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摘要：【目的】明確家蚕（Bombyx mori）二化性品系胚胎早期发育过程中己糖激酶基因（BmHK）不同转录本的表达特性，为深入探究BmHK基因各转录本的生物学功能及揭示其在家蚕胚胎早期发育中的作用机制提供理论依据。【方法】从NCBI检索并下载家蚕等12种昆虫的HK氨基酸序列，采用MEGA 7.0的邻接法（NJ）构建基于HK氨基酸序列相似性的系统发育进化树。以家蚕二化性品系秋丰活化越年蚕卵（丙2胚胎）为材料，分别制备非滞育命运卵（ND）、滞育命运卵（DD）和即时浸酸卵（IA），采用实时荧光定量PCR检测BmHK基因各转录本在家蚕二化性品系胚胎早期发育过程中的表达特性。【结果】BmHK基因属于HSP70-actin家族，存在4个不同的转录本，其长度分别为4610、4608、2818和1520 bp，依次命名为BmHK-a、BmHK-b、BmHK-c和BmHK-d。BmHK-a在3种蚕卵胚胎早期发育过程中整体上呈先升高后降低的变化趋势，且各时间点均表现为IA蚕卵>ND蚕卵>DD蚕卵，IA蚕卵中的BmHK-a相对表达量于发育2 h达峰值，在ND蚕卵和DD蚕卵中于发育48 h达峰值，此后其表达快速下调，至发育96 h均处于较低水平;BmHK-b在3种蚕卵中的表达水平整体上表现为IA蚕卵>ND蚕卵>DD蚕卵，3种蚕卵中的BmHK-b相对表达量变化趋势基本一致，均随发育时间推移呈逐渐上升趋势;BmHK-c在3种蚕卵中的表达差异明显，初产蚕卵中已有较高的表达水平，受精后迅速升高，至发育72 h后BmHK-c在3种蚕卵中的相对表达量再次升高;BmHK-d在3种蚕卵中的相对表达量整体上呈先升高后降低的变化趋势，且各时间点均表现为ND蚕卵>IA蚕卵>DD蚕卵，但IA蚕卵中BmHK-d表达峰值出现的时间早于DD蚕卵和ND蚕卵。【结论】BmHK-a和BmHK-d主要在家蚕胚胎早期发育（产卵或浸酸后3 d）过程中发挥重要作用;BmHK-b虽然也参与家蚕胚胎早期发育过程，但不是主要的糖代谢相关酶;BmHK-c与家蚕胚胎早期发育关系密切，通过糖酵解为胚胎发育提供能量。
关键词： 家蚕;己糖激酶（HK）;转录本;滞育;糖酵解;胚胎早期发育
Abstract：【Objective】To clarify the expression characteristics of the different transcripts of the hexokinase gene （BmHK） in the early embryonic development stage of bivoltine silkworm（Bombyx mori）， and in order to provide a theoretical basis for further exploring the biological functions of each transcript of the BmHK gene and revealing the mechanism of action in the early embryonic development of silkworm. 【Method】The HK amino acid sequences of 12 species of insects including B. mori were obtained and downloaded from NCBI， and a phylogenetic tree based on the similarity of HK amino acid sequences was constructed using the neighbor-joining method（NJ） of MEGA 7.0. The non-diapause-destined eggs （ND）， diapause-destined eggs（DD） and immediately acid-treated eggs（IA） were prepared using Qiufeng activated hibernating eggs（C-2 embryos） of the silkworm bivoltine strain. Real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect the expression characteristics of each transcript during the early embryonic development of silkworm. 【Result】The BmHK gene belonged to the HSP70-actin family， and there were 4 different transcripts with lengths of 4610， 4608， 2818， and 1520 bp， respectively named BmHK-a， BmHK-b， BmHK-c and BmHK-d. BmHK-a showed an overall trend of increasing first and then decreased during the early embryonic development of the three kinds of silkworm eggs. At each time point， it was expressed as IA silkworm eggs>ND silkworm eggs>DD silkworm eggs， in IA silkworm eggs the relative expression of BmHK-a reached a peak at 2 h of development， and reached a peak at 48 h of development in ND silkworm eggs and DD silkworm eggs. After that， its expression was rapidly down-regulated and remained at a low level until 96 h of development; expression