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摘要：目的建立高效液相色谱法测定滇柴胡中柴胡皂苷d的含量。方法采用Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（250mm×4.6mm，5um），流动相为乙腈-水梯度洗脱，流速：1.0mL·min-1，DAD检测器，检测波长：203nm。结果线性范围0.316μg/mL～3.160μg /mL，r=0.9995；平均回收率为98.7%，RSD=0.42%（n=6）。结论该法快速、准确、可靠；可作为滇柴胡中柴胡皂苷d含量的检测，为药材的用量及控制提供科学依据。
关键词：高效液相色谱法；滇柴胡；柴胡皂苷d；含量
中图分类号：R284文献标志码：A文章编号：1007-2349（2014）08-0067-02
滇柴胡《中国药典》未收载，收载于云南省中药饮片标准第一册[1]。为伞形科植物竹叶柴胡（Bupleurum marginatum Wall.ex DC.）、马尾柴胡（Bupleurum microcephalum Diels.）、小柴胡（Bupleurum tenue Buch.-Ham.ex D.Don）的干燥全草。夏、秋二季花初开时采收，除去泥沙，干燥[1]。本品长50～100cm。根圆锥形或圆柱形，微有分支，直伸或稍弯曲，外表棕褐色或黄棕色，具细纵皱纹及稀疏小横突起。茎单生或丛生，分支，圆柱形微具纵棱，基部常列存叶柄纤维，断面实心，白色。叶易破损，脱落，完整叶展平后呈针形、线状披针形或线形，长10 cm～16 cm，宽0.8 cm～1.4 cm，顶端具有硬尖头，基部半抱茎，叶缘软骨质，具5～9脉；有基生叶基部下延呈长柄状。花序复伞形，伞幅3～9；小总苞披针形或线状披针形；花黄色。幼果棕色。体轻，质稍脆。气清香，味微苦[2]。主要产于云南大部地区。为考察云南滇柴胡情况，故此次试验建立高效液相色谱法紫外检测器测定滇柴胡中柴胡皂苷d的含量，可作为滇柴胡中柴胡皂苷d含量的检测，为药材的用量及控制提供科学依据。
1仪器和试药
Agilent1200高效液相色谱仪，带四元泵；DAD检测器；自动进样器；在线真空脱气机；智能化柱温箱及HP化学工作站；乙腈为HPLC级，水为超纯水。柴胡皂苷d对照品（中国食品药品检定院提供；含量测定；批号：110778-201205）。此次共集到云南不同产地的滇柴胡样品11批，分别来自大理、丽江、保山市及临沧地区，批号略。
2色谱条件
色谱柱： Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（250mm×4.6mm 5um），流速：1.0mL·min-1，DAD检测器，检测波长：203nm。流动相：以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱。理论板数按柴胡皂苷d峰计算应不低于10000。[3]
时间（min）A%B%0～5025→7575→2550～6075→2525→753溶液的配制
3.1对照品溶液的配制精密称取柴胡皂苷d对照品（中国食品药品检定院提供；含量测定；批号：110778-201205）适量，加无水乙醇制成每1 mL含柴胡皂苷d 0.3 mg的溶液，即得。
3.2供试品溶液的配制取本品粉末（过四号筛）约0.8 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入含5%浓氨试液的甲醇40 mL，密塞，超声处理40 min，过滤，用甲醇60 mL分3次洗涤容器及药渣，洗液与滤液合并，回收溶剂至干。残渣加无水乙醇溶解，转移至10 mL量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
3.3阴性样品溶液的配制取溶剂无水乙醇，作为阴性样品溶液。
4方法与结果
4.1系统适用性分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，测定峰面积，即得。在此色谱条件下，柴胡皂苷d色谱峰理论塔板数应不低于10000，且阴性样品溶液无干扰。
A. 对照品B. 样品C.阴性样品4.2线性关系精密称取柴胡皂苷d对照品适量，置量瓶中，用无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，再以无水乙醇稀释至一系列浓度的对照品溶液，按上述色谱条件分别进样10 uL，记录色谱图，以峰面积（Y）对进样浓度（X）作回归统计，得回归方程为Y = 1.5413 X+3.1012，r= 0.9995（n=6），线性范围为0.316μg～3.160μg。
4.3精密度试验取“3.1”项下的对照品溶液，按上述色谱条件，连续进样6次，测得RSD为0.45%。表明仪器精密度良好。
4.4稳定性试验取同一供试品溶液，分别于0，2，4，8，12，24 h进样测定并按峰面积计算。测得RSD为1.63%。表明供试品溶液在制备后24 h内基本稳定。
4.5重复性试验取同一批样品，平行制备6份供试品溶液，按上述色谱条件测定并计算。测得RSD为1.54%。表明方法的重现性良好。
