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摘要[目的]探寻防治榆紫叶甲病的生防菌株。[方法]从榆紫叶甲虫体上分离菌株后进行培养，并对室内饲养的榆紫叶甲各龄幼虫进行致病性试验。[结果]从感病榆紫叶甲成虫虫体上分离到18个菌株，其中12个菌株具有几丁质和蛋白质降解活性。5个菌株对1～2 龄幼虫表现出不同程度的致病力，在接种后1～3 d幼虫开始死亡，处理后7 d 幼虫的累积死亡率为21.2%～46.8%，其中YJA-03和YJA-10菌株的累积死亡率>30.0%。YJA-03菌株为革兰氏阳性菌，经过形态学、生理生化特性和PCR 扩增鉴定确定它属于短杆菌属（Exiguobacterium）。YJA-10菌株为革兰氏阴性菌，经鉴定其属于Glutamicibacter属。[结论]YJA-03和YJA-10菌株可用作防治榆紫叶甲病的生防菌。
关键词榆紫叶甲；生物防治；菌株分离；生理生化特性
中图分类号S763.38文献标识码A文章编号0517-6611（2017）11-0003-04
Abstract[Objective] To explore the pathogen for the biological control of Ambrostoma quadriimpressum. [Method] Some bacteria strains were isolated from A. quadriimpressum to determine the pathogenicity of Bacillus thuringinensis to each instrar of larvae fed in the laboratory. [Result] 18 bacterial isolates were obtained from diseased adults of A. quadriimpressum， among them 12 isolates showed proteindegrading and chitindegrading activities. 5 isolates showed different pathogenicity to 1stinstar and 2ndinstar larvae of A. quadriimpressum. The larvae began to die during 3-7 d after inoculation， and the accumulative mortality rate of larvae of A. quadriimpressum was 21.2%-46.8%. The accumulative mortality rate of A.quadriimpressum larvae to YJA03 strain and YJA10 strain were more than 30%. YJA03 was identified as Grampositive bacterium， a bacteria of genus Exiguobacterium identified by morphological， physiological and biochemical characteristics and PCR amplification. YJA10 was identified as Gramnegative bacterium， belonging to genus Glutamicibacter. [Conclusion] YJA03 strain and YJA10 strain can be used for the biological control of A. quadriimpressum.
Key wordsAmbrostoma quadriimopressum Motschulsky；Biological control；Strain isolation；Physiological and biochemical characteristics
