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摘要 呋甾烷是食品、中药材（药品）储存和炮制以及人体内非酶糖基化反应（Mallard反应）的糖基化终产物之一，与食品营养、中药材（药品）品质和人体健康密切相关。因此，对呋甾烷进行全面、深刻研究具有重要意义。对呋甾烷生化特性与结构、生成机理、测试方法和抑制策略4部分进行简要综述，并在此基础上对呋甾烷研究前景进行展望，以期为呋甾烷后期研究提供一定参考。
关键词 呋甾烷；Mallard反应；糖基化终产物
中图分类号 S609.9；TS201.2文献标识码 A文章编号 0517-6611（2014）35-12679-03
呋甾烷（Furosine，Furoylmethyllysine，FML），化学名称ε-N-2-呋喃甲基-L-赖氨酸，又名呋甾素、糠氨酸，乳品中常称糠氨酸[1-2]。FML通常是食品或药材（药品）中蛋白质（或氨基酸）与还原糖在高温炮制或长期储存时发生Maillard反应产生的系列糖基化终产物（advanced glycosylation end products，AGEs）之一，常作为判断蜂蜜和牛奶等产品新鲜度或营养损伤程度以及药材炮制品质的一重要指标[3-4]。亦有大量研究表明，人体内糖基化终产物是老年性疾病的介导因素，可作为测试人体老化进程的时钟。
蜂王浆中含有丰富的蛋白质、氨基酸及还原糖，因此在一定条件下会发生Maillard反应。Marconi等测定了蜂王浆中FML的含量，并对使用FML作为评价蜂王浆新鲜度的指标进行了可行性研究[5]。在奶粉制造过程中适宜的反应条件可导致FML的生成，加入复原乳的液态奶中FML含量急剧增加，而且FML与乳果糖的比值远远大于液态奶[6]。我国农业部2005年发布农业行业标准《巴氏杀菌乳和UHT灭菌乳中复原乳的鉴定》[7]，其根据FML和乳果糖2种物质在液态乳中的含量，判定巴氏杀菌乳和UHT灭菌乳中是否含复原乳成分。人参等中药材富含氨基酸、蛋白质和还原糖，储存和炮制过程常发生Maillard反应，产生多种Maillard产物，如麦芽酚、精氨酸双糖苷等报道较多，而FML报道较少。另外，研究发现，FML等AGEs的含量在一些人体老化疾病的胶原蛋白和血浆中的含量比正常人高，与人体健康密切相关。
笔者从FML的生化特性与结构、生成机理、测试方法和抑制策略4个方面进行阐述，为完善现行食品或药品质量标准，进一步规范食品药品市场和确保人体健康提供一定参考。
1 生化特性与结构
呋甾烷，结构式如图1所示，化学性质比较稳定。FML已经被证实与多种疾病密切相关，食入过量对人体有害；同时体内糖含量较高时，亦可内源合成。研究表明，FML等AGEs能直接损伤神经组织或和其受体相互作用导致神经病变，参与白内障、动脉硬化、阿耳茨海默氏病、糖尿病、肾炎、网膜症、神经障碍和心脑血管等人体老化疾病的发生[8-10]，而且食品和药品有可能是最主要的摄取途径。近年来研究发现，FML等AGEs的存在还与衰老有着紧密的联系。在人类和动物的多种组织中随着年龄的增长不断积聚，可作为研究衰老的一项重要指标。它随着年龄的增长，在血清、组织中的生成和积聚是不可避免的。其对酶类有高度的抵抗作用，更新周期长，且具有高交联性，能改变有关生物大分子的结构和功能，并能与其特异性受体相互作用，通过多种途径造成组织的交联损伤，或者诱发突变，造成正常蛋白结构转变成老年蛋白的结构，随着年龄增长在体内积聚增多，会造成人体内血管壁硬度增加；或通过直接或间接的作用导致骨代谢的失衡，导致骨质疏松[11]。FML等AGEs存在还会使大脑神经中枢的星形胶质细胞发生一系列形态与功能的变化。
2 生成机理
由图2可知，FML是Maillard反应的AGEs之一，在该反应中，氨基酸与还原糖首先缩合生成Shiff碱；该结构不稳定，可自行发生重排而生成Amadori化合物（1-氨基-1-脱氧-2-酮糖），然后再降解为A-酮醛化合物，它比单糖更易与蛋白质反应，尤其是容易进一步生成棕褐色、具有荧光性的不可逆产物；FML是Amadori化合物在酸性条件下的产物之一，在生物体内的消化酶则不能解离。因此，这种氨基酸被称为无效氨基酸。FML能够反映早期Maillard反应的程度，已被作为很多食品或药品在常温储存的货架期或炮制品质评价指标之一。在糖尿病或其他老龄化疾病人体中，体内葡萄糖（或果糖）与体内多种蛋白质或氨基酸等物质发生非酶促糖基化反应，已经证实这是一个依赖于血糖浓度的化学反应，血糖越高，其合成量就越多。由于还原糖与蛋白质的结合无特异性，它可以与体内各种蛋白质发生糖基化反应，从而在相应的组织或器官中形成AGEs，而且具有不可逆性，既使血糖被纠正，AGEs的水平也不能恢复到正常状态，而在组织中蓄积[12-13]。
