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目的 建立改良单叠氮丙啶(propidium monoazide xx,PMAxx)-荧光定量PCR(qPCR)鉴定MTB活菌和热灭活菌的方法,并探讨PMAxx-qPCR进行抗结核药物体外活性检测的价值.方法 通过活菌和热灭活菌优化PMAxx针对MTB菌株H37Rv的预处理条件,包括曝光时间、暗孵育时间、PMAxx浓度,以及靶标DNA片段长度等.通过绘制量效曲线和建立循环阈值(Cq)与菌负荷的标准曲线,应用PMAxx-qPCR法计算测定异烟肼(INH)、利福平(RFP)的体外抗菌活性,评价检测敏感度,并分别与微孔板Alamar Blue(MABA)法和菌落形成单位(CFU)计数法进行比较,菌落计数采用独立样本t检验进行统计分析,以P＜0.05为差异有统计学意义.结果 当细菌负荷设定为107 CFU/ml时,在PMAxx浓度为10μmol/L、暗孵育10 min后曝光15 min可有效鉴别活菌、死菌(△Cq死-活=6.772±0.453),且使用＞200 bp靶标片段可更有效地反映活菌、死菌的差异.PMAxx-qPCR方法在药物作用后3d可获得与MABA法一致性良好的最低抑菌浓度(MIC)检测结果(INH:0.049～0.076 μg/ml与0.032～0.064 μg/ml,t=0.782,P=0.491;RFP:0.102～0.145 μg/ml与0.051～0.079 μg/ml,t=2.828,P=0.066).定量标准曲线Cq与菌计数(lgCFU/ml)呈良好的线性关系(R2 =0.9863),最低检测限为102 CFU/ml,且PMAxx-qPCR方法和CFU计数方法测算16×MIC、8×MIC、4×MIC、2×MIC和1×MIC浓度的INH的抗菌计数分别为(4.376±0.344)和(4.325±0.318)、(4.232±0.106)和(3.936±0.194)、(4.122±0.277)和(3.874±0.105)、(3.950±0.113)和(3.675±0.250)、(3.770±0.228)和(3.618±0.257)CFU/ml,两种方法计数比较差异均无统计学意义(t值分别为0.165、1.894、1.186、1.419和0.626,P值分别为0.880、0.199、0.357、0.292和0.595),而16×MIC、8×MIC、4×MIC、2×MIC和1×MIC浓度的RFP的抗菌计数分别为(4.577±0.216)和(4.675±0.250)、(4.445±0.054)和(4.374±0.675)、(3.627±0.173)和(3.154±0.076)、(1.946±0.359)和(2.159±0.083)、(1.552±0.423)和(0.960±0.202) CFU/ml,两种方法计数比较差异均无统计学意义(t值分别为0.469、0.199、3.535、0.784、1.777,P值分别为0.671、0.855、0.071、0.490、0.174).结论 建立的PMAxx-qPCR方法稳定,可应用于一线抗结核药物INH和RFP的活性检测,敏感度高且快速准确.