level of BmHK-b in silkworm eggs in three species was as follows：IA silkworm eggs>ND silkworm eggs>DD silkworm eggs. The relative expression levels of BmHK-b in the three silkworm eggs had basically the same trend， and they all showed a gradual upward trend with the development time. The expression of BmHK-c in the three silkworm eggs was greatly different. The expression level in the first-laying silkworm eggs was already high， and it increased rapidly after fertilization. The relative expression level of BmHK-c in the three silkworm eggs at 72 h after deve-lopment increased again; the relative expression of BmHK-d in the three silkworm eggs showed an overall trend of first increasing and then decreasing， and at each time point it was ND silkworm eggs>IA silkworm eggs>DD silkworm eggs， but the peak of BmHK-d expression in IA silkworm eggs appeared earlier than DD silkworm eggs and ND silkworm eggs. 【Conclusion】 BmHK-a and BmHK-d mainly play an important role in the early embryonic development of the silkworm （3 d after laying eggs or soaking in acid）; although BmHK-b is also involved in the early embryonic development of the silkworm， it is not the main sugar metabolism related enzymes; BmHK-c is closely related to the early embryonic deve-lopment of the silkworm， and provides energy for embryonic development through glycolysis. Key words： Bombyx mori; hexokinase（HK）; transcript; diapause; glycolytic; early embryonic development
0 引言
【研究意义】家蚕（Bombyx mori）是世界上最重要的经济昆虫之一，也是鳞翅目的一种重要模式生物（唐芬芬等，2019）。根据家蚕在自然条件下一年发生的世代数，可分为一化性、二化性和多化性品系，而多化性品系又分为有滞育多化性和无滞育多化性（吕鸿声，1991）。家蚕胚胎滞育发生时的能量代谢途径一直被认为是揭示家蚕滞育调控机制的关键（沈张飞等，2018;解鸿青等，2018）。糖酵解是糖代谢的重要方式，也是很多动物组织能量的源头。己糖激酶（Hexokinase，HK）是糖酵解最先出现的生物酶，能反应生成丙酮酸参与三羧酸循环。HK广泛存在于脊椎动物和无脊椎动物中，包含4种不同亚型，在进化过程中高度保守且与多种生理活动密切相关。HK能促进磷酸基团转移，将葡萄糖磷酸化生成葡萄糖-6-磷酸，其活性的升高有助于家蚕胚胎发育，是家蚕发育的关键调节剂（许瑾，2020）。HK在滞育解除过程中还能催化葡萄糖转化为氨基酸和脂肪等物质，产生大量能量，促进家蚕胚胎头部和胸节的分化。因此，分析HK基因在家蚕胚胎早期发育过程中的表达特性，对解析二化性家蚕滞育的生理生化机制具有重要意义。【前人研究进展】家蚕滞育是一种非常典型的对光周期和环境温度等主动适应机制（卓德干等，2010;张晓燕等，2015），二化性品系蚕卵常温（25 ℃）明催青时产下滞育卵，而低温（20 ℃以下）暗催青时产下非滞育卵（黄君霆，2003;顾燕燕等，2008）。在家蚕亲代胚胎发生期，尤其是器官形成期，环境条件（高温和长光照等）的变化会影响子代蚕卵形成阶段蛹期咽下神经节（SG），促使其分泌滞育激素（DH）（Homma et al.，2006;梁瀚清等，2014）;分泌至血淋巴中的DH与卵巢细胞上的受体结合，启动卵巢中海藻糖酶基因的表达，促进糖元积累，糖元再转化为山梨醇和甘油，即滞育发生（黄君霆，2003;Hull et al.，2004;王力刚等，2011）。DH在滞育准备期通过调节碳水化合物即糖代谢，为家蚕卵滞育作准备。糖代谢是生物体内广泛存在的代谢方式，包括由一系列酶促反应构成的分解代谢和合成代谢，是生命活动的能量和物质基础（许瑾，2020）。在以家蚕二化性品系制备的滞育卵、非滞育卵及即时浸酸卵中，其超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、丙酮酸激酶（PK）、乙酰胆碱酯酶（AchE）和乳酸脱氢酶（LDH）的活性存在明显差异（范兰芬等，2011）。在昆虫体内的能量代谢过程中，HK是糖代谢途径的限速酶，具有催化己糖磷酸化的作用，生成的葡萄糖-6-磷酸是参与海藻糖合成、糖原合成及糖酵解过程的重要中间代谢产物（王力刚等，2011）。至今，有关果蝇（Drosophila melanogaster）、麦红吸浆虫（Sitodiplosis mosellana）、葱蝇（Delia antiqua）及棉铃虫（Bombyx mori）等物种的HK基因表达特征及功能研究已有较多报道。