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摘要：目的 探讨百事乐胶囊对慢性应激抑郁模型大鼠海马神经再生相关cAMP-CREB-BDNF信号通路的影响。方法 将SD大鼠随机分为空白组、模型组、氟西汀组及百事乐高、中、低剂量组，除空白组外，采用慢性温和不可预见性应激加孤养的方式建立大鼠抑郁模型，各组给予相应药物灌胃，连续21 d。开野实验、糖水消耗实验、定位航行实验及空间搜索实验检测大鼠行为学的变化，ELISA检测大鼠血浆中皮质酮含量，免疫组化检测海马DG、CA3区蛋白激酶A（PKA）、脑源性神经营养因子（BDNF）、环磷腺苷效应元件结合蛋白（CREB）的表达。结果 与模型组比较，百事乐高、中剂量组大鼠水平或垂直活动次数及蔗糖偏食度升高（P<0.05，P<0.01），百事乐高剂量组大鼠逃避潜伏期、目标象限潜伏时间缩短（P<0.05），百事乐高、中、低剂量组血浆皮质酮浓度降低（P<0.05），百事乐高剂量组海马DG、CA3区PKA、CREB、BDNF表达升高（P<0.05）。结论 百事乐胶囊可能通过cAMP-CREB-BDNF信号通路促进海马神经元再生而实现抗抑郁的作用。
关键词：抑郁症；海马神经再生；CA3区；DG区；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.05.015
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）05-0052-05
Abstract：Objective To investigate effects of Baishile Capsules on cAMP-CREB-BDNF signal pathway about hippocampal neurogenesis in model rats with chronic unpredicted stress depression. Methods SD rats were randomly divided into blank group， model group， fluoxetine hydrochloride group， and Baishile Capsules high， medium， and low dose groups. Chronic stress depression rat model was established by chronic and mild unpredictable stressors. All groups were given relevant medicine for 21 days. The open-field test， sugar consumption experiment， place navigation test， and space searching experiment were used to detect behavior changes of the rats. ELISA was used to detect content of corticosterone in plasma. The protein expressions of PKA， BDNF， and CREB were detected by immunohistochemical method. Results Compared with model group， Baishile Capsules high dose and medium dose groups could remarkably increase the number of vertical and horizontal activities and 1% sucrose partial eclipse. Platform latency and target quadrant searching time decreased significantly in Baishile Capsules high