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摘要 [目的]介绍一种PCR产物直接进行“TA”克隆的高保真PCR法，减少高保真PCR产物“TA”克隆的中间步骤。[方法]Trizol法提取人肝癌细胞SMMC-7721总RNA，并将mRNA反转录成cDNA。以cDNA为模板，联合不同特性的Taq DNA聚合酶扩增PKC基因的蛋白编码区。PCR产物经纯化后进行“TA”克隆、细菌转化、筛选培养、质粒抽提、酶切鉴定和测序鉴定等。[结果]高保真DNA聚合酶扩增的PCR产物未发现DNA突变，但不能直接进行“TA”克隆。Taq DNA聚合酶扩增的产物可直接进行“TA”克隆，但其内部存在多个突变位点，保真性明显不足。联合使用高保真DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶（双酶联用）扩增的PCR产物可直接进行“TA”克隆，且DNA测序未发现突变。[结论]双酶联用PCR可以获得高保真PCR产物，并直接进行“TA”克隆。
关键词 聚合酶链式反应;DNA聚合酶;“TA”克隆;DNA突变
中图分类号 Q78 文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2020）05-0109-03
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.05.030
開放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Abstract [Objective]To introduce a highfidelity PCR method with its product used in “TA” cloning directly，which could simplify the “TA” cloning step.[Method]Total RNAs were extracted from human hepatocellular carcinoma cell line SMMC7721 by Trizol reagent，and the mRNAs were reverse transcribed into cDNAs.Employing cDNAs as the templates，the cDNA region that codes protein of PKC was amplified by different types of DNA polymerases.The PCR products were subjected to a series of processes such as “TA” cloning，bacterial transformation，screening culture，plasmid extraction，restriction enzyme digestion and DNA sequencing.[Result]No DNA mutation was found in the product of PCR amplification with high fidelity DNA polymerase，but the product could not be linked directly to T vector.On the other hand，the product of PCR amplification with Taq DNA polymerase could be cloned into T vector directly，but it possessed multiple DNA point mutations and its fault was low fidelity.The product of PCR amplification with an alliance of high fidelity DNA polymerase and Taq DNA polymerase could be directly inserted into T vector without any point mutation.[Conclusion]Combined utilization of high fidelity DNA polymerase and Taq DNA polymerase in PCR can obtain high fidelity PCR product which is utilized in “TA” cloning directly.
Key words Polymerase chain reaction;DNA polymerase;“TA” cloning;DNA mutation
聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）起源于美国Cetus公司，是由Mullis和Saiki发明的一种用于体外快速扩增DNA的技术，也是分子生物学领域中最经典、最常用的一种实验方法，主要用于基因克隆和检测[1-3]。由于其过程简单、实验周期短、重复性好，因而成为现代分子生物学领域中最基本和最受欢迎的方法之一[4-5]。根据扩增所使用的DNA聚合酶不同，可将PCR分成普通PCR和高保真PCR。常用的Taq DNA聚合酶是一种从嗜热细菌Thermus aquaticus中分离的DNA聚合酶，其特点是可以耐受高温而不变性[6-7]。它扩增出来的PCR产物的3′末端带有突出的“A”，但其内部常常含突变位点。高保真DNA聚合酶来源各有差异，如Vent来源于Thermococcus litoralis，pfu来源于Pyrococcus furisus，或由这2种酶的基因突变和改造而来[8-9]。它扩增出来的PCR产物具有较高的保真性，但其3′末端为平末端，不能直接进行“TA”克隆，需要对产物 3′端额外加“A”后才能进行“TA”克隆。此外，也有公司推出了平末端克隆技术，但其克隆效率不理想，大大限制了其利用和推广。 目前在保证PCR产物具有较高保真性的同时还能直接进行“TA”克隆的方法鲜见报道。该研究在前人的技术基础上，利用高保真DNA聚合酶的高保真性和Taq DNA聚合酶的加“A”特性，通过联合使用来有效解决这一问题。
1 材料与方法
1.1 材料 RPMI-1640细胞培养液来源于GIBCO公司（美国），新生牛血清来源于杭州四季青（中国），人肝癌细胞SMMC-7721来源于中国科学院上海细胞库（中国），Trizol来源于Invitrogen公司（美国），反转录试剂盒、DNA A-Tailing Kit、Z-TaqTM DNA聚合酶、LA TaqDNA 聚合酶、PrimeSTAR GXL DNA聚合酶、TA克隆试剂盒（pMD18-T vector）、DNA凝胶回收试剂盒、Xho Ⅰ和BamH Ⅰ来源于大连宝生物公司（中国）。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养。用含10%新生牛血清的RPMI-1640细胞培养基在37 ℃、5% CO2培养箱中培养SMMC-7721细胞，待细胞长到80%时备用。
1.2.2 引物设计和测序。基因PKCε （NM_005400） PCR引物和DNA测序委托广州Invitrogen公司完成。PKCε上游引物序列為5′-TCTCGAGCGACCATGGTAGTGTTCAATGGCCTTC-3′，下游引物序列为5′-TGGATCCCAGGGCATCAGGTCTTCACCAAAGTAG-3′。
1.2.3 Trizol法抽提肝癌细胞总RNA。当SMMC-7721细胞在6 cm的培养皿中生长融合至80%时，用无菌PBS清洗培养皿中的细胞3次。然后加入1 mL Trizol，反复吹打直至细胞全部裂解。将裂解后的液体转移到RNase-free的1.5 mL离心管中，加入200 μL氯仿，剧烈振荡15 s，4 ℃、10 000 r/min离心10 min。将水相溶液转移入新的RNase-free的1.5 mL离心管中，并加入500 μL异丙醇，倒置混匀后7 500 r/min离心5 min，弃去上清液。白色沉淀用DEPC处理过的75%乙醇清洗2次，每次7 500 r/min离心5 min。室温自然干燥3 min，用100 μL RNase-free ddH2O溶解沉淀，即为RNA溶液，浓度定量至1 mg/mL，-80 ℃冻存。
1.2.4 RT-PCR与PCR。取2 μg RNA，按反转录试剂盒PrimeScriptTM Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit 说明书操作，将mRNA反转录成cDNA。用不同特性的Taq DNA聚合酶按表1配制PCR反应液，并按程序进行PCR扩增。其中，LA TaqDNA聚合酶的特性是长链DNA扩增、产物3′末端有突出“A”、高保真性低;PrimeSTAR GXL DNA聚合酶的特性是长链DNA扩增、产物3′末端为平末端、高保真性强;Z-TaqTM DNA 聚合酶的特性是短链DNA扩增、产物3′末端有突出“A”、高保真性低。
1.2.5 “TA”克隆。将上述3管PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶回收试剂盒回收DNA，并用无菌水定容至0.4 mg/mL。反应1、反应2、反应3的纯化产物分别标记为Tube 1、Tube 2、Tube 3。取一部分Tube 3纯化的DNA产物，按DNA A-Tailing Kit说明书对DNA进行加“A”，并将产物标记为Tube 4。对Tube 1、Tube 2、Tube 3、Tube 4中的DNA进行“TA”克隆，其中反应液配制如下：各取上述纯化产物0.4 μg，并各自加入pM18-T vector 1 μL，用ddH2O将体积补足至5 μL，再各自加入solution I 5 μL，4 ℃反应过夜。