成卫宁等（2009）研究表明，在麦红吸浆虫解除滞育过程中，其HK活力明显升高，以促进体内糖酵解的顺利进行;郭强等（2015）研究发现，葱蝇的2个HK基因在夏季滞育时具有相同的表达规律，但在冬季滞育时呈现出相反的表达规律;Lin和Xu（2016）研究表明，HK在棉铃虫的滞育和寿命调节中发挥重要作用，且非滞育蛹中的HK表达水平显著高于滞育蛹。【本研究切入点】家蚕滞育卵胚胎发育早期的糖代谢以能量和物质贮存为主，而非滞育卵和即时浸酸卵的糖代谢以物质分解代谢为主（许瑾等，2020）。大部分真核生物转录的mRNA前体是以同一方式剪接出一类mRNA，但也有某些基因的mRNA前体是通过不同剪接方式而形成不同剪接异构体（Lee and Rio，2015）。通过NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）检索到家蚕HK基因（BmHK）存在4个不同转录本，均由同一基因可变剪接产生，但至今鲜见BmHK基因各转录本在家蚕胚胎早期发育过程中的表达特性及其影响家蚕滞育作用机制的研究报道。【拟解决的关键问题】根据NCBI检索到BmHK基因的4个转录本设计特异引物，检测各转录本在家蚕二化性品系胚胎早期发育过程中的表达特性，为深入探究BmHK基因各转录本的生物学功能及揭示其在家蠶胚胎早期发育中的作用机制提供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
供试家蚕二化性品系秋丰由江苏省蚕桑生物学与生物技术重点实验室保存提供。TRIzon总RNA提取试剂盒、HiFiScript gDNA Removal RT MasterMix反转录试剂盒及UltraSYBR Mixture试剂盒购自江苏康为世纪生物科技有限公司。
1. 2 BmHK基因进化分析
从NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）检索并下载12种昆虫的HK氨基酸序列信息（表1），基于HK氨基酸序列相似性，采用MEGA 7.0的邻接法（Neighbor-joining method，NJ）构建系统发育进化树。
1. 3 蚕卵样品制备
以家蚕二化性品系秋丰活化越年蚕卵（丙2胚胎）为材料，一部分蚕卵采用17 ℃暗催青，孵化后常规新鲜桑叶饲养，羽化后蛾区内交配，制备非滞育命运卵（Non-diapause-destined eggs，ND）;另一部分采用25 ℃明催青，饲养后制备滞育命运卵（Diapause-destined eggs，DD），25 ℃保护;20 h后取一部分DD蚕卵用盐酸溶液（1.075 g/mL）于46 ℃下浸泡5 min，清水漂洗10 min后获得即时浸酸卵（Immediately acid-treated eggs，IA），IA蚕卵从浸酸后计算其发育时间。IA蚕卵在浸酸前的发育同DD蚕卵，为滞育发育;浸酸后蚕卵滞育被打破，胚胎继续发育，类似于ND蚕卵。3种蚕卵分别于发育0、2、6、12、24、48、72和96 h时取样，-80 ℃保存备用。 1. 4 引物设计与合成
从NCBI检索BmHK基因（LOC101745054）的4个转录本（XM_004932593.3、XM_021352245.1、XM_004932595.3和XM_004932594.3），以ClustalW（http：//www.clustal.org/）进行多序列比对分析，筛选出各转录本的特异片段，采用Primer 6.0分别设计上、下游引物（表2），并委托浙江尚亚生物技术有限公司合成。
1. 5 总RNA提取及cDNA合成
按TRIzon总RNA提取试剂盒说明提取蚕卵样品总RNA：称取100 mg不同蚕卵样品，加200.0 μL TRIzon试剂，电动研磨器冰浴研磨30 s，4 ℃下12000 r/min离心5 min;收集上清液并转移至新的1.5 mL EP管中，加入800.00 μL TRIzon试剂，混匀，室温静置5 min;加入200.00 μL氯仿，剧烈振荡呈乳化状，静置5 min;4 ℃下12000 r/min离心15 min，小心吸取上层水相转移至新的1.5 mL EP管中;加入等体积异丙醇，振荡混匀，冰浴30 min，4 ℃下12000 r/min离心10 min;弃上清液，加入75%乙醇，离心后弃上清液，并向沉淀物中加入DEPC水，-80 ℃保存备用。在200 μL反应管中加入16.00 μL去RNA酶的ddH2O，4×gDNA wiper Mix 4.00 μL，RNA模板（总RNA）约1 μg，42 ℃孵育2 min，除去DNA;然后加入4.00 μL 5×qRT SuperMix II进行反转录，反应条件：50 ℃ 15 min，85 ℃ 2 min，反转录产物即为cDNA。
1. 6 实时荧光定量PCR检测BmHK基因各转录本表达水平
以反转录合成的cDNA为模板、 Actin3基因为内参基因，参照蒋涛（2017）的方法进行实时荧光定量PCR检测。实时荧光定量PCR反应体系10.00 μL：SYBR Primix Ex Taq 1.00 μL，ROX Reference Dye 6.00 μL，cDNA模板0.50 μL，上、下游引物各0.25 μL，ddH2O 2.00 μL。扩增程序：94 ℃预变性2 min;94 ℃ 30 s，58 ℃ 25 s，72 ℃ 30 s，进行45个循环;95 ℃ 10 s，65 ℃ 60 s，97 ℃ 1 min。通过2-△△Ct法换算BmHK基因各转录本相对表达量（Zhu et al.，2019），采用Duncan’s新复极差法进行显著性检验（Moribe et al.，2010），并以GraphPad Prism 6.0制图。
2 结果与分析
2. 1 BmHK基因结构
BmHK基因属于HSP70-actin家族，存在4个不同的转录本，其长度分别为4610、4608、2818和1520 bp（图1），依次命名为BmHK-a、BmHK-b、BmHK-c和BmHK-d。其中，BmHK-a的编码区（CDS）序列为16～1440 bp，全长1424 bp;BmHK-b的CDS序列为14～1438 bp，全长1424 bp;BmHK-c的CDS序列为1466～2818 bp，全长1352 bp;BmHK-d的CDS序列为159～1520 bp，全长1361 bp。
2. 2 BmHK基因进化分析结果