dose group （P<0.05）， and content of corticosterone in plasma increased obviously （P<0.05） in Baishile Capsules all dose groups. Protein expressions of PKA， CREB， and BDNF in hippocampal DG and CA3 area increased significantly （P<0.05） in Baishile Capsules high dose group. Conclusion Baishile Capsules can promote hippocampal neurogenesis through the cAMP-CREB-BDNF signal pathway and realize anti-depression effect.
Key words：depression；hippocampal neurogenesis；CA3；DG；rats
据世界卫生组织预测，到2020年抑郁症将位居人类残疾死亡病因的第2位[1]。抑郁症的发生与海马神经元再生障碍密切相关[2-3]。海马神经再生即齿状回（DG）的颗粒细胞发展成熟继而深入CA3区锥体细胞的过程，海马神经再生的减少和增加分别是导致成年哺乳动物抑郁症发生和恢复的重要因素，其与不同形式的学习记忆形成有关[4]。成年海马新生神经元整合，并将连续不断的信息连接起来，促进学习和记忆信号的形成，进而整合进入新的记忆环路，形成新的信息系统[5]。前期研究表明，百事乐胶囊具有良好的抗抑郁功效，可通过多种有效成分的合理、有机的组合，多途径地作用于机体，抑制海马神经元凋亡，促进神经元的突触可塑性[6-7]。因此，本实验以“海马神经再生”为切入点，并进一步定位于“一区一回”，研究抑郁症海马神经再生的分子机制及百事乐胶囊的干预作用。 1 实验材料
1.1 动物
健康雄性SD大鼠65只，SPF级，8周龄，体质量240～280 g，湖南斯莱科景达动物中心提供，动物许可证号SCXK（湘）2009-0004。在光/暗周期为12 h/12 h的条件下饲养于笼中，自由获得饲料和饮水。
1.2 药物
百事乐胶囊，湖南省中医药研究院提供，批号20110421；盐酸氟西汀胶囊，礼来（苏州）制药有限公司，批号0722A。
1.3 主要试剂与仪器
皮质酮ELISA试剂盒（RD公司）；蛋白激酶A（PKA）一抗（武汉博士德生物有限公司）；脑源性神经营养因子（BDNF）一抗、环磷腺苷效应元件结合蛋白（CREB）一抗（Ambo试剂公司）；封闭用正常羊血清（北京中山生物技术有限公司）；羊抗兔IgG二抗（美国Vector公司）；DAB显色液（北京中衫金桥生物有限公司）；无水乙醇（上海化学试剂公司）；二甲苯（长沙延风化学试剂厂）；多聚赖氨酸（AR0003）；即用型SABC液；正常山羊血清封闭液（06H22C09）。MK3型酶标仪（美国Thermo公司）；TS-12A生物组织自动脱水机（湖北孝感市宏业医用仪器有限公司）；三用电热恒温箱（余姚市东方电工仪器厂）；BM-Ⅷ 生物组织包埋机（孝感市宏业医用仪器有限公司）；生物组织切片机（Thermo Scientific）；DH-250型电热恒温培养箱（北京市科伟永兴仪器有限公司）；CS-Ⅵ摊片烤片机（孝感市宏业医用仪器有限公司）；Morris 水迷宫、开野视频跟踪系统（Panlab）；显微镜（Zelss）。
2 实验方法
2.1 分组与给药
所有大鼠适应环境3 d，期间进行1%蔗糖水训练，测定6：00 pm-9：00 am大鼠1%蔗糖水摄入量。选取糖水摄入量相近的60只大鼠随机分为空白组、模型组、氟西汀组及百事乐高、中、低剂量组，每组10只。氟西汀组予盐酸氟西汀胶囊5.4 mg/kg灌胃，百事乐高、中、低剂量组予百事乐胶囊2.88、1.44、0.72 g/kg灌胃，每日1次（8：30-9：00），均按10 mL/kg体质量给药，空白组和模型组给予等量蒸馏水，连续21 d。
2.2 造模