4.6加样回收率试验称取已知含量（按干燥品计）的同一批样品粉末（过四号筛）约0.4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，共6份，分别精密加入对照品溶液1 mL（对照品溶液浓度：0.309mg·mL-1），再加入含5%浓氨试液的甲醇40 mL，密塞，超声处理40 min，过滤，用甲醇60 mL分3次洗涤容器及药渣，洗液与滤液合并，回收溶剂至干。残渣加无水乙醇溶解，转移至10 mL量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得，并依法测定，。
5讨论
5.1色谱柱的选择选择Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（250mm×4.6mm 5um）为色谱柱，其键合相能与柴胡皂苷d选择性作用，达到分离检测的结果，同时选择乙腈-水（25：75）为流动相进行梯度洗脱，使柴胡皂苷d得到较好的分离及较高的理论塔板数。
5.2提取溶剂的选择根据柴胡皂苷d易溶于有机相甲醇、乙醇、无水乙醇。考察了不同浓度的甲醇、乙醇和无水乙醇为溶剂的提取结果，结果表明无水乙醇中柴胡皂苷d提取率最高。故选择无水乙醇作为提取溶剂。
5.3样品提取方法和超声时间的选择本次试验分别考察了以无水乙醇为溶剂的两种提取方法，分别为加热回流法，超声法。这两种提取方法中柴胡皂苷d的含量无显著性差别。考虑到超聲法与加热回流法相比，超声法更简单，易行，快捷，故采用超声法。此外，本次试验对超声时间进行了考察，依次测定了超声提取10、20、130、40以及60 min柴胡皂苷d含量测定的结果。结果表明采用无水乙醇为溶剂，超声提取40 min时，柴胡皂苷d成分已经提取完全。
5.4检测器的选择试验采用紫外可见分光光度计对柴胡皂苷d的无水乙醇溶液于190 nm～400 nm波长范围内进行扫描，结果203 nm波长处有最大吸收，属末端吸收化合物，故此次试验选取吸收波长203 nm为样品检测波长。
5.5《中国药典》柴胡中未收载滇柴胡，并对柴胡进行了柴胡皂苷a和柴胡皂苷d含量总和的控制[3]。此次试验，同时对滇柴胡也进行了柴胡皂苷a的测定，试验结果表明滇柴胡中基本不含柴胡皂苷a，故没有进行含量控制，而柴胡皂苷d的含量跟药典柴胡基本相当。通过对11批不同地区滇柴胡的检测，建立了高效液相色谱法测定滇柴胡中柴胡皂苷d的含量，可作为滇柴胡中柴胡皂苷d含量的检测，为药材的用量及控制提供科学依据。
参考文献：
[1] 云南省食品药品监督管理局.云南省中药饮片标准[M].第一册.昆明：云南美术出版社，2005：249～250.
[2]云南省卫生厅.云南省药品标准[M].昆明：云南大学出版社，1996：47～48.
[3] ChP（中国药典）2010.Vol Ⅰ（一部）：263～264.
（收稿日期：2014-06-10）
关键词：高效液相色谱法；滇柴胡；柴胡皂苷d；含量
中图分类号：R284文献标志码：A文章编号：1007-2349（2014）08-0067-02
滇柴胡《中国药典》未收载，收载于云南省中药饮片标准第一册[1]。为伞形科植物竹叶柴胡（Bupleurum marginatum Wall.ex DC.）、马尾柴胡（Bupleurum microcephalum Diels.）、小柴胡（Bupleurum tenue Buch.-Ham.ex D.Don）的干燥全草。夏、秋二季花初开时采收，除去泥沙，干燥[1]。本品长50～100cm。根圆锥形或圆柱形，微有分支，直伸或稍弯曲，外表棕褐色或黄棕色，具细纵皱纹及稀疏小横突起。茎单生或丛生，分支，圆柱形微具纵棱，基部常列存叶柄纤维，断面实心，白色。叶易破损，脱落，完整叶展平后呈针形、线状披针形或线形，长10 cm～16 cm，宽0.8 cm～1.4 cm，顶端具有硬尖头，基部半抱茎，叶缘软骨质，具5～9脉；有基生叶基部下延呈长柄状。花序复伞形，伞幅3～9；小总苞披针形或线状披针形；花黄色。幼果棕色。体轻，质稍脆。气清香，味微苦[2]。主要产于云南大部地区。为考察云南滇柴胡情况，故此次试验建立高效液相色谱法紫外检测器测定滇柴胡中柴胡皂苷d的含量，可作为滇柴胡中柴胡皂苷d含量的检测，为药材的用量及控制提供科学依据。
1仪器和试药
Agilent1200高效液相色谱仪，带四元泵；DAD检测器；自动进样器；在线真空脱气机；智能化柱温箱及HP化学工作站；乙腈为HPLC级，水为超纯水。柴胡皂苷d对照品（中国食品药品检定院提供；含量测定；批号：110778-201205）。此次共集到云南不同产地的滇柴胡样品11批，分别来自大理、丽江、保山市及临沧地区，批号略。
2色谱条件
色谱柱： Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（250mm×4.6mm 5um），流速：1.0mL·min-1，DAD检测器，检测波长：203nm。流动相：以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱。理论板数按柴胡皂苷d峰计算应不低于10000。[3]