榆紫叶甲（Ambrostoma quadriimopressum Motschulsky）隶属鞘翅目叶甲科，其食性专一，仅取食榆树芽苞、叶片，常将叶片吃光，使树势衰弱并引起其他病虫危害，在黑龙江、吉林、辽宁和内蒙古等地危害严重[1-2]。近年来，榆树已经逐渐成为城市园林绿化的重要树种，榆紫叶甲的危害程度日益加大，严重影响城市园林绿化景观，同时造成了极大的经济损失。目前，主要依靠广谱性的化学农药进行防治，虽然在短时间内可快速控制种群数量，但是害虫一旦产生抗药性，就会有再度猖獗的现象。同时，也给环境带来了污染，随着人们对环境问题的关注越来越多以及对环境保护意识的增强，人们不断探索以生物农药为主的无公害防治方法。苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringinensis，Bt）因其能够产生杀虫蛋白而被用于防治鳞翅目、鞘翅目和双翅目等害虫[3-4]。国内有关榆紫叶甲的生物防治报道很少，而直接从虫体上分离筛选出防治榆紫叶甲病原菌的研究鲜见报道。笔者从感病的榆紫叶甲虫体上筛选出对榆紫叶甲幼虫具有生防作用的2株菌株JYA-03和JYA-10，并对室内饲养的榆紫叶甲各龄幼虫进行致病性试验，以期从榆紫叶甲虫体上获得可用于对榆紫叶甲控制的生防细菌。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1虫生菌株的分离。感病榆紫叶甲成虫采集于东北林业大学校园内，从虫体上分离到菌株后进行培养，将菌株编号并保存于试管斜面培养基上，于4 ℃冰箱中保存备用。
1.1.2供试昆虫。致病性试验采用榆紫叶甲2龄幼虫，林间采集老熟卵块，经过室内饲养分别获得1～4龄幼虫，用于室内致病性试验。
1.1.3培养基。分离培养和保存虫生细菌的培养基为LB培养基、几丁质琼脂（CA）培養基、牛奶琼脂（MA）培养基，分别用于几丁质酶和蛋白酶活性测定。 1.2方法
1.2.1菌株的分离与纯化。用75%乙醇清洗感病榆紫叶甲成虫5 s，体表消毒后用 0.1%升汞水溶液对虫体表面消毒2～3 min，无菌水清洗2次，将虫体压碎后，用0.85%生理盐水制成菌悬液，水溶悬液（65 ℃ 15 min），取0.1 mL菌悬液涂布于LB平板培养基上，28 ℃下培养48 h。
1.2.2菌株降解酶活性的测定。将分离到的菌株分别接种在CA或MA平板中，培养3 d 后进行观察，发现菌落周围出现透明圆环的即为具有降解活性的菌株，初步推测为致病性菌株。
1.2.3致病性试验。将具有降解酶活性的菌株活化稀释成2.0×109个/mL 的细菌悬浮液。在培养皿（直径9.0 cm 或15.0 cm）中铺上滤纸，每个皿中放入新鲜榆树叶片，将试虫置于叶片上（每皿15 头），室温下进行饲养。用喷雾器将菌液均匀喷在榆树叶片和试虫虫体上，进行室内观察。另外，以灭菌水喷雾叶片和试虫作为对照（CK），每个处理重复3次。处理后1～7 d，每天定时观察并记录虫体发病和死亡情况。
1.2.4测定项目与方法。致病菌确定为可降解几丁质或蛋白质的菌株；致病性试验通过累积死亡率（LR7 d）和致死中时（50%虫体死亡所需的时间，LT50），比较不同菌株之间LR7 d 值的差异，同时通过回归分析建立毒力回归模型。
1.2.5致病菌株的分子学鉴定。致病菌株活化培养36 h后进行革兰氏染色；观察菌落特征、细胞形态和大小；菌株的生理生化特性参照东秀珠等[5]的方法进行测定。
基因组DNA的提取：①取500 μL样品置于2 mL无菌离心管中，11 000 r/min离心10 min。②加入0.8 mL抽提缓冲液[1% CTAB、100 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）、20 mmol/L EDTA（pH 8.0）、700 mmol/L NaCl（pH 8.0）]和20 μL蛋白酶K，充分混匀。37 ℃下水浴30 min，每隔10 min混匀1次。③加入160 μL 10% SDS，充分混匀后，65 ℃水浴1 h，每隔15 min混匀1次。④加入等体积的氯仿，充分混匀，4 ℃ 11 000 r/min 离心10 min。⑤取700 μL上清液置于2 mL离心管中，重复步骤③和④。⑥加入0.6倍体积的异丙醇混匀使其沉淀，离心。⑦加入75%乙醇700 μL，混匀后11 000 r/min离心10 min，弃上清。⑧重复步骤⑥，将沉淀风干。⑨用30 μL TE缓冲液溶解DNA沉淀，使用切胶试剂盒纯化DNA，进行琼脂糖电泳检测。
PCR扩增体系：处理后的样品（70 ng/μL）模板2.0 μL；dNTP Mixture（2.5 mmol/L）2.5 μL；27F（20 μmol/L）1.5 μL；1492R（20 μmol/L）1.5 μL；10 × Ex Taq Buffer（Mg2+ plus）5.0 μL；Ex Taq酶（5 U/μL）0.2 μL；补足ddH2O至50.0 μL。Ex Taq DNA Polymerase等扩增所用试剂均购自TaKaRa公司，PCR Purification Kit 购自Promega，引物由上海生工合成。PCR仪使用Biometra公司生产的Tgradient，凝胶成像分析仪为Bio-Rad 公司的Gel-Doc2000。
