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摘要：隨着Ⅱ型糖尿病发病率的逐年升高，寻找安全且可长期使用的治疗手段已成为医学界研究的热点。已有的研究表明运动干预可明显改善胰岛素抵抗，但关于其具体的分子机制尚不清楚。证据表明SIRT1表达下降或活性改变可能与胰岛素抵抗相关性疾病的发病相关。通过研究，证实不同运动干预方案对SIRT1在Ⅱ型糖尿病大鼠肾脏中表达的影响，明确SIRT1在胰岛素抵抗中的作用。
关键词：有氧运动；Ⅱ型糖尿病；沉默信息调节因子
Ⅱ型糖尿病所引起的各种并发症，已经成为致死、致残并造成医疗费用增高的一个主要原因[1]。自上个世纪以来，适当合理的运动对糖尿病的预防和控制作用已得到了学术界和大众的认可。近年来，沉默信息调节因子1（SIRT1）的功能在改善胰岛素抵抗的作用中日益受到关注。越来越多的证据表明SIRT1 表达下降或其活性改变可能参与胰岛素抵抗相关性疾病的发生发展。SIRT1在线粒体生物发生、脂肪代谢、抗氧化等一系列与胰岛素抵抗产生相关的病理生理过程中起着至关重要的作用。运动在预防和控制胰岛素抵抗、Ⅱ型糖尿病（T2DM）以及与糖尿病相关的合并症中起重要作用[3]。本项目拟通过高糖高脂饮食和链脲佐菌素诱导建立T2DM模型，探讨T2DM大鼠肾脏SIRT1的表达和相关指标的变化。采用不同的运动强度对高脂饮食实验大鼠进行运动训练，研究合理的运动干预对T2DM大鼠肾脏SIRT1的表达的影响。
一、研究方法
（一）T2DM大鼠模型建立
造模组大鼠在高糖高脂饮食喂养4周后，左下腹腔注射STZ（30mg/kg，隔日1次，共2次）。健康对照组以普通饲料喂养4周后，注射等量柠檬酸缓冲液（30mg/kg，隔日1次，共2次）。注射药物后间隔7天血糖测试仪检测大鼠空腹血糖（测试前禁食12 h）即注射后血糖，以血糖含量16.7 mmol/L为Ⅱ型糖尿病大鼠模型判定标准。造模成功后继续以普通饲料喂养，并定期测试每组大鼠血糖指标。
（二）T2DM大鼠实验分组
造模成功的T2DM大鼠，随机分为高脂饮食组（HFD组）、高脂饮食后低强度运动组（HFD-LE组）、高脂饮食后中等强度运动组（HFD-ME组），高脂饮食后高强度运动组（HFD-HE组）。同时，普通饲料大鼠作为正常饮食健康对照组（H）。
（三）运动干预方案的实施
参照相关文献的大鼠游泳运动方法，采用无负重耐力游泳运动方案，游泳水温（30±2）℃，水深50cm，每只大鼠有200cm2的活动面积以保证其持续活动。高脂饮食后低强度运动组（HFD-LE组，10只）每天游泳30min，高脂饮食后中等强度运动组（HFD-ME组，10只）每天游泳60min，高脂饮食后高强度运动组（HFD-HE组，10只）每天游泳90min，每周游泳6d，共持续6周。
（四）血样及组织标本采集
实验结束各组大鼠禁食12h（自由饮水），用10%的水合氯醛腹腔麻醉大鼠，固定，解剖。心尖取血于抗凝管中，3000r/min离心15min，分离血浆后置于-70℃冰箱冷冻保存。迅速取出大鼠肾脏标本于冰袋上，剥离表面脂肪组织，置于-70℃冰箱保存，待作组织匀浆检测。
（五）指标测试
1.比色法定量检测SIRT1活性
50mg组织加入0.5mLPBS中匀浆并置于10mlL的EP管，随后加入1ml裂解液。强力涡旋震荡10s后置于冰槽里孵育15min，随后加入4ml预冷的分离液中混匀。放入4℃台式离心机离心1300RPM，10min。小心抽去上清液置于10 ml的EP管中并加入4mL预冷的清理液，然后放入4℃台式离心机离心1300 RPM，10min。小心抽去1mL上清液到新的预冷的1.5mL离心管。小心加入 100?L预冷的萃取液并混匀。加入10%Triton 10?L，使终浓度为1%，震荡 30s 至1min。置于冰槽里孵育30min后放入4℃台式离心机离心16000 RPM，10min。小心移取上清液到新的预冷的1.5ml离心管。移取10?L进行蛋白定量检测，其余用作活性测定。开启并设定好分光光度仪（温度为30℃）：波长405nm，并置零；轻轻摇动96孔酶标板30s，放进30℃培养箱里，孵育60min，避免光照。轻轻摇动96孔酶标板30s，放进30℃培养箱里，孵育30min，即刻放入酶标仪检测。