时间（min）A%B%0～5025→7575→2550～6075→2525→753溶液的配制
3.1对照品溶液的配制精密称取柴胡皂苷d对照品（中国食品药品检定院提供；含量测定；批号：110778-201205）适量，加无水乙醇制成每1 mL含柴胡皂苷d 0.3 mg的溶液，即得。
3.2供试品溶液的配制取本品粉末（过四号筛）约0.8 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入含5%浓氨试液的甲醇40 mL，密塞，超声处理40 min，过滤，用甲醇60 mL分3次洗涤容器及药渣，洗液与滤液合并，回收溶剂至干。残渣加无水乙醇溶解，转移至10 mL量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
3.3阴性样品溶液的配制取溶剂无水乙醇，作为阴性样品溶液。
4方法与结果
4.1系统适用性分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，测定峰面积，即得。在此色谱条件下，柴胡皂苷d色谱峰理论塔板数应不低于10000，且阴性样品溶液无干扰。
A. 对照品B. 样品C.阴性样品4.2线性关系精密称取柴胡皂苷d对照品适量，置量瓶中，用无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，再以无水乙醇稀释至一系列浓度的对照品溶液，按上述色谱条件分别进样10 uL，记录色谱图，以峰面积（Y）对进样浓度（X）作回归统计，得回归方程为Y = 1.5413 X+3.1012，r= 0.9995（n=6），线性范围为0.316μg～3.160μg。
4.3精密度试验取“3.1”项下的对照品溶液，按上述色谱条件，连续进样6次，测得RSD为0.45%。表明仪器精密度良好。
4.4稳定性试验取同一供试品溶液，分别于0，2，4，8，12，24 h进样测定并按峰面积计算。测得RSD为1.63%。表明供试品溶液在制备后24 h内基本稳定。
4.5重复性试验取同一批样品，平行制备6份供试品溶液，按上述色谱条件测定并计算。测得RSD为1.54%。表明方法的重现性良好。
4.6加样回收率试验称取已知含量（按干燥品计）的同一批样品粉末（过四号筛）约0.4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，共6份，分别精密加入对照品溶液1 mL（对照品溶液浓度：0.309mg·mL-1），再加入含5%浓氨试液的甲醇40 mL，密塞，超声处理40 min，过滤，用甲醇60 mL分3次洗涤容器及药渣，洗液与滤液合并，回收溶剂至干。残渣加无水乙醇溶解，转移至10 mL量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得，并依法测定，。
5讨论
5.1色谱柱的选择选择Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（250mm×4.6mm 5um）为色谱柱，其键合相能与柴胡皂苷d选择性作用，达到分离检测的结果，同时选择乙腈-水（25：75）为流动相进行梯度洗脱，使柴胡皂苷d得到较好的分离及较高的理论塔板数。
5.2提取溶剂的选择根据柴胡皂苷d易溶于有机相甲醇、乙醇、无水乙醇。考察了不同浓度的甲醇、乙醇和无水乙醇为溶剂的提取结果，结果表明无水乙醇中柴胡皂苷d提取率最高。故选择无水乙醇作为提取溶剂。
5.3样品提取方法和超声时间的选择本次试验分别考察了以无水乙醇为溶剂的两种提取方法，分别为加热回流法，超声法。这两种提取方法中柴胡皂苷d的含量无显著性差别。考虑到超聲法与加热回流法相比，超声法更简单，易行，快捷，故采用超声法。此外，本次试验对超声时间进行了考察，依次测定了超声提取10、20、130、40以及60 min柴胡皂苷d含量测定的结果。结果表明采用无水乙醇为溶剂，超声提取40 min时，柴胡皂苷d成分已经提取完全。
5.4检测器的选择试验采用紫外可见分光光度计对柴胡皂苷d的无水乙醇溶液于190 nm～400 nm波长范围内进行扫描，结果203 nm波长处有最大吸收，属末端吸收化合物，故此次试验选取吸收波长203 nm为样品检测波长。
5.5《中国药典》柴胡中未收载滇柴胡，并对柴胡进行了柴胡皂苷a和柴胡皂苷d含量总和的控制[3]。此次试验，同时对滇柴胡也进行了柴胡皂苷a的测定，试验结果表明滇柴胡中基本不含柴胡皂苷a，故没有进行含量控制，而柴胡皂苷d的含量跟药典柴胡基本相当。通过对11批不同地区滇柴胡的检测，建立了高效液相色谱法测定滇柴胡中柴胡皂苷d的含量，可作为滇柴胡中柴胡皂苷d含量的检测，为药材的用量及控制提供科学依据。
参考文献：
[1] 云南省食品药品监督管理局.云南省中药饮片标准[M].第一册.昆明：云南美术出版社，2005：249～250.
[2]云南省卫生厅.云南省药品标准[M].昆明：云南大学出版社，1996：47～48.
[3] ChP（中国药典）2010.Vol Ⅰ（一部）：263～264.
（收稿日期：2014-06-10）