参照文献[8-9]方法，采用慢性轻度不可预见性的应激模型加孤养，空白组每笼5只，不给予任何刺激；其余各组单笼孤养，每日随机给予不同刺激复制抑郁模型大鼠，包括停食、停水24 h、倾笼45 ℃、夹尾1 min、4 ℃冰浴15 min、昼夜颠倒24 h、噪音5 min，每日随机安排1种，平均每种刺激使用3次。
2.3 行为学测定
2.3.1 开野实验 采用立方形敞箱（80 cm×80 cm×40 cm），周壁、底面为黑色，用白线划分，以大鼠在3 min内穿越底面块数（四爪均进入的方格方可记数）为水平活动得分，以直立次数为垂直活动得分（动物双足离开底面至动物双足放下为1次活动）。
2.3.2 糖水摄入量实验 大鼠单笼孤养，1个瓶装1%蔗糖水，1个瓶装纯净水，禁水12 h后，测定6：00 pm-9：00 am内大鼠1%蔗糖水摄入量。测定大鼠糖水消耗量的变化[10]。
2.3.3 Morris水迷宫实验测试 定位航行实验：分别在实验的17～21 d进行8次航行实验的练习，即从4个不同的象限将大鼠面向池壁放入水中，如果60 s内大鼠未爬上平台，则将其牵引至平台处停留20 s，每日上下午各做1次。在试验的第22日，于平台正对的第2象限处，将大鼠面向池壁放入水中，观察并记录大鼠寻找并爬上平台的持续时间。空间探索实验：撤除平台，由同一入水点将大鼠面向池壁放入水中，记录其穿越目标象限的次数、目标象限潜伏时间及在目标区域移动的百分比（%）[11]。
2.4 皮质酮检测
大鼠禁食24 h后，腹腔注射10%水合氯醛4 mL/kg麻醉，腹主动脉取血，于肝素钠管中收集，2500 r/min离心15 min，取血浆入1.5 mL离心管中，?80 ℃冰箱保存。按照ELISA试剂盒说明书测定血浆皮质酮含量。
2.5 海马CA3、DG区神经再生相关蛋白检测
2.5.1 脑标本的采集 各组大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，仰位固定于手术台上，剪开腹壁，暴露心脏，用灌注穿刺针沿着心脏的纵轴方向经心尖部插入左心室至主动脉根部，止血钳固定，剪开右心耳，立即快速灌入约4 ℃的生理盐水250 mL，4 ℃、4%多聚甲醛200 mL进行灌注，先快后慢，灌注完成后取出脑组织标本，4%多聚甲醛中后固定24 h，修剪脑组织，分别用75%、95%、100%乙醇脱水，浸蜡，包埋，切片，备用。
2.5.2 免疫组化染色 切片常规脱蜡至水，3%H2O2灭活内源性酶，蒸馏水洗3次，热抗原修复，冷却后PBS洗涤1～2次，滴加5%BSA封闭液，室温20 min，加入兔抗大鼠PKA、BDNF、CREB一抗（稀释比例1∶100），4 ℃孵育过夜，PBS洗涤洗2 min×3次，滴加生物素化羊抗兔IgG，20～37 ℃、20 min，PBS洗2 min×3次，滴加SABC，20～37 ℃、20 min，PBS洗5 min×4次，DAB显色，蒸馏水洗涤，苏木素轻度复染，脱水，透明，封片。各组每只大鼠选取大致相同部位的3张切片，每张切片分别在海马的DG、CA3区选取5个互不重叠的视野，在400倍光镜下分别测量各个视野PKA、CREB、BDNF阳性细胞的灰度值，取其平均值作为该张切片的平均灰度值。
3 统计学方法
采用SPSS16.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 行为学检测结果 4.1.1 百事乐胶囊对开野实验的影响 与空白组比较，模型组大鼠5 min内的水平活动数与站立次数均降低（P<0.01）；与模型组比较，百事乐高、中剂量组和氟西汀组大鼠水平活动数与站立次数显著增加（P<0.05，P<0.01），见表1。
4.1.2 百事乐胶囊对蔗糖偏食度的影响 与空白组比较，模型组大鼠糖水消耗量显著降低（P<0.01）；与模型组比较，百事乐高、中剂量组和氟西汀组糖水消耗量明显增加（P<0.05，P<0.01），见表2。
4.1.3 百事乐胶囊对Morris水迷宫实验的影响 与空白组比较，模型组大鼠逃避潜伏期、目标象限潜伏时间显著延长（P<0.01），穿越目标象限次数、目标象限区域移动距离减少（P<0.05，P<0.01）；与模型组比较，氟西汀组、百事乐高剂量组模型大鼠逃避潜伏期、目标象限潜伏时间缩短（P<0.05），见表3。