3 测试方法
目前，FML的测定方法有反相离子对色谱法、荧光光谱法、表面荧光法、近红外光谱法，液-质法和酶联免疫法（ELISA）等。下面简单对各种分析方法进行介绍，并对各种方法的优缺点进行分析。
3.1 反相液相色谱法
反相色谱被广泛应用于FML的分析，大多是针对蜂蜜产品和乳制品等食品中FML的测定。选择特定的紫外波长或者荧光激发检测FML。FML是一种强极性的水溶性化合物，大多情况下与蛋白质结合，因此，进行FML测定时一般需要水解，水解液后期常需要过滤和C18柱预萃取、高浓度盐酸溶液定容等前处理过程，回收率较低。FML是强极性化合物，采用反相色谱法测定时，保留时间太短，干扰也较大。因此在测定时，需要在流动相中添加三氟乙酸或七氟丁酸等离子对试剂，将FML带回到疏水的反相表面，优化分离条件、增大复杂色谱分析的灵敏度[14-15]。但三氟乙酸或七氟丁酸的强腐蚀性会使色谱柱柱效很快降低，不适用于长期稳定的测定FML，该方法分离度及重复性会随进样次数发生变化，而且样品中的高浓度盐酸对色谱柱及仪器管路均会造成一定的损坏，国内通用的ODS柱很难耐受，而进口色谱柱成本较高。后来研究者对方法进行了改进，建立了以1-庚烷磺酸钠为离子对试剂的反相离子对分析方法，消除了三氟乙酸或七氟丁酸对仪器及色谱柱的影响，优化了色谱分离条件[16-17]。反相液相色谱法测定结果重现性好、准确度较高、被测组分出峰时间较快，具有较好的可操作性。但是HPLC缺点在于色谱柱造价高、易损失，且前期处理时间长达24 h。 3.2 荧光光谱法
描述物质的荧光特性有激发波长（Ex）、发射波长（Em）和荧光强度3个参数。FML的最大激发波长是330 nm，发射波长为420 nm[18]。荧光分析法测定有以下3个特定的优势：①荧光分析法比其他分光光度技术灵敏100～1 000倍；②大多数荧光方法快捷、处理步骤相对简便；③荧光化合物对环境极其灵敏。
3.3 表面荧光法
荧光分光光度法具有灵敏度高、选择性强的优点，比常规分光光度法灵敏度高10～100倍。但普通荧光方法有其自身的局限性，当样品的吸光度>0.1时，发射光透出会遇到很大阻碍，普通荧光方法就已不再适用。表面荧光方法是一种在普通荧光方法基础上新发展起来的一种方法，通过将比色杯旋转56°角，只对比色杯表面一层的待测物质进行检测，适用于不透明的样品，省去了很多对样品前处理的步骤，适用于快速检测。在激发波长360 nm时，用普通荧光方法在波长410 nm左右得到荧光峰，而用表面荧光方法在波长425 nm处得到荧光峰。其特点是：FML含量低，荧光方法灵敏度高；表面荧光方法不用对样品进行前处理，快速简便[19]。
3.4 近红外光谱法
近红外光谱（Near Infrared，NIR）是波长范围在780～2 526 nm的电磁波，近红外光谱方法利用有机物中含有C-H、N-H、O-H、C-C等化学键的泛频振动或转动，以漫反射方式获得在近红外区的吸收光谱，通过主成分分析、偏最小二乘法、人工神经网等现代化学和计量学方法，建立物质光谱与待测成分含量间的线性或非线性模型，从而实现采用物质近红外光谱信息对待测成分含量进行计量。近红外光谱技术可以有效地对乳制品的营养成分含量以及掺假物、残留物和防腐剂等进行快速、准确、无损地测定，从而检测牛乳及其乳制品质量[20-21]。
3.5 液-质法
HPLC-MS是有力的定性定量工具，Villamiel等报道了HPLC-MS法测定蜂蜜中FML含量。采用选择离子检测方式，用于定量分析检测离子质荷比m/z为255的[FML+H]+。结果表明，长期储藏的蜂蜜中FML的含量高于10g/kg，同时蛋白质的含量减少。采用质谱法检测FML的重现性好，精密度高，检测定量限（LOQ）低[22]。
3.6 ELISA法
