具有依赖性[14];苹果树腐烂病菌（Valsa mali）果胶裂解酶基因Vmpl4突变后，致病力显著降低[15]，番茄炭疽病菌（C. coccodes）果胶裂解酶基因CcpelA 突变后，侵染力和果胶裂解酶的分泌和胞外活性均降低[16];芸苔生链格孢菌（Alternaria brassicicola）的果胶裂解酶基因PL1332突变后，毒力比野生型降低了约30%[17];鳄梨炭疽菌（C. gloeosporioides）果胶裂解酶基因pelB被敲除后，突变体在果实上的致病力较野生菌株下降了36%～45%[18];更为明显的是鞭毛藻丛赤壳菌（Nectria hematococca），其2个PL基因被双敲后，致病性完全丧失[19]。但也有例外，禾谷镰孢菌（Fusarium graminearum）果胶裂解酶PelA基因被敲除后，突变体在侵染小麦胚芽鞘时毒力与野生菌株无差异[20]。果胶裂解酶基因家族中的各成员致病功能差异较大。辣椒疫霉（P. capsici）的12个果胶裂解酶基因中，只有3个基因（Pcpel1、Pcpel16、Pcpel20）能够明显影响辣椒疫霉菌的致病力，其中Pcpel1对致病作用影响最大[9];Erwinia chrysanthemi strain 3937的5个Pel基因中，PLa、PLd和PLe对致病力有影响，且PLe影响最大，PLb和PLc没有影响[11]。可见，植物病原真菌果胶裂解酶基因多以基因家族形式存在，在影响病原菌对糖类的利用、果胶裂解酶活性及对寄主的侵染力、致病性等方面起重要作用，但来源不同或同一来源不同果胶裂解酶基因成员的功能存在明显差异。
本文在前期研究中测定了PD培养液中具有果胶裂解酶的活性，而果胶裂解酶基因家族有多个候选基因，如辣椒疫霉菌有12个家族成员，其中的3个基因与果胶裂解酶的活性有关[9]。本文参照其研究思路，通过实时荧光定量PCR法测定了杧果炭疽菌中3个果胶裂解酶基因在侵染过程中的差异表达，发现3个基因在病原菌侵染杧果叶片6～72 h之间高效表达，从而推测3个果胶裂解酶基因与其活性相关。可以初步确定它们是胶孢炭疽菌的重要致病因子之一。从聚类分析来看，3个果胶裂解酶基因被分布在了3个分支上，且在二级结构上差异很大，在侵染过程的不同阶段表达也存在差异;究竟哪个在杧果炭疽病菌致病力中发挥着更重要的作用、有望成为今后开发农药作用的新靶标，这有待通过基因敲除的方法鉴定。炭疽菌侵入寄主时，不仅要靠菌丝前端黑色素化附着胞借助膨压直接穿透寄主表皮细胞，也需要菌丝前端分泌的细胞壁降解酶辅助分解表皮细胞的组分，如果胶层[5]。漆酶是催化DHN黑色素合成途径上的最后一个酶，理论上推测应该只影响黑色素的合成，与下游细胞壁降解酶如果胶裂解酶的合成和分泌无关，但本研究发现漆酶Lac1对Cgpel1、Cgpel2和 Cgpel3的表达影响很大，这是一个很有趣的新现象。本研究推测二者之间可能存在反馈性抑制，但有待后续敲除3个果胶裂解酶基因后，再通过分析Lac1在pel突变体中的表达情况来证实。
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