参考Goto等的方法[6-8]，以菌株的形态特征以及生理生化特性为基础，根据《伯杰细菌鉴定手册》[8]初步确定各菌株的分类学属名；根据16S rDNA 基因序列的BLASTn 比对结果，最终确定菌株的分类地位。
2结果与分析
2.1榆紫叶甲虫病原菌菌株的分离与纯化采集到的感病榆紫叶甲虫通过对其虫体进行分離与纯化，共得到18个菌株，编号为YJA-01～YJA-18。通过几丁质和蛋白质水解试验测定，其中具有几丁质降解活性的有9株，具有蛋白质降解活性的有8株，能同时降解2种物质的有5株（表1），初步推测这12株菌株是榆紫叶甲的病原菌。
2.2具有酶活性的菌株对榆紫叶甲幼虫的致病性灭菌水（CK）处理后榆紫叶甲幼虫的生长发育正常，全部能按期蜕皮直至预蛹。用虫体分离具有降解酶活性的12个菌株接种榆紫叶甲2龄幼虫，有7个菌株未引起发病，其取食和生长发育未受到影响；5个菌株具有致病性，但其致病性存在差异（表2）。其中，2个菌株YJA-03 和YJA-10的致病性较强，接种后2 d始见虫体死亡，LT50 分别为6.30和8.30 d；其余3个菌株对榆紫叶甲2龄幼虫的致病性较弱，接种5～6 d 始见虫体死亡，LR7d 均在25.00%以下，LT50 均超过5.00 d，其中YJA-13菌株的致病性最低，接种后第6天虫体开始死亡，LR7 d 为2298%，LT50 为30.10 d。
对3个杀虫效果较好的菌株进行毒力回归分析（表3），经t检验可知，这些回归模型都达到显著水平（P<0.05）。通过这些模型可以估计3个菌株对榆紫叶甲2龄幼虫的致病能力。在一定的接种浓度（2.0×109 CFU/mL）下，计算出使50%的2龄榆紫叶甲幼虫死亡所需要的时间（LT50），LT50时间越短，其致病性就越强，即对榆紫叶甲幼虫的杀虫效果越好。由表3可知，菌株YJA-03的致病性最强，LT50仅为6.30 d，其杀虫效果最好。菌株YJA-10的致病性较强，LT50为8.30 d。
2.3致病菌株的形态特征对榆紫叶甲幼虫具有杀虫活性的2株病原菌在LB培养基上进行室内培养，单胞菌落YJA-03呈浅橙色，色素不扩散，菌株表面湿润，菌落平坦，表面略微隆起，光滑，有蜡层（图1A）；菌体幼龄培养物为杆菌，老培养物为球状，菌体大小为（1.1～1.2） μm×（1.4～3.2 ） μm（图1B），革兰氏染色呈阳性，初步鉴定为杆菌[5，9]。YJA-10菌株为淡黄色，表面湿润，略微隆起，光滑，有蜡层（图1C）。革兰氏染色均呈阴性，菌体短杆形，菌体大小（1.16～1.77） μm×（1.35～2.81） μm（图1D）。 2.4榆紫叶甲致病菌株的生理生化特性具有杀虫活性的2株致病菌的各生理生化特性见表4。从碳源和氮源来看，2个菌株都能利用D-葡萄糖、D-果糖、D-蔗糖、甘露醇、NH4H2PO4和KNO3；2个菌株接触酶反应、柠檬酸盐利用和硝酸盐还原反应结果均呈阳性；2个菌株淀粉水解试验、脲酶试验、吲哚试验、V-P试验都呈阴性；甲基红检测YJA-03菌株呈阳性，YJA-10菌株呈阴性，都能在2%NaCl和30～37 ℃正常生长，而在5%～7% NaCl、4和41～45 ℃条件下均不能生长。
注：A，B.菌株YJA-03；C，D.菌株YJA-10
2.5致病菌株的16S rDNA与分子学鉴定以2个致病菌株的基因组DNA为模板，用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增；对扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析（图2），可见提取DNA大小约为1 600 bp；测序后去除首尾非相关序列后，得到各菌株大小1 012～1 268 bp的序列，序列登录到GenBank数据库中并得到它们的登录号。将这些菌株的16S rDNA序列进行Blast分析，结果表明YJA-03与GenBank中的短菌杆属（Exiguobacterium）菌株高度相近；YJA-10则与Glutamicibacter属菌株高度相近（表5）。根据包括2个菌株在内的10个菌株的16S rDNA序列，构建系统进化树（图3）。从16S rDNA系统发育树可以看出，同一种菌不总是聚为一簇，但相隔较近；不同种的菌株在系统进化树上相隔较远；菌株 YJA-03和YJA-10分别处于不同的小分支内，进化上距离较近。
3讨论与结论
利用昆虫病原菌能有效控制害虫的发生危害，在防治害虫的同时，还可以保护自然环境安全[10]。该研究从感病的注：M.DL 2000 Marker；1.YJA-03菌株；2.YJA-10菌株