1.2.6 细菌转化和鉴定。取100 μL感受态细菌置于冰浴中，将连接产物加入到感受态细菌中，冰浴30 min、42 ℃热激60 s、冰浴2 min、加入900 μL LB细菌培养基，37 ℃复苏1 h，取200 μL菌液涂布于Amp+ LB固体培养基中，37 ℃培养过夜。挑取克隆菌落扩大培养，质粒提取后用限制性核酸内切酶 （Xho Ⅰ/BamH Ⅰ） 酶切鉴定，并进行DNA测序鉴定。
2 结果与分析
2.1 双酶联用PCR可扩增出PKCε的编码区DNA片段
用LA Taq DNA聚合酶、双酶（PrimeSTARG×L/Z-TaqTM DNA聚合酶）、PrimeSTARG×L DNA聚合酶分别作为PCR反应的DNA聚合酶，琼脂糖凝胶电泳结果显示均可以扩增出靶基因PKCε的编码区DNA片段，其分子量约为2.2 kb，与理论长度一致（图1）。
2.2 双酶联用PCR产物可直接进行TA克隆
将纯化的3管PCR产物和用高保真PCR扩增并加“A”的产物分别进行“TA”克隆，其结果如图2所示。由于PrimeSTARG×L DNA聚合酶是一种高保真DNA聚合酶，其DNA产物的3′末端是平末端，所以TA克隆不能成功（图2C）;当用加“A”试剂盒对其产物3′末端加“A”后，其TA克隆成功（图2D）。另外，用LA TaqDNA聚合酶、双酶联用（PrimeSTARG×L/ Z-Taq DNA聚合酶）扩增产生的PCR产物均可以直接进行TA克隆（图2A和2B），说明双酶联用PCR扩增出的DNA产物的3′末端有突出“A”，可直接进行“TA”克隆。
2.3 双酶联用PCR扩增的产物具有高保真性
不同来源的单克隆菌落经扩大培养、质粒抽提和Xho Ⅰ酶切鉴定后， 发现T载体中所含有的靶序列长度均一致（图3）。对这些质粒进行DNA测序，测序结果显示用LA Taq DNA聚合酶扩增的2.2 kb的DNA产物中存在多处点突变和缺失突变，其中一株克隆菌落中的靶DNA有6处点突变;而用PrimeSTAR G×L DNA聚合酶和双酶联用扩增的PCR产物具有高度保真性，无基因突变。说明双酶联用可以保证PCR扩增产物的高保真性。 3 讨论
PCR技术自出现以来，就受到生物学界和医学界的高度关注，在短短的数年时间里，PCR技术经历了高速发展。到目前为止，PCR技术已经成为生物医学领域最重要的技术手段之一。根据PCR的作用可将其分为检测型PCR和基因克隆型PCR两大类别。检测型PCR根据其实验目的差异， 可延伸出不同的PCR，如对目的DNA进行定量分析的荧光定量PCR[10]、制备探针用的不对称PCR[11]、检测基因突变的单链构型多态性PCR和低严格单链特异性引物PCR[12-13]、分析基因表达差异的随机引物扩增PCR[14]、用于肿瘤亚类分型的低温PCR[15]、检测流行性传染病的免疫PCR等[16]，这些特殊PCR在当今生物、医学界发挥重要的作用。另一方面，PCR主要用于体外高效扩增靶基因或目的DNA，是当今科研工作者获取靶DNA的主要方法之一。这种技术主要依赖于高品质的Taq DNA聚合酶，即酶的属性决定扩增产物的品质。目前，不同商业公司已针对客户不同的需求开发了多种不同特性的DNA聚合酶，这些酶在靶基因获得上起着重要的作用。
根据PCR反应中DNA聚合酶属性差异，其可分为普通型和高保真型两大类。普通型Taq DNA 聚合酶扩增的PCR产物的3 ′末端有一個突出的“A”，它可以与市面上的“TA”克隆载体直接通过A-T配对而形成环形质粒，用于高效的“TA”克隆。但是，由于这种酶的高保真性较低，在基因克隆时会随机引入各种突变，使获得的目的DNA往往与模板之间有一定的差异，这对基因功能研究带来了诸多不便。高保真DNA 聚合酶就很好地解决了这一难题，利用其较强的外切酶活性，能够最大限度地维持PCR产物的高保真性。这一特性受到广大科研工作者的喜爱。但是，其自身也有不可回避的难题，即由于其PCR产物高度保真、产物3′末端无突出的“A”，不能直接进行“TA”克隆。
在该研究中，首先利用高保真Taq DNA 聚合酶扩增目的片段，保证PCR产物的高保真性，然后在PCR反应的最后3个循环中直接加入普通Taq DNA 聚合酶，利用其3′末端加“A”特性获得既有高度保真性又能在产物3′末端加“A”的PCR产物，实现高保真PCR产物的直接“TA”克隆。此方法简单方便，可直接跳过高保真PCR产物需要额外加“A”的步骤，实现快速“TA”克隆的目的，具有一定的应用前景。
参考文献
[1]WATERS D L E，SHAPTER F M.The polymerase chain reaction （PCR）：General methods[J].Methods Mol Biol，2014，1099：65-75.