4.2 百事乐胶囊对抑郁大鼠血浆皮质酮含量的影响
与空白组比较，模型组血浆皮质酮浓度升高（P<0.01）；与模型组比较，百事乐高、中、低剂量组血浆皮质酮浓度降低（P<0.05），见表4。
4.3 百事乐胶囊对抑郁大鼠蛋白激酶A、脑源性神经营养因子、环磷腺苷效应元件结合蛋白表达的影响
空白组大鼠海马DG颗粒细胞和CA3区的锥体细胞均可见PKA样阳性表达；与空白组比较，模型组大鼠海马DG、CA3区PKA免疫反应阳性产物明显减少（P<0.01）；与模型组比较，百事乐高剂量组和氟西汀组均能提高海马DG、CA3区PKA的表达（P<0.05），见图1。
空白组大鼠海马BDNF阳性细胞着色深，主要分布于海马DG和CA3区颗粒细胞层，其中DG区阳性细胞数最多，其次为CA3区；与空白组比较，模型组大鼠海马DG颗粒细胞和CA3区锥体细胞内的BDNF阳性细胞数明显减少（P<0.01）；与模型组比较，百事乐高剂量组和氟西汀组大鼠海马DG和CA3区BDNF阳性细胞的表达均不同程度提高（P<0.05），见图2。
CREB位于细胞核内，光镜下DAB染色发现海马颗粒细胞和锥体细胞为核染色。空白组大鼠在海马DG颗粒细胞和CA3区的锥体细胞内均可见CREB样阳性表达。模型组大鼠海马DG、CA3区CREB样阳性表达明显减少，只有很少位于DG、CA3区神经细胞内存在阳性表达，其灰度值增加（P<0.01）。氟西汀组和百事乐高剂量组大鼠海马CREB样阳性表达较模型组明显增多，呈强阳性，灰度值降低（P<0.05），见图3。
5 讨论
开野实验、糖水消耗实验、定位航行实验及空间探索实验是慢性不可预见性应激抑郁模型实验重要的评价手段。本实验结果表明，与空白组比较，模型组大鼠水平及站立活动次数、糖水消耗量明显下降，定位航行潜伏时间延长，空间搜索目标象限的持续时间、路程及穿越次数减少。说明大鼠出现明显的活动度降低、兴趣丧失、快感缺乏及空间学习记忆能力下降的现象，与抑郁症的临床症状表现相似，提示模型复制成功。
百事乐胶囊由贯叶连翘、姜黄、人参组成，是临床经验方。实验研究结果表明，百事乐高、中剂量组显著提升模型大鼠水平、站立活动次数及糖水消耗量，百事乐高剂量组显著降低模型大鼠平台潜伏期、目标象限潜伏时间，提示百事乐胶囊可以明显改善慢性应激抑郁模型大鼠的抑郁样行为及空间学习记忆能力。
血清皮质酮水平是慢性不可预见性应激抑郁模型重要的客观指标，其变化源于应激引起的下丘脑-垂体-肾上腺轴功能亢进，其与海马内包括神经元在内的细胞再生能力的下降、抑郁症的发生密切相关[12-13]。本实验结果表明，模型组大鼠血浆皮质酮含量升高，百事乐高、中剂量可显著降低血浆皮质酮含量，为百事乐胶囊抗抑郁与促进神经再生作用提供了间接证据。
抑郁症海马神经再生主要发生于海马DG、CA3区，而cAMP-CREB-BDNF通路是调节抑郁症海马神经再生的关键之一。其可接受外源性的刺激而引起神经递质的释放，这些神经递质与细胞膜上相应的受体结合，使神经细胞内的腺苷酸环化酶大量催化ATP转变成cAMP，cAMP再激活PKA，活化的PKA转运至细胞核，使CREB的Ser133磷酸化，CREB的磷酸化可以促进BDNF的表达[14]。Qi等[15]对大鼠强迫游泳模型的研究发现其pCREB和CREB水平较正常对照组明显下降。Chen等[16]通过转基因技术在强迫游泳实验小鼠体内过度表达CREB，发现其有抗抑郁的效果，可以促进海马新生神经细胞增殖、成熟及分化。研究表明，抑郁症患者及模型中枢和外周BDNF水平均下降，经抗抑郁药治疗后BDNF水平上升[12-13，17]。采用基因干扰技术移除BDNF的表达，可以减少海马神经元分化[18]。
免疫组化结果显示，与空白组比较，模型组大鼠海马DG颗粒细胞和CA3区锥体细胞内的PKA、CREB、BDNF免疫阳性细胞数明显减少（P<0.05）；说明抑郁症与PKA、CREB、BDNF的表达下调密切相关，这与前人的研究结果一致。百事乐高剂量组、氟西汀组均能提高海马DG、CA3区PKA、CREB、BDNF免疫阳性产物的表达，且作用相当，与模型组比较差异有统计学意义（P<0.05）；说明百事乐胶囊可提升海马“一区一回”PKA、CREB、BDNF的表达。提示百事乐胶囊的抗抑郁作用可能与调节cAMP-CREB-BDNF信号通路，进而促进DG、CA3区神经再生有关。