ELISA法检测FML的方法类似于检测其他AGEs。采用ELISA试剂盒检测ELISA水平时，纯化的ELISA抗体包被微孔板，并制成固相抗体，微孔中依次加入抗原ELISA和酶标抗体，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物。FML最后结合在固相载体上的酶量与其总量有一定的比例，加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中FML抗原的总量直接相关，用酶标仪在特定波长下测定吸光度，FML的总量与吸光度值成正比，然后通过绘制标准曲线计算样品中FML的总量。在一般情况下，ELISA法检测FML的优点是快速，价格相对便宜。缺点是容易受到杂质的干扰，精确度值得怀疑。而且，ELISA法中的抗原或抗体主要来自于人体或者动物体内，其用于检测食源性FML的准确性有待进一步的鉴定。
4 抑制策略
FML等AGEs是导致各种糖尿病慢性并发症及衰老发生和发展的危险物质，因此减少或消除体内的FML等AGEs则是预防糖尿病并发症及衰老的一个理想途径。因此，抑制FML的形成或者阻断其生成是控制糖尿病慢性并发症及衰老的关键。而FML的来源主要是2个方面：一是内源性还原糖的合成；二是食品及药品中FML的直接摄入。内源性合成方面最初认为Glu是FML形成的主要前体物，随着研究的深入，发现其他一些糖类、非糖类活性更高，更利于FML形成，如Fru和甘油醛等，因此应减少低血糖生成指数膳食。
外源性摄入则需要从食品和药品储存和加工方面加以控制。首先，FML等AGEs一般认为是Maillard反应的产物之一，所以得从Maillard反应条件控制入手；研究者在探索抑制FML形成的途径时发现，抗氧化剂能明显抑制蛋白质的糖基化反应，从而抑制FML的形成[23-24]。同时，大量的研究发现，黄酮类化合物对荧光性AGEs、FML和戊糖素（pentosidine）等有抑制作用，其抑制机理与抗氧化性和清除自由基的作用相联系，抑制作用主要发生在糖基化反应的前期阶段。氨基胍已用做治疗糖尿病，其抑制效果是通过抑制还原糖与蛋白质的糖基化反应的进行，达到抑制AGEs生成的目的[25]。
5 结语
目前，蜂蜜及奶粉等产品中FML的测定及抑制已得到研究者的广泛关注，但是对药材（药品）中FML的生成及调控研究的较少，今后应加强药材（药品）中FML的生成及调控研究；另一方面，对FML的生成和抑制研究已经取得一定进展，但其抑制机理尚不清楚。今后应加强从动力学的角度研究抑制FML的抑制位点和抑制机理，从而为抑制食品、药品储藏和加工过程产生FML提供理论基础和参考，确保食品药品质量和人体健康。
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关键词 呋甾烷；Mallard反应；糖基化终产物
中图分类号 S609.9；TS201.2文献标识码 A文章编号 0517-6611（2014）35-12679-03
呋甾烷（Furosine，Furoylmethyllysine，FML），化学名称ε-N-2-呋喃甲基-L-赖氨酸，又名呋甾素、糠氨酸，乳品中常称糠氨酸[1-2]。FML通常是食品或药材（药品）中蛋白质（或氨基酸）与还原糖在高温炮制或长期储存时发生Maillard反应产生的系列糖基化终产物（advanced glycosylation end products，AGEs）之一，常作为判断蜂蜜和牛奶等产品新鲜度或营养损伤程度以及药材炮制品质的一重要指标[3-4]。亦有大量研究表明，人体内糖基化终产物是老年性疾病的介导因素，可作为测试人体老化进程的时钟。
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笔者从FML的生化特性与结构、生成机理、测试方法和抑制策略4个方面进行阐述，为完善现行食品或药品质量标准，进一步规范食品药品市场和确保人体健康提供一定参考。
1 生化特性与结构