榆紫叶甲成虫上分离并筛选出2株对其具有致病性的细菌菌株YJA-03和YJA-10，具有一定的开发利用价值。筛选出的生防菌对1 龄、2 龄榆紫叶甲幼虫有很好的杀虫效果，但对高龄幼虫和成虫没有明显的致病性，说明榆紫叶甲等鞘翅目昆虫的高龄幼虫和成虫对细菌的抗性明显高于低龄幼虫，与其他研究报道[11-12]相一致。
凡是对害虫有毒性的细菌（如苏云金杆菌、假单孢菌及色细菌等）都具有几丁质酶和蛋白酶活性[12-14]。该研究先从榆紫叶甲上分离并获得病原菌，由于昆虫表皮的成分主要为几丁质和蛋白质[15]，因此首先研究分離病原菌的几丁质酶和蛋白酶活性，因为幼龄幼虫集中危害嫩叶，室内试验中用细胞悬浮液喷洒于榆树叶片和虫体上，大大增加了病原菌侵入虫体的机会。今后林间野外试验应对昆虫林间发育进度进行调查研究，选择适当的施药时期和合适的气候条件，以保证药剂的杀虫效果。
该研究通过观察2个榆紫叶甲杀虫活性菌株的菌落和菌体形态特征和生理生化特性，结合16S rDNA 序列对比分析鉴定，确定它们分属于短杆菌属（Exiguobacterium）和Glutamicibacter属。前者曾从马铃薯加工废水中提取到，也用于废水处理研究中。目前，还未见到2个菌株侵染昆虫的报道，因此还需要对其杀虫机理、发酵扩繁和制剂配制、应用技术等方面进行深入研究。此外，该研究虽然筛选到对榆紫叶甲具有生防效果的细菌，但不同环境中的榆紫叶甲虫体上还存在其他潜在的生防细菌，今后还需要进行进一步分离筛选和鉴定研究。
参考文献
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关键词榆紫叶甲；生物防治；菌株分离；生理生化特性
中图分类号S763.38文献标识码A文章编号0517-6611（2017）11-0003-04
Abstract[Objective] To explore the pathogen for the biological control of Ambrostoma quadriimpressum. [Method] Some bacteria strains were isolated from A. quadriimpressum to determine the pathogenicity of Bacillus thuringinensis to each instrar of larvae fed in the laboratory. [Result] 18 bacterial isolates were obtained from diseased adults of A. quadriimpressum， among them 12 isolates showed proteindegrading and chitindegrading activities. 5 isolates showed different pathogenicity to 1stinstar and 2ndinstar larvae of A. quadriimpressum. The larvae began to die during 3-7 d after inoculation， and the accumulative mortality rate of larvae of A. quadriimpressum was 21.2%-46.8%. The accumulative mortality rate of A.quadriimpressum larvae to YJA03 strain and YJA10 strain were more than 30%. YJA03 was identified as Grampositive bacterium， a bacteria of genus Exiguobacterium identified by morphological， physiological and biochemical characteristics and PCR amplification. YJA10 was identified as Gramnegative bacterium， belonging to genus Glutamicibacter. [Conclusion] YJA03 strain and YJA10 strain can be used for the biological control of A. quadriimpressum.