由图2可看出，12种昆虫的HK氨基酸序列可分为两大分支，保守性较高;其中，BmHK氨基酸序列（XP_004923503.1）与野桑蚕HK氨基酸序列（XP_028037827.1）和烟草天蛾HK氨基酸序列（XP_030021779.1）聚类在一起，形成一个进化分支，说明三者在系统分类上亲缘关系较近，而与菜粉蝶HK氨基酸序列（XP_022112731.1）所在分支的亲缘关系较远。
2. 3 BmHK基因各转录本的表达特性分析结果
2. 3. 1 BmHK-a表达特性 实时荧光定量PCR检测结果（图3）显示，BmHK-a在IA蚕卵、ND蚕卵和DD蚕卵胚胎早期发育过程中（0～96 h）整体上呈先升高后降低的表达变化趋势，且各时间点均表现为IA蚕卵>ND蚕卵>DD蚕卵。在IA蚕卵中，BmHK-a相對表达量于发育2 h达峰值，且在48 h内均保持高水平，但至发育48 h后快速下调;在ND蚕卵和DD蚕卵中，BmHK-a相对表达量在发育2～48 h期间均呈逐渐上升趋势，至发育48 h达峰值，此后BmHK-a的表达也快速下调。至发育96 h，3种蚕卵中的BmHK-a相对表达量均处于较低水平。说明BmHK-a主要在蚕卵胚胎早期发育（产卵或浸酸后3 d）过程中发挥重要作用，为胚胎发育提供能量。
2. 3. 2 BmHK-b表达特性 实时荧光定量PCR检测结果（图4）显示，BmHK-b在家蚕二化性品系不同处理蚕卵中的表达水平整体上表现为IA蚕卵>ND蚕卵>DD蚕卵。在DD蚕卵中，BmHK-b相对表达量随发育时间的推移呈非常缓慢上升趋势，但变化差异不明显;在ND蚕卵中，BmHK-b相对表达量的变化趋势与DD蚕卵的基本一致;在IA蚕卵中，BmHK-b的表达在浸酸处理后72 h内呈缓慢上调趋势，从72 h后开始快速上调，至发育96 h达峰值。说明BmHK-b参与家蚕胚胎早期发育过程，但不是主要的糖代谢相关酶。
2. 3. 3 BmHK-c表达特性 实时荧光定量PCR检测结果（图5）显示，DD蚕卵发育2 h后，BmHK-c相对表达量快速升高，然后逐渐下降，于发育24 h降至最低值，而后又逐渐上升;在ND蚕卵中，BmHK-c相对表达量呈上升—下降—上升的变化趋势，于发育12 h达峰值，然后迅速下降，至发育24 h达最低值，之后又呈逐渐上升趋势;在IA蚕卵中，BmHK-c相对表达量在浸酸处理后2 h快速上升至较高水平，之后下降并稳定在较低水平，至发育72 h后再次快速上升。说明BmHK-c与家蚕胚胎早期发育密切相关，通过糖酵解为胚胎发育提供能量。 2. 3. 4 BmHK-d表达特性 实时荧光定量PCR检测结果（图6）显示，BmHK-d在家蚕二化性品系不同处理蚕卵中的相对表达量整体上呈先升高后降低的变化趋势，且各时间点均表现为ND蚕卵>IA蚕卵>DD蚕卵。在DD蚕卵中，BmHK-d相对表达量在发育前12 h处于较低水平且变化不明显，然后快速上升，至发育24 h达峰值，随后逐渐下降;在ND蠶卵中，BmHK-d表达水平最高，其相对表达量在发育前24 h呈逐渐升高趋势，至发育24 h达峰值，之后逐渐下降，但仍维持在较高水平;在IA蚕卵中，BmHK-d相对表达量于发育12 h达峰值，之后逐渐下降，从发育72 h后快速下降。IA蚕卵中BmHK-d表达峰值出现的时间早于DD蚕卵和ND蚕卵，可能与IA蚕卵以浸酸后为计时起点有关，峰值出现时间实际是在产卵后32 h。BmHK-d主要在蚕卵胚胎早期发育过程中发挥重要作用，但在ND蚕卵发育48～96 h仍有较高水平的稳定表达，可能与ND蚕卵胚胎发育迅速有关。
3 讨论
真核生物mRNA前体剪接是基因转录后表达调控的重要步骤，可变剪接广泛存在于高等生物中（Kim et al.，2007）。人类基因平均含有8个外显子，所有的基因都能发生可变剪接，并产生2个以上的mRNA异构体（Lee and Rio，2015）。已有研究证实，家蚕神经肽Orcokinin基因（BmOK）存在选择性剪接，产生2个转录本（BmOKA和BmOKB），BmOK参与色素合成调控，是2种类鹑斑突变体（q-lp和q-lb）形成的主要原因（Wang et al.，2019）;家蚕通过对Bmdsex结合蛋白的选择性剪接，而调控其性别分化（Zheng et al.，2019）。HK在棉铃虫滞育中发挥重要作用，且非滞育蛹中的HK表达水平显著高于滞育蛹（Lin and Xu，2016）。本课题组的前期研究也表明，家蚕非滞育卵和即时浸酸卵中的BmHK表达水平明显高于滞育卵（许瑾等，2020）。
由于BmHK基因存在4个不同的转录本（BmHK-a、BmHK-b、BmHK-c和BmHK-d），为此本研究设计4个转录本的特异引物，通过实时荧光定量PCR检测各转录本在家蚕二化性品系不同处理蚕卵中的表达情况。BmHK-a在DD蚕卵、ND蚕卵和IA蚕卵胚胎早期发育过程中的表达模式相似，受精（发育2 h）后的相对表达量迅速上升，其峰值基本接近且均出现在产卵或浸酸后48 h，此后BmHK-a相对表达量快速下降，至发育96 h达最低，说明BmHK-a是家蚕胚胎早期发育过程中HK的主要活性形式。BmHK-b在3种蚕卵中的表达模式基本一致，在初产蚕卵中已有一定的表达量，随着发育时间的推移，其相对表达量缓慢上升，说明BmHK-b参与家蚕胚胎早期发育过程，但不是胚胎早期发育过程中HK的主要活性形式。IA蚕卵中的BmHK-b相对表达量随着发育时间的推移呈逐渐上升趋势，并在发育96 h达峰值，可能是其胚胎（戊3～己1）快速发育需要更多能量。BmHK-c在DD蚕卵、ND蚕卵和IA蚕卵中的表达差异明显，初产蚕卵中有较高的表达水平，可能是母体为子代胚胎发育所提供，受精后迅速上升至较高水平，推测BmHK-c可能参与蚕卵的受精过程;在DD蚕卵和IA蚕卵中，受精后（6～72 h）的BmHK-c相对表达量降至较低水平（接近产卵初期），在ND蚕卵中于发育12 h出现峰值，与ND蚕卵胚胎快速发育有关;至发育72 h后，BmHK-c在3种蚕卵中的相对表达量再次升高，成为HK的主要活性形式。BmHK-d在3种蚕卵中的相对表达量整体上呈先升高后降低的变化趋势，且各时间点均表现为ND蚕卵>IA蚕卵>DD蚕卵;IA蚕卵中BmHK-d表达峰值出现的时间早于DD蚕卵和ND蚕卵，可能与IA以浸酸后为计时起点有关，实际是在产卵后32 h出现峰值，说明浸酸处理并未影响BmHK-d表达。此外，在DD蚕卵和IA蚕卵（源自滞育命运蚕卵）中，BmHK-d相对表达量在发育96 h均降至最低水平，而ND蚕卵中的BmHK-d表达仍维持在较高水平，表明BmHK-d在DD蚕卵和IA蚕卵胚胎早期发育过程中发挥作用，之后的作用减弱;而在ND蚕卵中即使96 h后仍发挥重要作用，可能与ND蚕卵胚胎发育迅速有关。