计算公式：SIRT1 活性（U/mg）=（样品读数-背景读数）×0.1（mL）× 样品稀释倍数/0.02（mL）/10.5（吸光系数）/1（反应时间）/0.6（光径距离：cm）；
2. real-time PCR检测组织中SIRT1 mRNA的表达
以Trizol液提取肾脏组织的总RNA，用逆转录试剂盒逆转录成cDNA。应用Primer5.0软件设计引物，SIRT1引物：正义链5?-AAACTTTTGCTGTAA CCCTG-3?，反义链5?-CAAGCCGCCTA CTAATCT-3?。以GAPDH作为内参照，其引物正义链5?-GCACCGTCAAGGCT GAGAAC-3?，反义链5?-ATGGTGGTG AAGACGCCAGT-3?。引物浓度为200nmol/L，反应体系25?L，反应试剂为SYBR Green PCR Master Mix。
3.Western blot检测组织中SIRT1蛋白的表达
收集待测组织，4℃离心5min，向沉淀中加入50?LRIPA裂解液，于冰水浴中裂解30min，4℃、12000r/min离心10min，取上清，BCA法测定蛋白浓度。行12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，电转至硝酸纤维素膜。以5%脱脂奶粉室温封闭1h，分别加入鼠抗SIRT1抗体（1：100）、鼠抗B-actin抗体（1：1000）4℃过夜。TBST（pH=7.5，含10mmol/L Tris-HCl、150mmol/L NaCl、0.1%Tween-20）漂洗4次，10 min/次。加入辣根过氧化物酶标记的羊抗大鼠二抗，37℃孵育1 h，TBST漂洗4次。电化学发光显影，采用美国UVP公司的GelDot-It300全自动化学发光凝胶成像系统进行分析。
（六）数理统计
采用SPSS23.0进行分析，计量资料以X±S，P<0.05表示有显著性差异。
二、研究结果
通过各实验组肾脏组织SIRT1活性的比较发现，与H组相比，HFD组SIRT1活性无显著变化（P>0.05），HFD-LE、HFD-ME和HFD-HE组SIRT1活性显著升高（P<0.05），但HFD-LE、HFD-ME和HFD-HE之间无显著性差异（P>0.05）。（见表1）
三、研究结论
该研究证实，不同运动干预方案对SIRT1在T2DM肾脏中表达的影响，确定SIRT1在胰岛素抵抗中的作用。有研究证实，运动的这种肾脏保护功能可能与其能够增加SIRT1的表达有关。运动干预可能通过增加SIRT1的表达，减少p38和p53的表达，从而改善糖尿病肾病氧化应激状态，保护肾功能。进一步提示增加SIRT1的表达可能有助于糖尿病。在脲链菌素诱导的糖尿病肾病大鼠模型中发现，运动干预能减少丙二醛的产生，增加超氧化物歧化酶和谷胱甘肽的水平，改善其氧化应激状态，同时亦能减轻蛋白尿，延缓肌酐清除率的下降，从而改善肾功能。[3]高脂饮食是诱导肥胖及Ⅱ型糖尿病的重要环境因素。糖尿病以血糖升高及代谢紊乱为其特征。糖尿病肾病目前已成为终末期肾脏病最主要的病因之一。研究表明SIRT1可能参与了糖尿病肾病的发生与发展。
参考文献：
[1]Pagel-Langenickel I，Bao J，Pang L，et al.The role of mitochondria in the pathophysiology of skeletal muscle insulin resistance[J].Endocr Rev，2010，31：25-51.
[2]张好好.SIRT1 在改善高脂饮食诱导的胰岛素抵抗模型中的作用及其机制研究[D].武汉：华中科技大学同济医学院，2012.