Key wordsAmbrostoma quadriimopressum Motschulsky；Biological control；Strain isolation；Physiological and biochemical characteristics
榆紫叶甲（Ambrostoma quadriimopressum Motschulsky）隶属鞘翅目叶甲科，其食性专一，仅取食榆树芽苞、叶片，常将叶片吃光，使树势衰弱并引起其他病虫危害，在黑龙江、吉林、辽宁和内蒙古等地危害严重[1-2]。近年来，榆树已经逐渐成为城市园林绿化的重要树种，榆紫叶甲的危害程度日益加大，严重影响城市园林绿化景观，同时造成了极大的经济损失。目前，主要依靠广谱性的化学农药进行防治，虽然在短时间内可快速控制种群数量，但是害虫一旦产生抗药性，就会有再度猖獗的现象。同时，也给环境带来了污染，随着人们对环境问题的关注越来越多以及对环境保护意识的增强，人们不断探索以生物农药为主的无公害防治方法。苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringinensis，Bt）因其能够产生杀虫蛋白而被用于防治鳞翅目、鞘翅目和双翅目等害虫[3-4]。国内有关榆紫叶甲的生物防治报道很少，而直接从虫体上分离筛选出防治榆紫叶甲病原菌的研究鲜见报道。笔者从感病的榆紫叶甲虫体上筛选出对榆紫叶甲幼虫具有生防作用的2株菌株JYA-03和JYA-10，并对室内饲养的榆紫叶甲各龄幼虫进行致病性试验，以期从榆紫叶甲虫体上获得可用于对榆紫叶甲控制的生防细菌。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1虫生菌株的分离。感病榆紫叶甲成虫采集于东北林业大学校园内，从虫体上分离到菌株后进行培养，将菌株编号并保存于试管斜面培养基上，于4 ℃冰箱中保存备用。
1.1.2供试昆虫。致病性试验采用榆紫叶甲2龄幼虫，林间采集老熟卵块，经过室内饲养分别获得1～4龄幼虫，用于室内致病性试验。
1.1.3培养基。分离培养和保存虫生细菌的培养基为LB培养基、几丁质琼脂（CA）培養基、牛奶琼脂（MA）培养基，分别用于几丁质酶和蛋白酶活性测定。 1.2方法
1.2.1菌株的分离与纯化。用75%乙醇清洗感病榆紫叶甲成虫5 s，体表消毒后用 0.1%升汞水溶液对虫体表面消毒2～3 min，无菌水清洗2次，将虫体压碎后，用0.85%生理盐水制成菌悬液，水溶悬液（65 ℃ 15 min），取0.1 mL菌悬液涂布于LB平板培养基上，28 ℃下培养48 h。
1.2.2菌株降解酶活性的测定。将分离到的菌株分别接种在CA或MA平板中，培养3 d 后进行观察，发现菌落周围出现透明圆环的即为具有降解活性的菌株，初步推测为致病性菌株。
1.2.3致病性试验。将具有降解酶活性的菌株活化稀释成2.0×109个/mL 的细菌悬浮液。在培养皿（直径9.0 cm 或15.0 cm）中铺上滤纸，每个皿中放入新鲜榆树叶片，将试虫置于叶片上（每皿15 头），室温下进行饲养。用喷雾器将菌液均匀喷在榆树叶片和试虫虫体上，进行室内观察。另外，以灭菌水喷雾叶片和试虫作为对照（CK），每个处理重复3次。处理后1～7 d，每天定时观察并记录虫体发病和死亡情况。
1.2.4测定项目与方法。致病菌确定为可降解几丁质或蛋白质的菌株；致病性试验通过累积死亡率（LR7 d）和致死中时（50%虫体死亡所需的时间，LT50），比较不同菌株之间LR7 d 值的差异，同时通过回归分析建立毒力回归模型。
1.2.5致病菌株的分子学鉴定。致病菌株活化培养36 h后进行革兰氏染色；观察菌落特征、细胞形态和大小；菌株的生理生化特性参照东秀珠等[5]的方法进行测定。