综上所述，BmHK基因4个转录本在来源于家蚕二化性品系滞育蚕卵、非滞育蚕卵和即时浸酸蚕卵胚胎早期发育过程中的表达水平存在差异，且各自在不同发育阶段和水平上发挥功能作用，但有关BmHK基因参与二化性蚕卵滞育的调控机制还有待进一步探究。因此，下一步将采用Western blotting从蛋白水平研究这些转录本的表达水平，或通过RNAi分别抑制BmHK基因各转录本表达，进而深入探究BmHK基因的生物学功能。
4 结论
BmHK-a和BmHK-d主要在家蚕胚胎早期发育（产卵或浸酸后3 d）过程中发挥重要作用;BmHK-b虽然也参与家蚕胚胎早期发育过程，但不是主要的糖代谢相关酶;BmHK-c与家蚕胚胎早期发育关系密切，通过糖酵解为胚胎发育提供能量。
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（責任编辑 兰宗宝）
关键词： 家蚕;己糖激酶（HK）;转录本;滞育;糖酵解;胚胎早期发育
Abstract：【Objective】To clarify the expression characteristics of the different transcripts of the hexokinase gene （BmHK） in the early embryonic development stage of bivoltine silkworm（Bombyx mori）， and in order to provide a theoretical basis for further exploring the biological functions of each transcript of the BmHK gene and revealing the mechanism of action in the early embryonic development of silkworm. 【Method】The HK amino acid sequences of 12 species of insects including B. mori were obtained and downloaded from NCBI， and a phylogenetic tree based on the similarity of HK amino acid sequences was constructed using the neighbor-joining method（NJ） of MEGA 7.0. The non-diapause-destined eggs （ND）， diapause-destined eggs（DD） and immediately acid-treated eggs（IA） were prepared using Qiufeng activated hibernating eggs（C-2 embryos） of the silkworm bivoltine strain. Real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect the expression characteristics of each transcript during the early embryonic development of silkworm. 【Result】The BmHK gene belonged to the HSP70-actin family， and there were 4 different transcripts with lengths of 4610， 4608， 2818， and 1520 bp， respectively named BmHK-a， BmHK-b， BmHK-c and BmHK-d. BmHK-a showed an overall trend of increasing first and then decreased during the early embryonic development of the three kinds of silkworm eggs. At each time point， it was expressed as IA silkworm eggs>ND silkworm eggs>DD silkworm eggs， in IA silkworm eggs the relative expression of BmHK-a reached a peak at 2 h of development， and reached a peak at 48 h of development in ND silkworm eggs and DD silkworm eggs. After that， its expression was rapidly down-regulated and remained at a low level until 96 h of development; expression level of BmHK-b in silkworm eggs in three species was as follows：IA silkworm eggs>ND silkworm eggs>DD silkworm eggs. The relative expression levels of BmHK-b in the three silkworm eggs had basically the same trend， and they all showed a gradual upward trend with the development time. The expression of BmHK-c in the three silkworm eggs was greatly different. The expression level in the first-laying silkworm eggs was already high， and it increased rapidly