综上所述，百事乐胶囊具有显著的抗抑郁作用，其抵抗作用可能是通过调节cAMP-CREB-BDNF信号通路，从而促进神经再生实现的。其具体作用机制还待于进一步采用阻断剂、BrdU等分析药物干预与神经再生及蛋白表达调控之间的关系来探讨。
参考文献：
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（收稿日期：2014-11-11；编辑：华强）
关键词：抑郁症；海马神经再生；CA3区；DG区；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.05.015
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）05-0052-05
Abstract：Objective To investigate effects of Baishile Capsules on cAMP-CREB-BDNF signal pathway about hippocampal neurogenesis in model rats with chronic unpredicted stress depression. Methods SD rats were randomly divided into blank group， model group， fluoxetine hydrochloride group， and Baishile Capsules high， medium， and low dose groups. Chronic stress depression rat model was established by chronic and mild unpredictable stressors. All groups were given relevant medicine for 21 days. The open-field test， sugar consumption experiment， place navigation test， and space searching experiment were used to detect behavior changes of the rats. ELISA was used to detect content of corticosterone in plasma. The protein expressions of PKA， BDNF， and CREB were detected by immunohistochemical method. Results Compared with model group， Baishile Capsules high dose and medium dose groups could remarkably increase the number of vertical and horizontal activities and 1% sucrose partial eclipse. Platform latency and target quadrant searching time decreased significantly in Baishile Capsules high dose group （P<0.05）， and content of corticosterone in plasma increased obviously （P<0.05） in Baishile Capsules all dose groups. Protein expressions of PKA， CREB， and BDNF in hippocampal DG and CA3 area increased significantly （P<0.05） in Baishile Capsules high dose group. Conclusion Baishile Capsules can promote hippocampal neurogenesis through the cAMP-CREB-BDNF signal pathway and realize anti-depression effect.