[3]赵军，李方晖，付强.沉默信息调节因子2相关酶1与运动[J].中国老年学杂志，2011，31：906-910.
（作者单位：李祖建 赣南医学院康复学院；李伟 福建师范大学体育科学学院 赣南医学院康复学院）
关键词：有氧运动；Ⅱ型糖尿病；沉默信息调节因子
Ⅱ型糖尿病所引起的各种并发症，已经成为致死、致残并造成医疗费用增高的一个主要原因[1]。自上个世纪以来，适当合理的运动对糖尿病的预防和控制作用已得到了学术界和大众的认可。近年来，沉默信息调节因子1（SIRT1）的功能在改善胰岛素抵抗的作用中日益受到关注。越来越多的证据表明SIRT1 表达下降或其活性改变可能参与胰岛素抵抗相关性疾病的发生发展。SIRT1在线粒体生物发生、脂肪代谢、抗氧化等一系列与胰岛素抵抗产生相关的病理生理过程中起着至关重要的作用。运动在预防和控制胰岛素抵抗、Ⅱ型糖尿病（T2DM）以及与糖尿病相关的合并症中起重要作用[3]。本项目拟通过高糖高脂饮食和链脲佐菌素诱导建立T2DM模型，探讨T2DM大鼠肾脏SIRT1的表达和相关指标的变化。采用不同的运动强度对高脂饮食实验大鼠进行运动训练，研究合理的运动干预对T2DM大鼠肾脏SIRT1的表达的影响。
一、研究方法
（一）T2DM大鼠模型建立
造模组大鼠在高糖高脂饮食喂养4周后，左下腹腔注射STZ（30mg/kg，隔日1次，共2次）。健康对照组以普通饲料喂养4周后，注射等量柠檬酸缓冲液（30mg/kg，隔日1次，共2次）。注射药物后间隔7天血糖测试仪检测大鼠空腹血糖（测试前禁食12 h）即注射后血糖，以血糖含量16.7 mmol/L为Ⅱ型糖尿病大鼠模型判定标准。造模成功后继续以普通饲料喂养，并定期测试每组大鼠血糖指标。
（二）T2DM大鼠实验分组
造模成功的T2DM大鼠，随机分为高脂饮食组（HFD组）、高脂饮食后低强度运动组（HFD-LE组）、高脂饮食后中等强度运动组（HFD-ME组），高脂饮食后高强度运动组（HFD-HE组）。同时，普通饲料大鼠作为正常饮食健康对照组（H）。
（三）运动干预方案的实施
参照相关文献的大鼠游泳运动方法，采用无负重耐力游泳运动方案，游泳水温（30±2）℃，水深50cm，每只大鼠有200cm2的活动面积以保证其持续活动。高脂饮食后低强度运动组（HFD-LE组，10只）每天游泳30min，高脂饮食后中等强度运动组（HFD-ME组，10只）每天游泳60min，高脂饮食后高强度运动组（HFD-HE组，10只）每天游泳90min，每周游泳6d，共持续6周。
（四）血样及组织标本采集
实验结束各组大鼠禁食12h（自由饮水），用10%的水合氯醛腹腔麻醉大鼠，固定，解剖。心尖取血于抗凝管中，3000r/min离心15min，分离血浆后置于-70℃冰箱冷冻保存。迅速取出大鼠肾脏标本于冰袋上，剥离表面脂肪组织，置于-70℃冰箱保存，待作组织匀浆检测。
（五）指标测试
1.比色法定量检测SIRT1活性
50mg组织加入0.5mLPBS中匀浆并置于10mlL的EP管，随后加入1ml裂解液。强力涡旋震荡10s后置于冰槽里孵育15min，随后加入4ml预冷的分离液中混匀。放入4℃台式离心机离心1300RPM，10min。小心抽去上清液置于10 ml的EP管中并加入4mL预冷的清理液，然后放入4℃台式离心机离心1300 RPM，10min。小心抽去1mL上清液到新的预冷的1.5mL离心管。小心加入 100?L预冷的萃取液并混匀。加入10%Triton 10?L，使终浓度为1%，震荡 30s 至1min。置于冰槽里孵育30min后放入4℃台式离心机离心16000 RPM，10min。小心移取上清液到新的预冷的1.5ml离心管。移取10?L进行蛋白定量检测，其余用作活性测定。开启并设定好分光光度仪（温度为30℃）：波长405nm，并置零；轻轻摇动96孔酶标板30s，放进30℃培养箱里，孵育60min，避免光照。轻轻摇动96孔酶标板30s，放进30℃培养箱里，孵育30min，即刻放入酶标仪检测。