呋甾烷，结构式如图1所示，化学性质比较稳定。FML已经被证实与多种疾病密切相关，食入过量对人体有害；同时体内糖含量较高时，亦可内源合成。研究表明，FML等AGEs能直接损伤神经组织或和其受体相互作用导致神经病变，参与白内障、动脉硬化、阿耳茨海默氏病、糖尿病、肾炎、网膜症、神经障碍和心脑血管等人体老化疾病的发生[8-10]，而且食品和药品有可能是最主要的摄取途径。近年来研究发现，FML等AGEs的存在还与衰老有着紧密的联系。在人类和动物的多种组织中随着年龄的增长不断积聚，可作为研究衰老的一项重要指标。它随着年龄的增长，在血清、组织中的生成和积聚是不可避免的。其对酶类有高度的抵抗作用，更新周期长，且具有高交联性，能改变有关生物大分子的结构和功能，并能与其特异性受体相互作用，通过多种途径造成组织的交联损伤，或者诱发突变，造成正常蛋白结构转变成老年蛋白的结构，随着年龄增长在体内积聚增多，会造成人体内血管壁硬度增加；或通过直接或间接的作用导致骨代谢的失衡，导致骨质疏松[11]。FML等AGEs存在还会使大脑神经中枢的星形胶质细胞发生一系列形态与功能的变化。
2 生成机理
由图2可知，FML是Maillard反应的AGEs之一，在该反应中，氨基酸与还原糖首先缩合生成Shiff碱；该结构不稳定，可自行发生重排而生成Amadori化合物（1-氨基-1-脱氧-2-酮糖），然后再降解为A-酮醛化合物，它比单糖更易与蛋白质反应，尤其是容易进一步生成棕褐色、具有荧光性的不可逆产物；FML是Amadori化合物在酸性条件下的产物之一，在生物体内的消化酶则不能解离。因此，这种氨基酸被称为无效氨基酸。FML能够反映早期Maillard反应的程度，已被作为很多食品或药品在常温储存的货架期或炮制品质评价指标之一。在糖尿病或其他老龄化疾病人体中，体内葡萄糖（或果糖）与体内多种蛋白质或氨基酸等物质发生非酶促糖基化反应，已经证实这是一个依赖于血糖浓度的化学反应，血糖越高，其合成量就越多。由于还原糖与蛋白质的结合无特异性，它可以与体内各种蛋白质发生糖基化反应，从而在相应的组织或器官中形成AGEs，而且具有不可逆性，既使血糖被纠正，AGEs的水平也不能恢复到正常状态，而在组织中蓄积[12-13]。
3 测试方法
目前，FML的测定方法有反相离子对色谱法、荧光光谱法、表面荧光法、近红外光谱法，液-质法和酶联免疫法（ELISA）等。下面简单对各种分析方法进行介绍，并对各种方法的优缺点进行分析。
3.1 反相液相色谱法
反相色谱被广泛应用于FML的分析，大多是针对蜂蜜产品和乳制品等食品中FML的测定。选择特定的紫外波长或者荧光激发检测FML。FML是一种强极性的水溶性化合物，大多情况下与蛋白质结合，因此，进行FML测定时一般需要水解，水解液后期常需要过滤和C18柱预萃取、高浓度盐酸溶液定容等前处理过程，回收率较低。FML是强极性化合物，采用反相色谱法测定时，保留时间太短，干扰也较大。因此在测定时，需要在流动相中添加三氟乙酸或七氟丁酸等离子对试剂，将FML带回到疏水的反相表面，优化分离条件、增大复杂色谱分析的灵敏度[14-15]。但三氟乙酸或七氟丁酸的强腐蚀性会使色谱柱柱效很快降低，不适用于长期稳定的测定FML，该方法分离度及重复性会随进样次数发生变化，而且样品中的高浓度盐酸对色谱柱及仪器管路均会造成一定的损坏，国内通用的ODS柱很难耐受，而进口色谱柱成本较高。后来研究者对方法进行了改进，建立了以1-庚烷磺酸钠为离子对试剂的反相离子对分析方法，消除了三氟乙酸或七氟丁酸对仪器及色谱柱的影响，优化了色谱分离条件[16-17]。反相液相色谱法测定结果重现性好、准确度较高、被测组分出峰时间较快，具有较好的可操作性。但是HPLC缺点在于色谱柱造价高、易损失，且前期处理时间长达24 h。 3.2 荧光光谱法
描述物质的荧光特性有激发波长（Ex）、发射波长（Em）和荧光强度3个参数。FML的最大激发波长是330 nm，发射波长为420 nm[18]。荧光分析法测定有以下3个特定的优势：①荧光分析法比其他分光光度技术灵敏100～1 000倍；②大多数荧光方法快捷、处理步骤相对简便；③荧光化合物对环境极其灵敏。
3.3 表面荧光法
荧光分光光度法具有灵敏度高、选择性强的优点，比常规分光光度法灵敏度高10～100倍。但普通荧光方法有其自身的局限性，当样品的吸光度>0.1时，发射光透出会遇到很大阻碍，普通荧光方法就已不再适用。表面荧光方法是一种在普通荧光方法基础上新发展起来的一种方法，通过将比色杯旋转56°角，只对比色杯表面一层的待测物质进行检测，适用于不透明的样品，省去了很多对样品前处理的步骤，适用于快速检测。在激发波长360 nm时，用普通荧光方法在波长410 nm左右得到荧光峰，而用表面荧光方法在波长425 nm处得到荧光峰。其特点是：FML含量低，荧光方法灵敏度高；表面荧光方法不用对样品进行前处理，快速简便[19]。