基因组DNA的提取：①取500 μL样品置于2 mL无菌离心管中，11 000 r/min离心10 min。②加入0.8 mL抽提缓冲液[1% CTAB、100 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）、20 mmol/L EDTA（pH 8.0）、700 mmol/L NaCl（pH 8.0）]和20 μL蛋白酶K，充分混匀。37 ℃下水浴30 min，每隔10 min混匀1次。③加入160 μL 10% SDS，充分混匀后，65 ℃水浴1 h，每隔15 min混匀1次。④加入等体积的氯仿，充分混匀，4 ℃ 11 000 r/min 离心10 min。⑤取700 μL上清液置于2 mL离心管中，重复步骤③和④。⑥加入0.6倍体积的异丙醇混匀使其沉淀，离心。⑦加入75%乙醇700 μL，混匀后11 000 r/min离心10 min，弃上清。⑧重复步骤⑥，将沉淀风干。⑨用30 μL TE缓冲液溶解DNA沉淀，使用切胶试剂盒纯化DNA，进行琼脂糖电泳检测。
PCR扩增体系：处理后的样品（70 ng/μL）模板2.0 μL；dNTP Mixture（2.5 mmol/L）2.5 μL；27F（20 μmol/L）1.5 μL；1492R（20 μmol/L）1.5 μL；10 × Ex Taq Buffer（Mg2+ plus）5.0 μL；Ex Taq酶（5 U/μL）0.2 μL；补足ddH2O至50.0 μL。Ex Taq DNA Polymerase等扩增所用试剂均购自TaKaRa公司，PCR Purification Kit 购自Promega，引物由上海生工合成。PCR仪使用Biometra公司生产的Tgradient，凝胶成像分析仪为Bio-Rad 公司的Gel-Doc2000。
参考Goto等的方法[6-8]，以菌株的形态特征以及生理生化特性为基础，根据《伯杰细菌鉴定手册》[8]初步确定各菌株的分类学属名；根据16S rDNA 基因序列的BLASTn 比对结果，最终确定菌株的分类地位。
2结果与分析
2.1榆紫叶甲虫病原菌菌株的分离与纯化采集到的感病榆紫叶甲虫通过对其虫体进行分離与纯化，共得到18个菌株，编号为YJA-01～YJA-18。通过几丁质和蛋白质水解试验测定，其中具有几丁质降解活性的有9株，具有蛋白质降解活性的有8株，能同时降解2种物质的有5株（表1），初步推测这12株菌株是榆紫叶甲的病原菌。
2.2具有酶活性的菌株对榆紫叶甲幼虫的致病性灭菌水（CK）处理后榆紫叶甲幼虫的生长发育正常，全部能按期蜕皮直至预蛹。用虫体分离具有降解酶活性的12个菌株接种榆紫叶甲2龄幼虫，有7个菌株未引起发病，其取食和生长发育未受到影响；5个菌株具有致病性，但其致病性存在差异（表2）。其中，2个菌株YJA-03 和YJA-10的致病性较强，接种后2 d始见虫体死亡，LT50 分别为6.30和8.30 d；其余3个菌株对榆紫叶甲2龄幼虫的致病性较弱，接种5～6 d 始见虫体死亡，LR7d 均在25.00%以下，LT50 均超过5.00 d，其中YJA-13菌株的致病性最低，接种后第6天虫体开始死亡，LR7 d 为2298%，LT50 为30.10 d。
对3个杀虫效果较好的菌株进行毒力回归分析（表3），经t检验可知，这些回归模型都达到显著水平（P<0.05）。通过这些模型可以估计3个菌株对榆紫叶甲2龄幼虫的致病能力。在一定的接种浓度（2.0×109 CFU/mL）下，计算出使50%的2龄榆紫叶甲幼虫死亡所需要的时间（LT50），LT50时间越短，其致病性就越强，即对榆紫叶甲幼虫的杀虫效果越好。由表3可知，菌株YJA-03的致病性最强，LT50仅为6.30 d，其杀虫效果最好。菌株YJA-10的致病性较强，LT50为8.30 d。
