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【目的】旨在探究日粮中添加益生菌对猪流行性腹泻病毒（PEDV）—德尔塔冠状病毒（PDCoV）二联灭活疫苗免疫效果及宿主肠道微生物的作用。【方法】以42 d SPF级雌性昆明鼠为试验材料，以基础日粮为对照组（NC组），分别在基础日粮中添加EM益生菌（EM组）、枯草芽孢杆菌（Bac组）、乳酸杆菌（Lac组），在试验1和14 d，分别对小鼠免疫PEDV—PDCoV二联灭活疫苗，检测分析7,14,21,28 d小鼠血液中PEDV和PDCoV的中和抗体与血清免疫因子水平，16S rRNA高通量测序分析肠道菌群差异，以及肠上皮细胞绒毛、隐窝变化。【结果】（1）与对照组（NC组）相比，饲喂不同益生菌小鼠血清中PEDV和PDCoV的中和抗体水平均有不同程度提高，其中EM组小鼠血清中PEDV和PDCoV的中和抗体水平要明显高于其他组（P＜0.01）;（2）血清免疫因子表达量分析发现，EM组小鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-5、IL-6、IL-10、CXCL1表达量均极显著高于NC组（P＜0.01）;（3）肠道形态结果显示，益生菌试验组回肠绒毛长度均显著大于NC组（P＜0.05）,EM组空肠绒毛长度显著长于其他3组（P＜0.05）,NC组空肠隐窝深度显著大于试验组（P＜0.05）;（4）细菌16S rRNA高通量测序分析发现，添加益生菌小鼠肠道菌群可操作分类单元（OTU）数量比NC组呈增加的趋势，其中EM组的OTU数量平均最高；试验小鼠肠道80%以上的菌群属于厚壁杆菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）。饲喂益生菌组14 d小鼠肠道菌群组成和丰度均发生了改变，EM组28 d小鼠肠道内乳酸菌属（Lactobacillus）和普雷沃氏菌属（Prevotella）细菌丰度显著高于其他3组，EM组和Lac组的Akkermansia菌属丰度显著高于其他2组（P＜0.05）。【结论】研究表明益生菌可提高PEDV、PDCoV灭活疫苗免疫小鼠的抗体水平，宿主免疫因子水平，保护肠上皮细胞形态，以及调节肠道微生物群落结构，增加肠道有益菌的丰度。研究结果为益生菌在PEDV、PDCoV灭活疫苗中的应用及提高靶动物的抗体水平提供试验基础。