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关键词 聚合酶链式反应;DNA聚合酶;“TA”克隆;DNA突变
中图分类号 Q78 文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2020）05-0109-03
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.05.030
開放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Abstract [Objective]To introduce a highfidelity PCR method with its product used in “TA” cloning directly，which could simplify the “TA” cloning step.[Method]Total RNAs were extracted from human hepatocellular carcinoma cell line SMMC7721 by Trizol reagent，and the mRNAs were reverse transcribed into cDNAs.Employing cDNAs as the templates，the cDNA region that codes protein of PKC was amplified by different types of DNA polymerases.The PCR products were subjected to a series of processes such as “TA” cloning，bacterial transformation，screening culture，plasmid extraction，restriction enzyme digestion and DNA sequencing.[Result]No DNA mutation was found in the product of PCR amplification with high fidelity DNA polymerase，but the product could not be linked directly to T vector.On the other hand，the product of PCR amplification with Taq DNA polymerase could be cloned into T vector directly，but it possessed multiple DNA point mutations and its fault was low fidelity.The product of PCR amplification with an alliance of high fidelity DNA polymerase and Taq DNA polymerase could be directly inserted into T vector without any point mutation.[Conclusion]Combined utilization of high fidelity DNA polymerase and Taq DNA polymerase in PCR can obtain high fidelity PCR product which is utilized in “TA” cloning directly.
Key words Polymerase chain reaction;DNA polymerase;“TA” cloning;DNA mutation
聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）起源于美国Cetus公司，是由Mullis和Saiki发明的一种用于体外快速扩增DNA的技术，也是分子生物学领域中最经典、最常用的一种实验方法，主要用于基因克隆和检测[1-3]。由于其过程简单、实验周期短、重复性好，因而成为现代分子生物学领域中最基本和最受欢迎的方法之一[4-5]。根据扩增所使用的DNA聚合酶不同，可将PCR分成普通PCR和高保真PCR。常用的Taq DNA聚合酶是一种从嗜热细菌Thermus aquaticus中分离的DNA聚合酶，其特点是可以耐受高温而不变性[6-7]。它扩增出来的PCR产物的3′末端带有突出的“A”，但其内部常常含突变位点。高保真DNA聚合酶来源各有差异，如Vent来源于Thermococcus litoralis，pfu来源于Pyrococcus furisus，或由这2种酶的基因突变和改造而来[8-9]。它扩增出来的PCR产物具有较高的保真性，但其3′末端为平末端，不能直接进行“TA”克隆，需要对产物 3′端额外加“A”后才能进行“TA”克隆。此外，也有公司推出了平末端克隆技术，但其克隆效率不理想，大大限制了其利用和推广。 目前在保证PCR产物具有较高保真性的同时还能直接进行“TA”克隆的方法鲜见报道。该研究在前人的技术基础上，利用高保真DNA聚合酶的高保真性和Taq DNA聚合酶的加“A”特性，通过联合使用来有效解决这一问题。
1 材料与方法
1.1 材料 RPMI-1640细胞培养液来源于GIBCO公司（美国），新生牛血清来源于杭州四季青（中国），人肝癌细胞SMMC-7721来源于中国科学院上海细胞库（中国），Trizol来源于Invitrogen公司（美国），反转录试剂盒、DNA A-Tailing Kit、Z-TaqTM DNA聚合酶、LA TaqDNA 聚合酶、PrimeSTAR GXL DNA聚合酶、TA克隆试剂盒（pMD18-T vector）、DNA凝胶回收试剂盒、Xho Ⅰ和BamH Ⅰ来源于大连宝生物公司（中国）。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养。用含10%新生牛血清的RPMI-1640细胞培养基在37 ℃、5% CO2培养箱中培养SMMC-7721细胞，待细胞长到80%时备用。
1.2.2 引物设计和测序。基因PKCε （NM_005400） PCR引物和DNA测序委托广州Invitrogen公司完成。PKCε上游引物序列為5′-TCTCGAGCGACCATGGTAGTGTTCAATGGCCTTC-3′，下游引物序列为5′-TGGATCCCAGGGCATCAGGTCTTCACCAAAGTAG-3′。
1.2.3 Trizol法抽提肝癌细胞总RNA。当SMMC-7721细胞在6 cm的培养皿中生长融合至80%时，用无菌PBS清洗培养皿中的细胞3次。然后加入1 mL Trizol，反复吹打直至细胞全部裂解。将裂解后的液体转移到RNase-free的1.5 mL离心管中，加入200 μL氯仿，剧烈振荡15 s，4 ℃、10 000 r/min离心10 min。将水相溶液转移入新的RNase-free的1.5 mL离心管中，并加入500 μL异丙醇，倒置混匀后7 500 r/min离心5 min，弃去上清液。白色沉淀用DEPC处理过的75%乙醇清洗2次，每次7 500 r/min离心5 min。室温自然干燥3 min，用100 μL RNase-free ddH2O溶解沉淀，即为RNA溶液，浓度定量至1 mg/mL，-80 ℃冻存。
1.2.4 RT-PCR与PCR。取2 μg RNA，按反转录试剂盒PrimeScriptTM Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit 说明书操作，将mRNA反转录成cDNA。用不同特性的Taq DNA聚合酶按表1配制PCR反应液，并按程序进行PCR扩增。其中，LA TaqDNA聚合酶的特性是长链DNA扩增、产物3′末端有突出“A”、高保真性低;PrimeSTAR GXL DNA聚合酶的特性是长链DNA扩增、产物3′末端为平末端、高保真性强;Z-TaqTM DNA 聚合酶的特性是短链DNA扩增、产物3′末端有突出“A”、高保真性低。
1.2.5 “TA”克隆。将上述3管PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶回收试剂盒回收DNA，并用无菌水定容至0.4 mg/mL。反应1、反应2、反应3的纯化产物分别标记为Tube 1、Tube 2、Tube 3。取一部分Tube 3纯化的DNA产物，按DNA A-Tailing Kit说明书对DNA进行加“A”，并将产物标记为Tube 4。对Tube 1、Tube 2、Tube 3、Tube 4中的DNA进行“TA”克隆，其中反应液配制如下：各取上述纯化产物0.4 μg，并各自加入pM18-T vector 1 μL，用ddH2O将体积补足至5 μL，再各自加入solution I 5 μL，4 ℃反应过夜。