2.3致病菌株的形态特征对榆紫叶甲幼虫具有杀虫活性的2株病原菌在LB培养基上进行室内培养，单胞菌落YJA-03呈浅橙色，色素不扩散，菌株表面湿润，菌落平坦，表面略微隆起，光滑，有蜡层（图1A）；菌体幼龄培养物为杆菌，老培养物为球状，菌体大小为（1.1～1.2） μm×（1.4～3.2 ） μm（图1B），革兰氏染色呈阳性，初步鉴定为杆菌[5，9]。YJA-10菌株为淡黄色，表面湿润，略微隆起，光滑，有蜡层（图1C）。革兰氏染色均呈阴性，菌体短杆形，菌体大小（1.16～1.77） μm×（1.35～2.81） μm（图1D）。 2.4榆紫叶甲致病菌株的生理生化特性具有杀虫活性的2株致病菌的各生理生化特性见表4。从碳源和氮源来看，2个菌株都能利用D-葡萄糖、D-果糖、D-蔗糖、甘露醇、NH4H2PO4和KNO3；2个菌株接触酶反应、柠檬酸盐利用和硝酸盐还原反应结果均呈阳性；2个菌株淀粉水解试验、脲酶试验、吲哚试验、V-P试验都呈阴性；甲基红检测YJA-03菌株呈阳性，YJA-10菌株呈阴性，都能在2%NaCl和30～37 ℃正常生长，而在5%～7% NaCl、4和41～45 ℃条件下均不能生长。
注：A，B.菌株YJA-03；C，D.菌株YJA-10
2.5致病菌株的16S rDNA与分子学鉴定以2个致病菌株的基因组DNA为模板，用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增；对扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析（图2），可见提取DNA大小约为1 600 bp；测序后去除首尾非相关序列后，得到各菌株大小1 012～1 268 bp的序列，序列登录到GenBank数据库中并得到它们的登录号。将这些菌株的16S rDNA序列进行Blast分析，结果表明YJA-03与GenBank中的短菌杆属（Exiguobacterium）菌株高度相近；YJA-10则与Glutamicibacter属菌株高度相近（表5）。根据包括2个菌株在内的10个菌株的16S rDNA序列，构建系统进化树（图3）。从16S rDNA系统发育树可以看出，同一种菌不总是聚为一簇，但相隔较近；不同种的菌株在系统进化树上相隔较远；菌株 YJA-03和YJA-10分别处于不同的小分支内，进化上距离较近。
3讨论与结论
利用昆虫病原菌能有效控制害虫的发生危害，在防治害虫的同时，还可以保护自然环境安全[10]。该研究从感病的注：M.DL 2000 Marker；1.YJA-03菌株；2.YJA-10菌株
榆紫叶甲成虫上分离并筛选出2株对其具有致病性的细菌菌株YJA-03和YJA-10，具有一定的开发利用价值。筛选出的生防菌对1 龄、2 龄榆紫叶甲幼虫有很好的杀虫效果，但对高龄幼虫和成虫没有明显的致病性，说明榆紫叶甲等鞘翅目昆虫的高龄幼虫和成虫对细菌的抗性明显高于低龄幼虫，与其他研究报道[11-12]相一致。
凡是对害虫有毒性的细菌（如苏云金杆菌、假单孢菌及色细菌等）都具有几丁质酶和蛋白酶活性[12-14]。该研究先从榆紫叶甲上分离并获得病原菌，由于昆虫表皮的成分主要为几丁质和蛋白质[15]，因此首先研究分離病原菌的几丁质酶和蛋白酶活性，因为幼龄幼虫集中危害嫩叶，室内试验中用细胞悬浮液喷洒于榆树叶片和虫体上，大大增加了病原菌侵入虫体的机会。今后林间野外试验应对昆虫林间发育进度进行调查研究，选择适当的施药时期和合适的气候条件，以保证药剂的杀虫效果。
该研究通过观察2个榆紫叶甲杀虫活性菌株的菌落和菌体形态特征和生理生化特性，结合16S rDNA 序列对比分析鉴定，确定它们分属于短杆菌属（Exiguobacterium）和Glutamicibacter属。前者曾从马铃薯加工废水中提取到，也用于废水处理研究中。目前，还未见到2个菌株侵染昆虫的报道，因此还需要对其杀虫机理、发酵扩繁和制剂配制、应用技术等方面进行深入研究。此外，该研究虽然筛选到对榆紫叶甲具有生防效果的细菌，但不同环境中的榆紫叶甲虫体上还存在其他潜在的生防细菌，今后还需要进行进一步分离筛选和鉴定研究。
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