after fertilization. The relative expression level of BmHK-c in the three silkworm eggs at 72 h after deve-lopment increased again; the relative expression of BmHK-d in the three silkworm eggs showed an overall trend of first increasing and then decreasing， and at each time point it was ND silkworm eggs>IA silkworm eggs>DD silkworm eggs， but the peak of BmHK-d expression in IA silkworm eggs appeared earlier than DD silkworm eggs and ND silkworm eggs. 【Conclusion】 BmHK-a and BmHK-d mainly play an important role in the early embryonic development of the silkworm （3 d after laying eggs or soaking in acid）; although BmHK-b is also involved in the early embryonic development of the silkworm， it is not the main sugar metabolism related enzymes; BmHK-c is closely related to the early embryonic deve-lopment of the silkworm， and provides energy for embryonic development through glycolysis. Key words： Bombyx mori; hexokinase（HK）; transcript; diapause; glycolytic; early embryonic development
0 引言
【研究意义】家蚕（Bombyx mori）是世界上最重要的经济昆虫之一，也是鳞翅目的一种重要模式生物（唐芬芬等，2019）。根据家蚕在自然条件下一年发生的世代数，可分为一化性、二化性和多化性品系，而多化性品系又分为有滞育多化性和无滞育多化性（吕鸿声，1991）。家蚕胚胎滞育发生时的能量代谢途径一直被认为是揭示家蚕滞育调控机制的关键（沈张飞等，2018;解鸿青等，2018）。糖酵解是糖代谢的重要方式，也是很多动物组织能量的源头。己糖激酶（Hexokinase，HK）是糖酵解最先出现的生物酶，能反应生成丙酮酸参与三羧酸循环。HK广泛存在于脊椎动物和无脊椎动物中，包含4种不同亚型，在进化过程中高度保守且与多种生理活动密切相关。HK能促进磷酸基团转移，将葡萄糖磷酸化生成葡萄糖-6-磷酸，其活性的升高有助于家蚕胚胎发育，是家蚕发育的关键调节剂（许瑾，2020）。HK在滞育解除过程中还能催化葡萄糖转化为氨基酸和脂肪等物质，产生大量能量，促进家蚕胚胎头部和胸节的分化。因此，分析HK基因在家蚕胚胎早期发育过程中的表达特性，对解析二化性家蚕滞育的生理生化机制具有重要意义。【前人研究进展】家蚕滞育是一种非常典型的对光周期和环境温度等主动适应机制（卓德干等，2010;张晓燕等，2015），二化性品系蚕卵常温（25 ℃）明催青时产下滞育卵，而低温（20 ℃以下）暗催青时产下非滞育卵（黄君霆，2003;顾燕燕等，2008）。在家蚕亲代胚胎发生期，尤其是器官形成期，环境条件（高温和长光照等）的变化会影响子代蚕卵形成阶段蛹期咽下神经节（SG），促使其分泌滞育激素（DH）（Homma et al.，2006;梁瀚清等，2014）;分泌至血淋巴中的DH与卵巢细胞上的受体结合，启动卵巢中海藻糖酶基因的表达，促进糖元积累，糖元再转化为山梨醇和甘油，即滞育发生（黄君霆，2003;Hull et al.，2004;王力刚等，2011）。DH在滞育准备期通过调节碳水化合物即糖代谢，为家蚕卵滞育作准备。糖代谢是生物体内广泛存在的代谢方式，包括由一系列酶促反应构成的分解代谢和合成代谢，是生命活动的能量和物质基础（许瑾，2020）。在以家蚕二化性品系制备的滞育卵、非滞育卵及即时浸酸卵中，其超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、丙酮酸激酶（PK）、乙酰胆碱酯酶（AchE）和乳酸脱氢酶（LDH）的活性存在明显差异（范兰芬等，2011）。在昆虫体内的能量代谢过程中，HK是糖代谢途径的限速酶，具有催化己糖磷酸化的作用，生成的葡萄糖-6-磷酸是参与海藻糖合成、糖原合成及糖酵解过程的重要中间代谢产物（王力刚等，2011）。至今，有关果蝇（Drosophila melanogaster）、麦红吸浆虫（Sitodiplosis mosellana）、葱蝇（Delia antiqua）及棉铃虫（Bombyx mori）等物种的HK基因表达特征及功能研究已有较多报道。成卫宁等（2009）研究表明，在麦红吸浆虫解除滞育过程中，其HK活力明显升高，以促进体内糖酵解的顺利进行;郭强等（2015）研究发现，葱蝇的2个HK基因在夏季滞育时具有相同的表达规律，但在冬季滞育时呈现出相反的表达规律;Lin和Xu（2016）研究表明，HK在棉铃虫的滞育和寿命调节中发挥重要作用，且非滞育蛹中的HK表达水平显著高于滞育蛹。【本研究切入点】家蚕滞育卵胚胎发育早期的糖代谢以能量和物质贮存为主，而非滞育卵和即时浸酸卵的糖代谢以物质分解代谢为主（许瑾等，2020）。大部分真核生物转录的mRNA前体是以同一方式剪接出一类mRNA，但也有某些基因的mRNA前体是通过不同剪接方式而形成不同剪接异构体（Lee and Rio，2015）。通过NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）检索到家蚕HK基因（BmHK）存在4个不同转录本，均由同一基因可变剪接产生，但至今鲜见BmHK基因各转录本在家蚕胚胎早期发育过程中的表达特性及其影响家蚕滞育作用机制的研究报道。【拟解决的关键问题】根据NCBI检索到BmHK基因的4个转录本设计特异引物，检测各转录本在家蚕二化性品系胚胎早期发育过程中的表达特性，为深入探究BmHK基因各转录本的生物学功能及揭示其在家蠶胚胎早期发育中的作用机制提供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