Key words：depression；hippocampal neurogenesis；CA3；DG；rats
据世界卫生组织预测，到2020年抑郁症将位居人类残疾死亡病因的第2位[1]。抑郁症的发生与海马神经元再生障碍密切相关[2-3]。海马神经再生即齿状回（DG）的颗粒细胞发展成熟继而深入CA3区锥体细胞的过程，海马神经再生的减少和增加分别是导致成年哺乳动物抑郁症发生和恢复的重要因素，其与不同形式的学习记忆形成有关[4]。成年海马新生神经元整合，并将连续不断的信息连接起来，促进学习和记忆信号的形成，进而整合进入新的记忆环路，形成新的信息系统[5]。前期研究表明，百事乐胶囊具有良好的抗抑郁功效，可通过多种有效成分的合理、有机的组合，多途径地作用于机体，抑制海马神经元凋亡，促进神经元的突触可塑性[6-7]。因此，本实验以“海马神经再生”为切入点，并进一步定位于“一区一回”，研究抑郁症海马神经再生的分子机制及百事乐胶囊的干预作用。 1 实验材料
1.1 动物
健康雄性SD大鼠65只，SPF级，8周龄，体质量240～280 g，湖南斯莱科景达动物中心提供，动物许可证号SCXK（湘）2009-0004。在光/暗周期为12 h/12 h的条件下饲养于笼中，自由获得饲料和饮水。
1.2 药物
百事乐胶囊，湖南省中医药研究院提供，批号20110421；盐酸氟西汀胶囊，礼来（苏州）制药有限公司，批号0722A。
1.3 主要试剂与仪器
皮质酮ELISA试剂盒（RD公司）；蛋白激酶A（PKA）一抗（武汉博士德生物有限公司）；脑源性神经营养因子（BDNF）一抗、环磷腺苷效应元件结合蛋白（CREB）一抗（Ambo试剂公司）；封闭用正常羊血清（北京中山生物技术有限公司）；羊抗兔IgG二抗（美国Vector公司）；DAB显色液（北京中衫金桥生物有限公司）；无水乙醇（上海化学试剂公司）；二甲苯（长沙延风化学试剂厂）；多聚赖氨酸（AR0003）；即用型SABC液；正常山羊血清封闭液（06H22C09）。MK3型酶标仪（美国Thermo公司）；TS-12A生物组织自动脱水机（湖北孝感市宏业医用仪器有限公司）；三用电热恒温箱（余姚市东方电工仪器厂）；BM-Ⅷ 生物组织包埋机（孝感市宏业医用仪器有限公司）；生物组织切片机（Thermo Scientific）；DH-250型电热恒温培养箱（北京市科伟永兴仪器有限公司）；CS-Ⅵ摊片烤片机（孝感市宏业医用仪器有限公司）；Morris 水迷宫、开野视频跟踪系统（Panlab）；显微镜（Zelss）。
2 实验方法
2.1 分组与给药
所有大鼠适应环境3 d，期间进行1%蔗糖水训练，测定6：00 pm-9：00 am大鼠1%蔗糖水摄入量。选取糖水摄入量相近的60只大鼠随机分为空白组、模型组、氟西汀组及百事乐高、中、低剂量组，每组10只。氟西汀组予盐酸氟西汀胶囊5.4 mg/kg灌胃，百事乐高、中、低剂量组予百事乐胶囊2.88、1.44、0.72 g/kg灌胃，每日1次（8：30-9：00），均按10 mL/kg体质量给药，空白组和模型组给予等量蒸馏水，连续21 d。
2.2 造模
参照文献[8-9]方法，采用慢性轻度不可预见性的应激模型加孤养，空白组每笼5只，不给予任何刺激；其余各组单笼孤养，每日随机给予不同刺激复制抑郁模型大鼠，包括停食、停水24 h、倾笼45 ℃、夹尾1 min、4 ℃冰浴15 min、昼夜颠倒24 h、噪音5 min，每日随机安排1种，平均每种刺激使用3次。
2.3 行为学测定
2.3.1 开野实验 采用立方形敞箱（80 cm×80 cm×40 cm），周壁、底面为黑色，用白线划分，以大鼠在3 min内穿越底面块数（四爪均进入的方格方可记数）为水平活动得分，以直立次数为垂直活动得分（动物双足离开底面至动物双足放下为1次活动）。