1.2.6 细菌转化和鉴定。取100 μL感受态细菌置于冰浴中，将连接产物加入到感受态细菌中，冰浴30 min、42 ℃热激60 s、冰浴2 min、加入900 μL LB细菌培养基，37 ℃复苏1 h，取200 μL菌液涂布于Amp+ LB固体培养基中，37 ℃培养过夜。挑取克隆菌落扩大培养，质粒提取后用限制性核酸内切酶 （Xho Ⅰ/BamH Ⅰ） 酶切鉴定，并进行DNA测序鉴定。
2 结果与分析
2.1 双酶联用PCR可扩增出PKCε的编码区DNA片段
用LA Taq DNA聚合酶、双酶（PrimeSTARG×L/Z-TaqTM DNA聚合酶）、PrimeSTARG×L DNA聚合酶分别作为PCR反应的DNA聚合酶，琼脂糖凝胶电泳结果显示均可以扩增出靶基因PKCε的编码区DNA片段，其分子量约为2.2 kb，与理论长度一致（图1）。
2.2 双酶联用PCR产物可直接进行TA克隆
将纯化的3管PCR产物和用高保真PCR扩增并加“A”的产物分别进行“TA”克隆，其结果如图2所示。由于PrimeSTARG×L DNA聚合酶是一种高保真DNA聚合酶，其DNA产物的3′末端是平末端，所以TA克隆不能成功（图2C）;当用加“A”试剂盒对其产物3′末端加“A”后，其TA克隆成功（图2D）。另外，用LA TaqDNA聚合酶、双酶联用（PrimeSTARG×L/ Z-Taq DNA聚合酶）扩增产生的PCR产物均可以直接进行TA克隆（图2A和2B），说明双酶联用PCR扩增出的DNA产物的3′末端有突出“A”，可直接进行“TA”克隆。
2.3 双酶联用PCR扩增的产物具有高保真性
不同来源的单克隆菌落经扩大培养、质粒抽提和Xho Ⅰ酶切鉴定后， 发现T载体中所含有的靶序列长度均一致（图3）。对这些质粒进行DNA测序，测序结果显示用LA Taq DNA聚合酶扩增的2.2 kb的DNA产物中存在多处点突变和缺失突变，其中一株克隆菌落中的靶DNA有6处点突变;而用PrimeSTAR G×L DNA聚合酶和双酶联用扩增的PCR产物具有高度保真性，无基因突变。说明双酶联用可以保证PCR扩增产物的高保真性。 3 讨论
PCR技术自出现以来，就受到生物学界和医学界的高度关注，在短短的数年时间里，PCR技术经历了高速发展。到目前为止，PCR技术已经成为生物医学领域最重要的技术手段之一。根据PCR的作用可将其分为检测型PCR和基因克隆型PCR两大类别。检测型PCR根据其实验目的差异， 可延伸出不同的PCR，如对目的DNA进行定量分析的荧光定量PCR[10]、制备探针用的不对称PCR[11]、检测基因突变的单链构型多态性PCR和低严格单链特异性引物PCR[12-13]、分析基因表达差异的随机引物扩增PCR[14]、用于肿瘤亚类分型的低温PCR[15]、检测流行性传染病的免疫PCR等[16]，这些特殊PCR在当今生物、医学界发挥重要的作用。另一方面，PCR主要用于体外高效扩增靶基因或目的DNA，是当今科研工作者获取靶DNA的主要方法之一。这种技术主要依赖于高品质的Taq DNA聚合酶，即酶的属性决定扩增产物的品质。目前，不同商业公司已针对客户不同的需求开发了多种不同特性的DNA聚合酶，这些酶在靶基因获得上起着重要的作用。
根据PCR反应中DNA聚合酶属性差异，其可分为普通型和高保真型两大类。普通型Taq DNA 聚合酶扩增的PCR产物的3 ′末端有一個突出的“A”，它可以与市面上的“TA”克隆载体直接通过A-T配对而形成环形质粒，用于高效的“TA”克隆。但是，由于这种酶的高保真性较低，在基因克隆时会随机引入各种突变，使获得的目的DNA往往与模板之间有一定的差异，这对基因功能研究带来了诸多不便。高保真DNA 聚合酶就很好地解决了这一难题，利用其较强的外切酶活性，能够最大限度地维持PCR产物的高保真性。这一特性受到广大科研工作者的喜爱。但是，其自身也有不可回避的难题，即由于其PCR产物高度保真、产物3′末端无突出的“A”，不能直接进行“TA”克隆。
在该研究中，首先利用高保真Taq DNA 聚合酶扩增目的片段，保证PCR产物的高保真性，然后在PCR反应的最后3个循环中直接加入普通Taq DNA 聚合酶，利用其3′末端加“A”特性获得既有高度保真性又能在产物3′末端加“A”的PCR产物，实现高保真PCR产物的直接“TA”克隆。此方法简单方便，可直接跳过高保真PCR产物需要额外加“A”的步骤，实现快速“TA”克隆的目的，具有一定的应用前景。
参考文献
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