供试家蚕二化性品系秋丰由江苏省蚕桑生物学与生物技术重点实验室保存提供。TRIzon总RNA提取试剂盒、HiFiScript gDNA Removal RT MasterMix反转录试剂盒及UltraSYBR Mixture试剂盒购自江苏康为世纪生物科技有限公司。
1. 2 BmHK基因进化分析
从NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）检索并下载12种昆虫的HK氨基酸序列信息（表1），基于HK氨基酸序列相似性，采用MEGA 7.0的邻接法（Neighbor-joining method，NJ）构建系统发育进化树。
1. 3 蚕卵样品制备
以家蚕二化性品系秋丰活化越年蚕卵（丙2胚胎）为材料，一部分蚕卵采用17 ℃暗催青，孵化后常规新鲜桑叶饲养，羽化后蛾区内交配，制备非滞育命运卵（Non-diapause-destined eggs，ND）;另一部分采用25 ℃明催青，饲养后制备滞育命运卵（Diapause-destined eggs，DD），25 ℃保护;20 h后取一部分DD蚕卵用盐酸溶液（1.075 g/mL）于46 ℃下浸泡5 min，清水漂洗10 min后获得即时浸酸卵（Immediately acid-treated eggs，IA），IA蚕卵从浸酸后计算其发育时间。IA蚕卵在浸酸前的发育同DD蚕卵，为滞育发育;浸酸后蚕卵滞育被打破，胚胎继续发育，类似于ND蚕卵。3种蚕卵分别于发育0、2、6、12、24、48、72和96 h时取样，-80 ℃保存备用。 1. 4 引物设计与合成
从NCBI检索BmHK基因（LOC101745054）的4个转录本（XM_004932593.3、XM_021352245.1、XM_004932595.3和XM_004932594.3），以ClustalW（http：//www.clustal.org/）进行多序列比对分析，筛选出各转录本的特异片段，采用Primer 6.0分别设计上、下游引物（表2），并委托浙江尚亚生物技术有限公司合成。
1. 5 总RNA提取及cDNA合成
按TRIzon总RNA提取试剂盒说明提取蚕卵样品总RNA：称取100 mg不同蚕卵样品，加200.0 μL TRIzon试剂，电动研磨器冰浴研磨30 s，4 ℃下12000 r/min离心5 min;收集上清液并转移至新的1.5 mL EP管中，加入800.00 μL TRIzon试剂，混匀，室温静置5 min;加入200.00 μL氯仿，剧烈振荡呈乳化状，静置5 min;4 ℃下12000 r/min离心15 min，小心吸取上层水相转移至新的1.5 mL EP管中;加入等体积异丙醇，振荡混匀，冰浴30 min，4 ℃下12000 r/min离心10 min;弃上清液，加入75%乙醇，离心后弃上清液，并向沉淀物中加入DEPC水，-80 ℃保存备用。在200 μL反应管中加入16.00 μL去RNA酶的ddH2O，4×gDNA wiper Mix 4.00 μL，RNA模板（总RNA）约1 μg，42 ℃孵育2 min，除去DNA;然后加入4.00 μL 5×qRT SuperMix II进行反转录，反应条件：50 ℃ 15 min，85 ℃ 2 min，反转录产物即为cDNA。
1. 6 实时荧光定量PCR检测BmHK基因各转录本表达水平
以反转录合成的cDNA为模板、 Actin3基因为内参基因，参照蒋涛（2017）的方法进行实时荧光定量PCR检测。实时荧光定量PCR反应体系10.00 μL：SYBR Primix Ex Taq 1.00 μL，ROX Reference Dye 6.00 μL，cDNA模板0.50 μL，上、下游引物各0.25 μL，ddH2O 2.00 μL。扩增程序：94 ℃预变性2 min;94 ℃ 30 s，58 ℃ 25 s，72 ℃ 30 s，进行45个循环;95 ℃ 10 s，65 ℃ 60 s，97 ℃ 1 min。通过2-△△Ct法换算BmHK基因各转录本相对表达量（Zhu et al.，2019），采用Duncan’s新复极差法进行显著性检验（Moribe et al.，2010），并以GraphPad Prism 6.0制图。
2 结果与分析
2. 1 BmHK基因结构
BmHK基因属于HSP70-actin家族，存在4个不同的转录本，其长度分别为4610、4608、2818和1520 bp（图1），依次命名为BmHK-a、BmHK-b、BmHK-c和BmHK-d。其中，BmHK-a的编码区（CDS）序列为16～1440 bp，全长1424 bp;BmHK-b的CDS序列为14～1438 bp，全长1424 bp;BmHK-c的CDS序列为1466～2818 bp，全长1352 bp;BmHK-d的CDS序列为159～1520 bp，全长1361 bp。
2. 2 BmHK基因进化分析结果
由图2可看出，12种昆虫的HK氨基酸序列可分为两大分支，保守性较高;其中，BmHK氨基酸序列（XP_004923503.1）与野桑蚕HK氨基酸序列（XP_028037827.1）和烟草天蛾HK氨基酸序列（XP_030021779.1）聚类在一起，形成一个进化分支，说明三者在系统分类上亲缘关系较近，而与菜粉蝶HK氨基酸序列（XP_022112731.1）所在分支的亲缘关系较远。
2. 3 BmHK基因各转录本的表达特性分析结果
2. 3. 1 BmHK-a表达特性 实时荧光定量PCR检测结果（图3）显示，BmHK-a在IA蚕卵、ND蚕卵和DD蚕卵胚胎早期发育过程中（0～96 h）整体上呈先升高后降低的表达变化趋势，且各时间点均表现为IA蚕卵>ND蚕卵>DD蚕卵。在IA蚕卵中，BmHK-a相對表达量于发育2 h达峰值，且在48 h内均保持高水平，但至发育48 h后快速下调;在ND蚕卵和DD蚕卵中，BmHK-a相对表达量在发育2～48 h期间均呈逐渐上升趋势，至发育48 h达峰值，此后BmHK-a的表达也快速下调。至发育96 h，3种蚕卵中的BmHK-a相对表达量均处于较低水平。说明BmHK-a主要在蚕卵胚胎早期发育（产卵或浸酸后3 d）过程中发挥重要作用，为胚胎发育提供能量。