3.4 近红外光谱法
近红外光谱（Near Infrared，NIR）是波长范围在780～2 526 nm的电磁波，近红外光谱方法利用有机物中含有C-H、N-H、O-H、C-C等化学键的泛频振动或转动，以漫反射方式获得在近红外区的吸收光谱，通过主成分分析、偏最小二乘法、人工神经网等现代化学和计量学方法，建立物质光谱与待测成分含量间的线性或非线性模型，从而实现采用物质近红外光谱信息对待测成分含量进行计量。近红外光谱技术可以有效地对乳制品的营养成分含量以及掺假物、残留物和防腐剂等进行快速、准确、无损地测定，从而检测牛乳及其乳制品质量[20-21]。
3.5 液-质法
HPLC-MS是有力的定性定量工具，Villamiel等报道了HPLC-MS法测定蜂蜜中FML含量。采用选择离子检测方式，用于定量分析检测离子质荷比m/z为255的[FML+H]+。结果表明，长期储藏的蜂蜜中FML的含量高于10g/kg，同时蛋白质的含量减少。采用质谱法检测FML的重现性好，精密度高，检测定量限（LOQ）低[22]。
3.6 ELISA法
ELISA法检测FML的方法类似于检测其他AGEs。采用ELISA试剂盒检测ELISA水平时，纯化的ELISA抗体包被微孔板，并制成固相抗体，微孔中依次加入抗原ELISA和酶标抗体，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物。FML最后结合在固相载体上的酶量与其总量有一定的比例，加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中FML抗原的总量直接相关，用酶标仪在特定波长下测定吸光度，FML的总量与吸光度值成正比，然后通过绘制标准曲线计算样品中FML的总量。在一般情况下，ELISA法检测FML的优点是快速，价格相对便宜。缺点是容易受到杂质的干扰，精确度值得怀疑。而且，ELISA法中的抗原或抗体主要来自于人体或者动物体内，其用于检测食源性FML的准确性有待进一步的鉴定。
4 抑制策略
FML等AGEs是导致各种糖尿病慢性并发症及衰老发生和发展的危险物质，因此减少或消除体内的FML等AGEs则是预防糖尿病并发症及衰老的一个理想途径。因此，抑制FML的形成或者阻断其生成是控制糖尿病慢性并发症及衰老的关键。而FML的来源主要是2个方面：一是内源性还原糖的合成；二是食品及药品中FML的直接摄入。内源性合成方面最初认为Glu是FML形成的主要前体物，随着研究的深入，发现其他一些糖类、非糖类活性更高，更利于FML形成，如Fru和甘油醛等，因此应减少低血糖生成指数膳食。
外源性摄入则需要从食品和药品储存和加工方面加以控制。首先，FML等AGEs一般认为是Maillard反应的产物之一，所以得从Maillard反应条件控制入手；研究者在探索抑制FML形成的途径时发现，抗氧化剂能明显抑制蛋白质的糖基化反应，从而抑制FML的形成[23-24]。同时，大量的研究发现，黄酮类化合物对荧光性AGEs、FML和戊糖素（pentosidine）等有抑制作用，其抑制机理与抗氧化性和清除自由基的作用相联系，抑制作用主要发生在糖基化反应的前期阶段。氨基胍已用做治疗糖尿病，其抑制效果是通过抑制还原糖与蛋白质的糖基化反应的进行，达到抑制AGEs生成的目的[25]。
5 结语
目前，蜂蜜及奶粉等产品中FML的测定及抑制已得到研究者的广泛关注，但是对药材（药品）中FML的生成及调控研究的较少，今后应加强药材（药品）中FML的生成及调控研究；另一方面，对FML的生成和抑制研究已经取得一定进展，但其抑制机理尚不清楚。今后应加强从动力学的角度研究抑制FML的抑制位点和抑制机理，从而为抑制食品、药品储藏和加工过程产生FML提供理论基础和参考，确保食品药品质量和人体健康。
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