计算公式：SIRT1 活性（U/mg）=（样品读数-背景读数）×0.1（mL）× 样品稀释倍数/0.02（mL）/10.5（吸光系数）/1（反应时间）/0.6（光径距离：cm）；
2. real-time PCR检测组织中SIRT1 mRNA的表达
以Trizol液提取肾脏组织的总RNA，用逆转录试剂盒逆转录成cDNA。应用Primer5.0软件设计引物，SIRT1引物：正义链5?-AAACTTTTGCTGTAA CCCTG-3?，反义链5?-CAAGCCGCCTA CTAATCT-3?。以GAPDH作为内参照，其引物正义链5?-GCACCGTCAAGGCT GAGAAC-3?，反义链5?-ATGGTGGTG AAGACGCCAGT-3?。引物浓度为200nmol/L，反应体系25?L，反应试剂为SYBR Green PCR Master Mix。
3.Western blot检测组织中SIRT1蛋白的表达
收集待测组织，4℃离心5min，向沉淀中加入50?LRIPA裂解液，于冰水浴中裂解30min，4℃、12000r/min离心10min，取上清，BCA法测定蛋白浓度。行12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，电转至硝酸纤维素膜。以5%脱脂奶粉室温封闭1h，分别加入鼠抗SIRT1抗体（1：100）、鼠抗B-actin抗体（1：1000）4℃过夜。TBST（pH=7.5，含10mmol/L Tris-HCl、150mmol/L NaCl、0.1%Tween-20）漂洗4次，10 min/次。加入辣根过氧化物酶标记的羊抗大鼠二抗，37℃孵育1 h，TBST漂洗4次。电化学发光显影，采用美国UVP公司的GelDot-It300全自动化学发光凝胶成像系统进行分析。
（六）数理统计
采用SPSS23.0进行分析，计量资料以X±S，P<0.05表示有显著性差异。
二、研究结果
通过各实验组肾脏组织SIRT1活性的比较发现，与H组相比，HFD组SIRT1活性无显著变化（P>0.05），HFD-LE、HFD-ME和HFD-HE组SIRT1活性显著升高（P<0.05），但HFD-LE、HFD-ME和HFD-HE之间无显著性差异（P>0.05）。（见表1）
三、研究结论
该研究证实，不同运动干预方案对SIRT1在T2DM肾脏中表达的影响，确定SIRT1在胰岛素抵抗中的作用。有研究证实，运动的这种肾脏保护功能可能与其能够增加SIRT1的表达有关。运动干预可能通过增加SIRT1的表达，减少p38和p53的表达，从而改善糖尿病肾病氧化应激状态，保护肾功能。进一步提示增加SIRT1的表达可能有助于糖尿病。在脲链菌素诱导的糖尿病肾病大鼠模型中发现，运动干预能减少丙二醛的产生，增加超氧化物歧化酶和谷胱甘肽的水平，改善其氧化应激状态，同时亦能减轻蛋白尿，延缓肌酐清除率的下降，从而改善肾功能。[3]高脂饮食是诱导肥胖及Ⅱ型糖尿病的重要环境因素。糖尿病以血糖升高及代谢紊乱为其特征。糖尿病肾病目前已成为终末期肾脏病最主要的病因之一。研究表明SIRT1可能参与了糖尿病肾病的发生与发展。
参考文献：
[1]Pagel-Langenickel I，Bao J，Pang L，et al.The role of mitochondria in the pathophysiology of skeletal muscle insulin resistance[J].Endocr Rev，2010，31：25-51.
[2]张好好.SIRT1 在改善高脂饮食诱导的胰岛素抵抗模型中的作用及其机制研究[D].武汉：华中科技大学同济医学院，2012.
[3]赵军，李方晖，付强.沉默信息调节因子2相关酶1与运动[J].中国老年学杂志，2011，31：906-910.
（作者单位：李祖建 赣南医学院康复学院；李伟 福建师范大学体育科学学院 赣南医学院康复学院）