2.3.2 糖水摄入量实验 大鼠单笼孤养，1个瓶装1%蔗糖水，1个瓶装纯净水，禁水12 h后，测定6：00 pm-9：00 am内大鼠1%蔗糖水摄入量。测定大鼠糖水消耗量的变化[10]。
2.3.3 Morris水迷宫实验测试 定位航行实验：分别在实验的17～21 d进行8次航行实验的练习，即从4个不同的象限将大鼠面向池壁放入水中，如果60 s内大鼠未爬上平台，则将其牵引至平台处停留20 s，每日上下午各做1次。在试验的第22日，于平台正对的第2象限处，将大鼠面向池壁放入水中，观察并记录大鼠寻找并爬上平台的持续时间。空间探索实验：撤除平台，由同一入水点将大鼠面向池壁放入水中，记录其穿越目标象限的次数、目标象限潜伏时间及在目标区域移动的百分比（%）[11]。
2.4 皮质酮检测
大鼠禁食24 h后，腹腔注射10%水合氯醛4 mL/kg麻醉，腹主动脉取血，于肝素钠管中收集，2500 r/min离心15 min，取血浆入1.5 mL离心管中，?80 ℃冰箱保存。按照ELISA试剂盒说明书测定血浆皮质酮含量。
2.5 海马CA3、DG区神经再生相关蛋白检测
2.5.1 脑标本的采集 各组大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，仰位固定于手术台上，剪开腹壁，暴露心脏，用灌注穿刺针沿着心脏的纵轴方向经心尖部插入左心室至主动脉根部，止血钳固定，剪开右心耳，立即快速灌入约4 ℃的生理盐水250 mL，4 ℃、4%多聚甲醛200 mL进行灌注，先快后慢，灌注完成后取出脑组织标本，4%多聚甲醛中后固定24 h，修剪脑组织，分别用75%、95%、100%乙醇脱水，浸蜡，包埋，切片，备用。
2.5.2 免疫组化染色 切片常规脱蜡至水，3%H2O2灭活内源性酶，蒸馏水洗3次，热抗原修复，冷却后PBS洗涤1～2次，滴加5%BSA封闭液，室温20 min，加入兔抗大鼠PKA、BDNF、CREB一抗（稀释比例1∶100），4 ℃孵育过夜，PBS洗涤洗2 min×3次，滴加生物素化羊抗兔IgG，20～37 ℃、20 min，PBS洗2 min×3次，滴加SABC，20～37 ℃、20 min，PBS洗5 min×4次，DAB显色，蒸馏水洗涤，苏木素轻度复染，脱水，透明，封片。各组每只大鼠选取大致相同部位的3张切片，每张切片分别在海马的DG、CA3区选取5个互不重叠的视野，在400倍光镜下分别测量各个视野PKA、CREB、BDNF阳性细胞的灰度值，取其平均值作为该张切片的平均灰度值。
3 统计学方法
采用SPSS16.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 行为学检测结果 4.1.1 百事乐胶囊对开野实验的影响 与空白组比较，模型组大鼠5 min内的水平活动数与站立次数均降低（P<0.01）；与模型组比较，百事乐高、中剂量组和氟西汀组大鼠水平活动数与站立次数显著增加（P<0.05，P<0.01），见表1。
4.1.2 百事乐胶囊对蔗糖偏食度的影响 与空白组比较，模型组大鼠糖水消耗量显著降低（P<0.01）；与模型组比较，百事乐高、中剂量组和氟西汀组糖水消耗量明显增加（P<0.05，P<0.01），见表2。
4.1.3 百事乐胶囊对Morris水迷宫实验的影响 与空白组比较，模型组大鼠逃避潜伏期、目标象限潜伏时间显著延长（P<0.01），穿越目标象限次数、目标象限区域移动距离减少（P<0.05，P<0.01）；与模型组比较，氟西汀组、百事乐高剂量组模型大鼠逃避潜伏期、目标象限潜伏时间缩短（P<0.05），见表3。
4.2 百事乐胶囊对抑郁大鼠血浆皮质酮含量的影响
与空白组比较，模型组血浆皮质酮浓度升高（P<0.01）；与模型组比较，百事乐高、中、低剂量组血浆皮质酮浓度降低（P<0.05），见表4。
4.3 百事乐胶囊对抑郁大鼠蛋白激酶A、脑源性神经营养因子、环磷腺苷效应元件结合蛋白表达的影响
空白组大鼠海马DG颗粒细胞和CA3区的锥体细胞均可见PKA样阳性表达；与空白组比较，模型组大鼠海马DG、CA3区PKA免疫反应阳性产物明显减少（P<0.01）；与模型组比较，百事乐高剂量组和氟西汀组均能提高海马DG、CA3区PKA的表达（P<0.05），见图1。