2. 3. 2 BmHK-b表达特性 实时荧光定量PCR检测结果（图4）显示，BmHK-b在家蚕二化性品系不同处理蚕卵中的表达水平整体上表现为IA蚕卵>ND蚕卵>DD蚕卵。在DD蚕卵中，BmHK-b相对表达量随发育时间的推移呈非常缓慢上升趋势，但变化差异不明显;在ND蚕卵中，BmHK-b相对表达量的变化趋势与DD蚕卵的基本一致;在IA蚕卵中，BmHK-b的表达在浸酸处理后72 h内呈缓慢上调趋势，从72 h后开始快速上调，至发育96 h达峰值。说明BmHK-b参与家蚕胚胎早期发育过程，但不是主要的糖代谢相关酶。
2. 3. 3 BmHK-c表达特性 实时荧光定量PCR检测结果（图5）显示，DD蚕卵发育2 h后，BmHK-c相对表达量快速升高，然后逐渐下降，于发育24 h降至最低值，而后又逐渐上升;在ND蚕卵中，BmHK-c相对表达量呈上升—下降—上升的变化趋势，于发育12 h达峰值，然后迅速下降，至发育24 h达最低值，之后又呈逐渐上升趋势;在IA蚕卵中，BmHK-c相对表达量在浸酸处理后2 h快速上升至较高水平，之后下降并稳定在较低水平，至发育72 h后再次快速上升。说明BmHK-c与家蚕胚胎早期发育密切相关，通过糖酵解为胚胎发育提供能量。 2. 3. 4 BmHK-d表达特性 实时荧光定量PCR检测结果（图6）显示，BmHK-d在家蚕二化性品系不同处理蚕卵中的相对表达量整体上呈先升高后降低的变化趋势，且各时间点均表现为ND蚕卵>IA蚕卵>DD蚕卵。在DD蚕卵中，BmHK-d相对表达量在发育前12 h处于较低水平且变化不明显，然后快速上升，至发育24 h达峰值，随后逐渐下降;在ND蠶卵中，BmHK-d表达水平最高，其相对表达量在发育前24 h呈逐渐升高趋势，至发育24 h达峰值，之后逐渐下降，但仍维持在较高水平;在IA蚕卵中，BmHK-d相对表达量于发育12 h达峰值，之后逐渐下降，从发育72 h后快速下降。IA蚕卵中BmHK-d表达峰值出现的时间早于DD蚕卵和ND蚕卵，可能与IA蚕卵以浸酸后为计时起点有关，峰值出现时间实际是在产卵后32 h。BmHK-d主要在蚕卵胚胎早期发育过程中发挥重要作用，但在ND蚕卵发育48～96 h仍有较高水平的稳定表达，可能与ND蚕卵胚胎发育迅速有关。
3 讨论
真核生物mRNA前体剪接是基因转录后表达调控的重要步骤，可变剪接广泛存在于高等生物中（Kim et al.，2007）。人类基因平均含有8个外显子，所有的基因都能发生可变剪接，并产生2个以上的mRNA异构体（Lee and Rio，2015）。已有研究证实，家蚕神经肽Orcokinin基因（BmOK）存在选择性剪接，产生2个转录本（BmOKA和BmOKB），BmOK参与色素合成调控，是2种类鹑斑突变体（q-lp和q-lb）形成的主要原因（Wang et al.，2019）;家蚕通过对Bmdsex结合蛋白的选择性剪接，而调控其性别分化（Zheng et al.，2019）。HK在棉铃虫滞育中发挥重要作用，且非滞育蛹中的HK表达水平显著高于滞育蛹（Lin and Xu，2016）。本课题组的前期研究也表明，家蚕非滞育卵和即时浸酸卵中的BmHK表达水平明显高于滞育卵（许瑾等，2020）。
由于BmHK基因存在4个不同的转录本（BmHK-a、BmHK-b、BmHK-c和BmHK-d），为此本研究设计4个转录本的特异引物，通过实时荧光定量PCR检测各转录本在家蚕二化性品系不同处理蚕卵中的表达情况。BmHK-a在DD蚕卵、ND蚕卵和IA蚕卵胚胎早期发育过程中的表达模式相似，受精（发育2 h）后的相对表达量迅速上升，其峰值基本接近且均出现在产卵或浸酸后48 h，此后BmHK-a相对表达量快速下降，至发育96 h达最低，说明BmHK-a是家蚕胚胎早期发育过程中HK的主要活性形式。BmHK-b在3种蚕卵中的表达模式基本一致，在初产蚕卵中已有一定的表达量，随着发育时间的推移，其相对表达量缓慢上升，说明BmHK-b参与家蚕胚胎早期发育过程，但不是胚胎早期发育过程中HK的主要活性形式。IA蚕卵中的BmHK-b相对表达量随着发育时间的推移呈逐渐上升趋势，并在发育96 h达峰值，可能是其胚胎（戊3～己1）快速发育需要更多能量。BmHK-c在DD蚕卵、ND蚕卵和IA蚕卵中的表达差异明显，初产蚕卵中有较高的表达水平，可能是母体为子代胚胎发育所提供，受精后迅速上升至较高水平，推测BmHK-c可能参与蚕卵的受精过程;在DD蚕卵和IA蚕卵中，受精后（6～72 h）的BmHK-c相对表达量降至较低水平（接近产卵初期），在ND蚕卵中于发育12 h出现峰值，与ND蚕卵胚胎快速发育有关;至发育72 h后，BmHK-c在3种蚕卵中的相对表达量再次升高，成为HK的主要活性形式。BmHK-d在3种蚕卵中的相对表达量整体上呈先升高后降低的变化趋势，且各时间点均表现为ND蚕卵>IA蚕卵>DD蚕卵;IA蚕卵中BmHK-d表达峰值出现的时间早于DD蚕卵和ND蚕卵，可能与IA以浸酸后为计时起点有关，实际是在产卵后32 h出现峰值，说明浸酸处理并未影响BmHK-d表达。此外，在DD蚕卵和IA蚕卵（源自滞育命运蚕卵）中，BmHK-d相对表达量在发育96 h均降至最低水平，而ND蚕卵中的BmHK-d表达仍维持在较高水平，表明BmHK-d在DD蚕卵和IA蚕卵胚胎早期发育过程中发挥作用，之后的作用减弱;而在ND蚕卵中即使96 h后仍发挥重要作用，可能与ND蚕卵胚胎发育迅速有关。
综上所述，BmHK基因4个转录本在来源于家蚕二化性品系滞育蚕卵、非滞育蚕卵和即时浸酸蚕卵胚胎早期发育过程中的表达水平存在差异，且各自在不同发育阶段和水平上发挥功能作用，但有关BmHK基因参与二化性蚕卵滞育的调控机制还有待进一步探究。因此，下一步将采用Western blotting从蛋白水平研究这些转录本的表达水平，或通过RNAi分别抑制BmHK基因各转录本表达，进而深入探究BmHK基因的生物学功能。
4 结论
BmHK-a和BmHK-d主要在家蚕胚胎早期发育（产卵或浸酸后3 d）过程中发挥重要作用;BmHK-b虽然也参与家蚕胚胎早期发育过程，但不是主要的糖代谢相关酶;BmHK-c与家蚕胚胎早期发育关系密切，通过糖酵解为胚胎发育提供能量。
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（責任编辑 兰宗宝）