空白组大鼠海马BDNF阳性细胞着色深，主要分布于海马DG和CA3区颗粒细胞层，其中DG区阳性细胞数最多，其次为CA3区；与空白组比较，模型组大鼠海马DG颗粒细胞和CA3区锥体细胞内的BDNF阳性细胞数明显减少（P<0.01）；与模型组比较，百事乐高剂量组和氟西汀组大鼠海马DG和CA3区BDNF阳性细胞的表达均不同程度提高（P<0.05），见图2。
CREB位于细胞核内，光镜下DAB染色发现海马颗粒细胞和锥体细胞为核染色。空白组大鼠在海马DG颗粒细胞和CA3区的锥体细胞内均可见CREB样阳性表达。模型组大鼠海马DG、CA3区CREB样阳性表达明显减少，只有很少位于DG、CA3区神经细胞内存在阳性表达，其灰度值增加（P<0.01）。氟西汀组和百事乐高剂量组大鼠海马CREB样阳性表达较模型组明显增多，呈强阳性，灰度值降低（P<0.05），见图3。
5 讨论
开野实验、糖水消耗实验、定位航行实验及空间探索实验是慢性不可预见性应激抑郁模型实验重要的评价手段。本实验结果表明，与空白组比较，模型组大鼠水平及站立活动次数、糖水消耗量明显下降，定位航行潜伏时间延长，空间搜索目标象限的持续时间、路程及穿越次数减少。说明大鼠出现明显的活动度降低、兴趣丧失、快感缺乏及空间学习记忆能力下降的现象，与抑郁症的临床症状表现相似，提示模型复制成功。
百事乐胶囊由贯叶连翘、姜黄、人参组成，是临床经验方。实验研究结果表明，百事乐高、中剂量组显著提升模型大鼠水平、站立活动次数及糖水消耗量，百事乐高剂量组显著降低模型大鼠平台潜伏期、目标象限潜伏时间，提示百事乐胶囊可以明显改善慢性应激抑郁模型大鼠的抑郁样行为及空间学习记忆能力。
血清皮质酮水平是慢性不可预见性应激抑郁模型重要的客观指标，其变化源于应激引起的下丘脑-垂体-肾上腺轴功能亢进，其与海马内包括神经元在内的细胞再生能力的下降、抑郁症的发生密切相关[12-13]。本实验结果表明，模型组大鼠血浆皮质酮含量升高，百事乐高、中剂量可显著降低血浆皮质酮含量，为百事乐胶囊抗抑郁与促进神经再生作用提供了间接证据。
抑郁症海马神经再生主要发生于海马DG、CA3区，而cAMP-CREB-BDNF通路是调节抑郁症海马神经再生的关键之一。其可接受外源性的刺激而引起神经递质的释放，这些神经递质与细胞膜上相应的受体结合，使神经细胞内的腺苷酸环化酶大量催化ATP转变成cAMP，cAMP再激活PKA，活化的PKA转运至细胞核，使CREB的Ser133磷酸化，CREB的磷酸化可以促进BDNF的表达[14]。Qi等[15]对大鼠强迫游泳模型的研究发现其pCREB和CREB水平较正常对照组明显下降。Chen等[16]通过转基因技术在强迫游泳实验小鼠体内过度表达CREB，发现其有抗抑郁的效果，可以促进海马新生神经细胞增殖、成熟及分化。研究表明，抑郁症患者及模型中枢和外周BDNF水平均下降，经抗抑郁药治疗后BDNF水平上升[12-13，17]。采用基因干扰技术移除BDNF的表达，可以减少海马神经元分化[18]。
免疫组化结果显示，与空白组比较，模型组大鼠海马DG颗粒细胞和CA3区锥体细胞内的PKA、CREB、BDNF免疫阳性细胞数明显减少（P<0.05）；说明抑郁症与PKA、CREB、BDNF的表达下调密切相关，这与前人的研究结果一致。百事乐高剂量组、氟西汀组均能提高海马DG、CA3区PKA、CREB、BDNF免疫阳性产物的表达，且作用相当，与模型组比较差异有统计学意义（P<0.05）；说明百事乐胶囊可提升海马“一区一回”PKA、CREB、BDNF的表达。提示百事乐胶囊的抗抑郁作用可能与调节cAMP-CREB-BDNF信号通路，进而促进DG、CA3区神经再生有关。
综上所述，百事乐胶囊具有显著的抗抑郁作用，其抵抗作用可能是通过调节cAMP-CREB-BDNF信号通路，从而促进神经再生实现的。其具体作用机制还待于进一步采用阻断剂、BrdU等分析药物干预与神经再生及蛋白表达调控之间的关系来探讨。
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（收稿日期：2014-11-11；编辑：华强）